使用紫外光固化树脂对合成生物相容性植入物进行冷冻切片以增强免疫荧光分析

摘要

本研究介绍了一种冷冻切片技术方案，该方案采用紫外光固化树脂稳定化方法，在保持植入物-组织界面完整性的同时保留抗原可及性，从而实现对合成聚合物植入物进行可靠且高分辨率的免疫荧光分析。

摘要

由于传统组织处理方法与这些材料的理化特性不相容，对合成性、生物相容性植入物进行组织学评估面临重大的技术挑战。目前采用完全树脂包埋的方法虽能提供足够的结构保存效果，但会严重损害表位的可及性，从而限制了用于表征宿主免疫反应所必需的免疫组织化学应用。相反，传统的石蜡包埋对合成基质的黏附性较差，并限制了抗体的选择，难以实现全面的免疫学分析。标准的冷冻切片方案通过改善抗原保存而提高了免疫组织化学的兼容性；然而，这些方法常导致含植入物样本的结构完整性不足，影响形态学评估和切片质量。为克服这些局限，本研究开发了一种新型处理方案，在冷冻切片前使用紫外光固化树脂对植入物-组织复合体进行选择性稳定。该方法采用光聚合树脂提供机械支撑，同时保留表位可及性和抗原决定簇——这些通常在完全树脂聚合过程中受到破坏。本方案能够稳定地制备出适用于免疫荧光分析的最佳厚度高质量切片，在结构保存方面优于标准冷冻切片，且避免了传统树脂包埋样本中因广泛交联而导致的抗体穿透受限问题。该方法为合成植入物的组织学处理提供了一种实用且成本效益高的解决方案，增强了生物相容性评估的分析能力，并有助于深入表征植入物-组织界面处的局部免疫反应。

引言

免疫荧光显微技术是再生医学研究中一项关键的分析方法，通过使用荧光素标记的抗体，可实现对组织结构和细胞组成的可视化观察。该方法结合了免疫化学识别的分子特异性与荧光检测的高灵敏度和多功能性，能够在组织微环境中详细观察特定细胞靶标的分布情况。免疫荧光技术包括直接和间接标记策略，其中间接免疫荧光方案利用与多种荧光素（覆盖可见光至近红外光谱范围）偶联的二抗系统，实现更强的信号放大¹。该方法通过光谱分离实现多靶标同时检测的固有优势，有助于对复杂组织微环境中的异质性细胞群体及其空间关系进行全面的表型表征²。

免疫荧光显微镜的技术能力已超越传统的蛋白质定位，拓展至多种定量分析应用，包括荧光强度测量、共定位分析以及对理解细胞功能和组织结构至关重要的空间分布评估³。在植入物生物相容性研究中，免疫荧光分析可提供关于宿主免疫反应的关键信息，包括异物反应、炎症级联反应以及决定植入物在细胞和分子水平上被接受或排斥的组织整合过程⁴。

成功实施免疫荧光实验方案需要仔细考虑组织处理方法，以在保持荧光信号并尽量减少背景自发荧光的同时，维持组织形态的完整性。传统包埋介质的选择取决于组织类型、后续分析需求以及特定目标抗原的性质。对于合成材料和植入物，现有文献主要推荐完全树脂包埋，以在切片过程中维持结构稳定性⁵。然而，该方法存在显著局限性，因其需要使用专门的超薄切片机和刀片来切割聚合后的树脂块，这需要较高的设备投入和技术经验。石蜡包埋虽然能为切片提供足够的结构支撑，但在固定和处理过程中，由于经历充分脱水、化学硬化以及有机溶剂渗透，可能导致抗原决定簇发生构象改变，从而引起蛋白质变性和表位遮蔽。此外，石蜡处理还会产生内在的自发荧光干扰，影响信号检测和定量分析。这些改变 necessitates 抗原修复步骤，通常采用热诱导表位修复（HIER）或蛋白水解诱导表位修复（PIER），以恢复抗体的可及性⁶。尽管采取了这些措施，仍有大量 commercially available 抗体无法与石蜡包埋样本兼容，且剧烈的修复条件可能进一步损害荧光信号质量，并引入光漂白伪影。

冷冻切片为免疫荧光应用提供了一种替代的组织处理方法。组织制备可采用两种冷冻保存方法。第一种方法是通过将新鲜组织样本直接浸入用液氮预冷的异戊烷浴中进行快速冷冻保存，使其温度降至–20 °C以下，随后使用配备温控切片室的冷冻切片机进行切片。第二种方案则先用多聚甲醛（PFA）或福尔马林进行短时间固定，再通过梯度蔗糖浸润实现冷冻保护，最后进行冷冻。冷冻保存过程可形成刚性基质，在维持组织完整性的同时，保留蛋白质的天然构象，这对于抗体识别至关重要。冷冻切片使组织保持在接近天然的状态，化学修饰极少⁷，从而减少了对剧烈抗原修复步骤的需求，并可使用更广泛的初级抗体，包括那些因表位遮蔽或变性而无法用于石蜡包埋组织的抗体⁸。

冷冻切片过程通常使用最佳切割温度（OCT）包埋剂，这是一种水溶性包埋介质，由聚乙烯醇和聚乙二醇组成，可在切片过程中提供结构支撑，同时保持透明性，并与荧光检测系统兼容。OCT包埋有助于生成厚度为5–15 µm的薄而均匀的切片，具体厚度取决于特定的分析需求和组织特性⁹。冷冻切片中天然蛋白质构象的保存可维持定量免疫荧光分析所必需的最佳信噪比，同时保留完整的抗原表位，从而允许使用更广泛的初级抗体，包括那些与石蜡包埋组织不兼容的抗体⁸。

然而，冷冻组织切片在处理具有与天然生物组织不同理化特性的合成植入材料时，面临着独特的技术挑战。在冷冻过程中，合成聚合物与生物组织界面之间的热膨胀系数差异可能导致局部机械应力，从而破坏结构完整性并产生切片伪影¹⁰。此外，许多合成材料相对于冷冻生物组织具有较高的固有刚性，这会在切片过程中引起刀片偏转，导致切片厚度不均，并对样本及切割设备造成损伤。这些技术局限性要求采用特殊的处理方案，在保持冷冻切片适用于免疫荧光应用优势的同时，满足含植入物样本的独特需求。

为解决这些局限性，本研究开发了一种冷冻切片技术，该技术结合了选择性紫外光固化树脂稳定化与可控的冷冻切片机切片参数，以实现对植入物-组织复合体进行高分辨率、多参数的免疫荧光分析。

方案

本研究严格按照梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行，批准编号为 A00003765-18-24。所有涉及合成生物相容性植入物的操作均在无菌条件下进行，并遵循适当的生物安全规程。

1. 样本处理与冷冻保护

注意：福尔马林含有甲醛，是一种强效刺激物、致敏剂和致癌物，因此必须在化学通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

1. 将组织整合的生物相容性合成植入物样本置于10%中性缓冲福尔马林中，在4°C下固定过夜，固定液体积至少为组织体积的10倍，以确保样本完全浸没并充分渗透。此有限固定时间的目的是在保持组织形态的同时实现最小程度的交联。（有关本方案所用材料，请参见材料表。）
2. 将样本转移至用磷酸盐缓冲液（PBS）配制的15%蔗糖溶液中，在4°C下轻轻振荡孵育过夜。通过观察组织沉降确认蔗糖完全渗透。
3. 将样本转移至PBS中的30%蔗糖溶液中，再次在4°C下孵育过夜。通过组织沉降至容器底部的现象确认达到充分平衡，表明蔗糖已充分渗透并完全置换出水分。
4. 按体积比1:1配制30%蔗糖溶液与OCT包埋剂的混合液。将样本在此过渡介质中于4°C孵育2小时，随后转移至100% OCT中孵育1小时，直至组织呈现均匀不透明外观，表明已完全平衡。
5. 将样本小心置于装有新鲜OCT包埋剂的标准冷冻模具中，确保切片平面的最佳取向。应使植入物-组织界面朝向便于后续操作的方向。使用预冷的镊子去除气泡。
6. 立即将装有样本的冷冻模具放置于干冰平台上，形成自下而上的温度梯度，促进快速冰晶形成。观察10–15分钟，直至OCT包埋剂呈现特征性的不透明白色，表明已完全凝固。将冷冻组织块转移至–80°C保存，或直接送入冷冻切片机进行即时切片。

2. 冷冻切片机的设置与初步切片

1. 将冷冻切片机的温控室温度维持在 –15°C。使用集成的数字监测系统确认温度，并在放入样本前过夜平衡。
2. 安装新的一次性刀片。根据制造商的说明，设置适用于合成-生物复合材料切片的刀片角度。
3. 通过控制面板选择厚度设置，使用箭头键调整，再按下设定键确认参数，将所需的切片厚度（50–100 µm）输入冷冻切片机。
4. 推进包埋样本至预定深度，以达到植入物-组织界面。观察连续切片的表面，识别适合紫外固化树脂应用的最佳平面，该平面的特征是组织透光性出现细微变化并初步暴露植入物边缘；当这些特征在连续修片过程中持续可见时，即可确认达到目标深度。
   注意：一旦到达关键界面，应立即停止切片，防止超出目标区域。

3. 紫外光固化树脂的应用

注意：操作紫外光固化树脂时，应在通风良好的环境中进行，并穿戴适当的个人防护装备；同时保护眼睛和皮肤免受LED紫外固化光源的伤害。此类树脂含有刺激性成分，可能引起皮肤和眼睛反应；暴露于LED紫外光可能导致紫外线相关的眼损伤。

1. 使用剪刀将Parafilm裁剪成比植入物周缘大2–3 mm的尺寸。用无菌镊子小心地从保护性纸衬上分离。
2. 在暴露的Parafilm表面滴加5–10 µL紫外光固化树脂（图1A）。通过初步测试优化树脂用量：逐步滴加不同体积，肉眼观察其扩散情况，确保样本表面被均匀覆盖，且无溢出或树脂过度积聚，以免影响切片。
3. 立即将保护性纸衬重新覆盖于载有树脂的Parafilm上。使用聚氨酯压边滚轮（2英寸），以均匀压力进行重叠、平行的滚压，随后进行垂直方向的滚压，以形成一层薄而均匀的树脂层（图1B）。
4. 小心移除保护性纸衬，露出均匀分布的树脂薄膜。将带有树脂的Parafilm直接覆盖在暴露的植入物表面，确保与植入物-组织界面精确对齐（图1C）。
5. 从植入物中心向外使用聚氨酯压边滚轮，以排除气泡，并确保树脂与合成材料及生物组织表面充分贴合（图1D）。
6. 将波长为405 nm的紫外LED光源置于距离植入物表面2–3 cm处，照射90 s，以确保树脂完全聚合；通过触觉评估树脂硬度及无黏性特征来确认聚合完成（图1E）。在进行紫外光聚合前，应将紫外防护罩覆盖于冷冻切片机舱窗上，以保护操作人员免受树脂固化过程中有害紫外光的暴露。

4. 切片回收与载玻片制备

1. 使用连续的单一动作移除封口膜，以防止对树脂-组织界面造成机械性破坏。通过冷冻切片机照明检查暴露的表面，确认树脂完全附着，表现为树脂覆盖均匀、组织边缘无翘起、无可见的封口膜残留。
2. 使用校准的切片机进样装置将样本切至预定的 8 µm 厚度。每张切片均需检查厚度是否一致，并确认无伪影（如压缩、撕裂或切片不完整）。优化防卷板的位置，以防止切片卷曲（图 1F）。
   注意：使用亲水性、带正电荷的粘附玻片，因其对难以处理的样本具有更优的固定能力，可提高切片转移及后续处理过程中的附着性。在转移切片前，应预先对玻片进行单独标记。
3. 将玻片的粘附面置于切片上方，确保首先在切片边缘接触，再逐步覆盖整个区域。确保经紫外固化后的树脂表面粘附于玻片，同时保持组织面朝上，以便进行免疫荧光染色（图 1G）。
4. 轻压切片-玻片组合体，以排除气泡。在冷冻切片机照明下检查其方向是否正确，确认植入物-组织界面保持完整。

5. 储存与保存

1. 放置 将已完成的载玻片置于预贴标签的储存盒中，在 –20 °C 保存，适用于需在 72 小时内进行处理的应用。
2. 若保存时间超过一周，应使用 –80°C 条件。

6. 免疫荧光染色实验方案

注意：使用胃蛋白酶时应穿戴适当的个人防护装备，因其对皮肤和呼吸道具有刺激性。

1. 从储存处取出载玻片，并转移至湿化室中，平衡至室温，持续 15–20 分钟。
2. 进行三次连续的 PBS 洗涤，每次 2 分钟。
3. 抗原修复：
   1. 热诱导表位修复法（HIER）：将载玻片水平放置于微波炉专用容器中，加入 1× 目标修复液。在 1000 瓦功率下高温微波处理 15 分钟，随后冷却至室温。
   2. 蛋白酶诱导表位修复法（PIER）：每张切片加入 100–150 µL 即用型胃蛋白酶溶液。加盖临时塑料盖玻片，在湿化室中 37° C 孵育 10 分钟。
4. 进行三次连续的 PBS 洗涤，每次 2 分钟。
5. 每张切片加入 1 mL 封闭液（含 0.1% 皂苷和 2.5% 正常山羊血清的 PBS 溶液），在湿化室中室温孵育 30 分钟。
6. 进行三次连续的 PBS 洗涤，每次 2 分钟。
7. 每张切片加入 100 µL 优化浓度的一抗溶液：
   1. 抗 Collagen IV 兔多克隆抗体，稀释比例为 1:100。
   2. 抗 Laminin 兔多克隆抗体，稀释比例为 1:500。
   3. 抗 F4/80 兔单克隆抗体，稀释比例为 1:500。
8. 加盖临时塑料盖玻片，在湿化室中 4° C 过夜孵育。
9. 进行三次 PBS 洗涤，每次 2 分钟。
10. 加入浓度为 10 µg/mL 的二抗溶液：
    1. 驴抗兔 IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. 山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488
11. 在避光条件下室温孵育 60 分钟。
12. 可选的麦胚凝集素（WGA）染色：
    1. 在含 2.5% 正常山羊血清的 PBS 中加入 WGA-Alexa Fluor 647，终浓度为 5 µg/mL。
    2. 加盖后在 37° C 孵育 30 分钟，随后进行三次连续的 PBS 洗涤，每次 2 分钟。
13. 每张切片加入 80 µL 含核复染的硬封片剂。
14. 用盖玻片覆盖，避免产生气泡。
15. 将载玻片在避光条件下水平静置，室温固化 2 小时。
16. 在 4° C 保存，最长一周，以获得最佳成像质量。

7. 荧光显微镜与图像采集

1. 使用配备制造商滤光片组的倒置荧光显微镜进行成像：激发/发射波长分别为 360/460 nm、470/525 nm、545/605 nm 和 620/700 nm。
2. 通过显微镜软件的 Filter 菜单中选择各荧光通道来采集图像。在优化曝光参数之前，需先选择 Adjust Black Balance 执行黑平衡校正，以确保每个通道的基线准确。随后打开 Image Capture 窗口，启用 Live 模式，并调节 Exposure 和 Light Intensity 参数，直至获得高信噪比且无像素饱和的图像。使用软件中的 Histogram 显示功能和 Highlight Saturated Pixels 工具监控饱和情况。在正式采集图像前，各通道应独立完成调节。
3. 采用制造商推荐的相邻视野间 10% 重叠设置，执行自动拼接成像。在整个采集过程中保持自动调焦功能开启。

结果

切片质量评估与优化
在紫外光固化树脂稳定化处理并以8 µm厚度切片后，将切片收集至防脱载玻片上，并进行质量控制评估。高质量切片应呈现完整的形态结构，无明显裂纹或断裂伪影，组织架构连续，且植入物-组织界面保持完好（图2A）。若切片出现严重结构损伤，包括断裂或组织从树脂稳定的植入物表面分离，则排除于后续分析之外（图2B）。值得注意的是，紫外光固化树脂的应用并未影响OCT包埋块的质量，因为在整个包埋块的全深度范围内均能稳定获得厚度均一的连续切片，表明树脂渗透与紫外光固化过程未对切片质量产生不利影响。保留符合质量标准的切片，用于后续免疫荧光染色实验。

不同样本类型中的免疫荧光染色效果
免疫荧光染色在多种样本类型中均成功实现，包括含有植入物的小鼠皮下组织以及仅含分离植入物材料的样本。由于采用了简化的甲醛固定程序（4°C 过夜），需进行抗原修复以恢复表位的可及性，从而实现抗体的最佳结合。在完成...

讨论

这种紫外光固化树脂稳定化方法为含有合成材料的OCT包埋组织样本提供了一种冷冻切片的替代处理方案，这类样本通常难以通过标准冷冻切片技术进行处理。尽管已有多种粘附选择，例如带电荷载玻片、组织结合胶带及其他贴附式支撑材料，可用于防止组织切片或脆弱样本在操作过程中脱落，但这些产品仅提供载玻片粘附功能，无法在切割过程中为植入物-组织界面提供所需的机械增强支持。此外，目前尚无适用于生物样本表面、可均匀涂布且通过紫外光固化的树脂产品，以增强冷冻切片过程中的结构稳定性。在此背景下，本文所介绍的紫外光固化树脂方案填补了方法学上的空白，能够在保持抗原表位可及性的同时，为需要冷冻处理的抗体检测提供靶向机械支撑，从而实现对含有合成聚合物组分样本的可靠切片¹¹。

成功实施该操作流程需特别注意若干步骤。树脂的选择必须优先考虑其自体荧光尽可能低，并具有适当的黏度，以在切片过程中提供足够的结构支撑，同时避免脆裂或固化不完全。本方案所选用的高黏度树脂在多个荧光通道中均表现出极低的背景干扰。切片厚度需根据材料特性进行优化。在6–10 µm范围内的测试表明，8 µm厚度可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于树脂固化的 5W 鹅颈式紫外灯，波长 395–405 nm	Amazon	UPC ‎603335835561
抗体 - 抗 F4/80（单克隆）	Abcam	ab300421	1:500
抗体 - IV 型胶原蛋白（多克隆）	Abcam	ab6586	1:100
抗体 - 驴抗兔 IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 ug/mL
抗体 - 羊抗兔 IgG AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10 ug/mL
抗体 - 层粘连蛋白（多克隆）	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	Formlabs	FLBMCL01	生物相容性材料 #1
BioMed Durable	Formlabs	FLBMDU01	生物相容性材料 #2
缓冲 10% 甲醛	Cardinal Health	C4320-101
BZ-X 滤光片 Cy5	Keyence	OP-87766	滤光片组
BZ-X 滤光片 DAPI	Keyence	OP-87762	滤光片组
BZ-X 滤光片 GFP	Keyence	OP-87763	滤光片组
BZ-X 滤光片 TRITC	Keyence	OP-87764	滤光片组
BZ-X800 分析软件	Keyence	BZ-X800	集成软件
Fisherbrand Premium 盖玻片  50 x 24 mm	Fisher Scientific	12-544-14
Form4B 3D 打印机	FormLabs	F4B-Printer
Form4 树脂槽	Formlabs	RT-F4-01
山羊血清	Gibco	16210064
HM525 NX 冷冻切片机	Epredia	956641EC
家用微波炉	Panasonic	NN-S766BA	输出功率 1000 瓦
IHC-Tek 塑料盖玻片 24 mm x 60 mm	IHC World	IW-2601	临时盖玻片
JDiction 低粘度 UV 树脂	Amazon	6974143904430	高自发荧光
Keyence BZ-X800	Keyence	BZ-X800
Let's Resin UV 树脂透明硬质型	Amazon	ALR00038	高自发荧光
Let's Resin 透明 UV 树脂高粘度型	Amazon	ALR00048
Matsunami MAS 微量载玻片	Newcomer Supply	SUMAS1190	粘附载玻片
Medpor 外科植入物	Stryker	8662	生物相容性材料 #3
Mr. Resin UV 树脂水晶透明型	Amazon	B08FRF9QTB	高自发荧光
MX35 超薄切片机刀片	Epredia	3053835
Parafilm M 实验室封口膜	Parafilm	P7543-1EA
胃蛋白酶	Sigma	R2283-15ML
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Sigma	P3813
Plan Apo λ 40X	Keyence	BZ-PA40	物镜
Plan Apo λ 4X	Keyence	BZ-PA04	物镜
聚氨酯接缝滚轮	Amazon	682698799567
含 NucBlue 染色剂的 ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 复染剂
皂苷	Millipore	558255-100GM
染色盘（StainTray）	Simport	M920-2
无菌硅胶片	Bentec	PR72034-51N
靶修复溶液，柠檬酸 pH6	Agilent	S236984-2
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura	4583
麦胚凝集素 AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5 ug/mL