人体皮肤中淋巴管的三维可视化及其在淋巴水肿期间的结构变化

摘要

本研究通过应用三种不同的组织透明化技术，结合共聚焦显微镜或光片显微镜，实现了人类皮肤中淋巴管结构的三维可视化。这些方法与免疫组织化学染色相结合，可揭示淋巴水肿进展过程中淋巴管功能变化的机制。

摘要

皮肤中的淋巴管包括毛细淋巴管和集合淋巴管，在废物清除和免疫应答中发挥关键作用，对维持组织稳态至关重要。然而，人类皮肤具有表皮、真皮和皮下脂肪三层结构，其富含胶原蛋白的致密细胞外基质使得三维可视化淋巴网络具有挑战性。为克服这一局限，本文介绍了三种不同的方法，每种方法均针对特定目标分子和实验目的，结合组织透明化试剂与共聚焦显微镜或光片显微镜，实现人类皮肤淋巴管的三维可视化。通过免疫组织化学技术靶向淋巴内皮细胞中的黏附连接分子，对继发性淋巴水肿患者皮肤组织中具有明确功能意义的结构变化进行了评估，特别是毛细淋巴管连接从“纽扣样”向“拉链样”结构的特征性重塑。这种三维可视化技术能够揭示传统组织学切片分析无法分辨的血管结构，从而加深对淋巴管结构与功能的理解。

引言

随着认识到淋巴管在维持皮肤稳态中的作用，而不仅仅局限于其在癌症转移中的明确作用，人们对淋巴管功能的兴趣日益增加^1,2。淋巴管在结构上分为毛细淋巴管和集合淋巴管，各自具有不同的特征。毛细淋巴管由单层淋巴内皮细胞构成，是组织液、代谢废物和免疫细胞的初始收集部位。相比之下，集合淋巴管具有双层结构，其外层为包绕淋巴内皮层的平滑肌细胞，能够主动将毛细淋巴管网收集的淋巴液输送至中心循环系统³。小鼠模型已被用于阐明支气管淋巴管等结构特征，并揭示了炎症状态如何诱导结构重塑⁴。先前的研究表明，紫外线诱导的炎症会导致毛细淋巴管异常扩张，从而损害其液体收集功能。相关功能障碍的分子机制已被明确，具体表现为VEGF-A表达升高与VEGF-C表达降低共同驱动了这些结构改变^5,6,7。

尽管三维可视化技术已显著推动了小鼠模型中淋巴网络的研究进展^8,9，但对人类淋巴管的类似结构分析仍面临挑战。这一分析空白主要源于人类组织研究中的困难，包括样本获取受限以及实现全面三维成像所涉及的技术难题。特别是皮肤，其具有由表皮、真皮和皮下脂肪组成的三层结构，并作为对外部环境的屏障，相较于其他软组织器官带来了更大的挑战。此外，与小鼠模型相比，人类皮肤在分析上具有独特难点，例如组织更厚，限制了深层成像的穿透能力。同时，丰富的细胞外基质成分（尤其是胶原蛋白）及其随年龄变化的结构改变，形成了光学屏障，降低了新兴组织透明化技术的效果——这些技术已在小鼠淋巴成像中实现了革命性突破¹⁰。

既往已测试多种组织透明剂以可视化人皮肤毛细血管，证明了这些试剂的组织相容性¹¹。在此基础上，组织透明试剂已成功用于三维可视化人皮肤淋巴管¹²。通过聚焦于淋巴内皮细胞的黏附连接结构，研究人员识别出与淋巴水肿进展相关的淋巴管结构变化¹³。本文旨在详细描述结合三种皮肤透明技术、共聚焦显微镜和光片显微镜以及针对特定研究目标优化的免疫组织化学染色方法，实现人皮肤淋巴管三维可视化的具体操作流程。本研究中，尽管我们仅关注在切除当日即固定、且未经历冻融循环的新鲜人皮肤组织，但这些技术不仅有助于揭示疾病和衰老过程中淋巴管的结构变化，还可反映其相关的功能改变。

方案

人类受试者的皮肤样本取自日本千叶大学医院（千叶，日本）。涉及人类受试者的所有程序均经千叶大学医院机构审查委员会及资生堂全球创新中心批准，所有受试者均签署了书面知情同意书。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 人皮肤样本的预处理

1. 获取切除标本后，立即去除皮下组织。
   注意：皮肤切除与获取之间的时间间隔约为 h。运输过程中，组织应浸没于 DMEM 中，并置于冰袋上保存。
2. 将样本表皮面向下放置于 60 °C 的加热板上 45 秒，以分离表皮与真皮。
3. 立即将标本浸入预冷的 PBS 中。
4. 使用镊子分离表皮和真皮。
5. 将真皮部分在 4% 多聚甲醛中 4°C 固定 16 小时，使用前用 PBS 洗涤。
   注意：固定后，样本保存在 4 °C 的 PBS 中，免疫染色步骤在数月内开始。
   警告：PFA 溶液具有毒性。所有配制和操作必须在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备。

2. 免疫染色整体装片结合透明试剂

1. iDISCO 技术
   1. 将样本修剪至约 5 mm × 5 mm × 5 mm 大小。
   2. 将样本转移至含 5% Triton X-100 和 2.5% Tween 20 的 PBS 溶液中，在转速为 50 rpm、温度为 24 °C 的摇床上孵育 16 小时，以实现通透化处理。
   3. 在 24 °C 条件下用 PBS 洗涤样本 1 小时，重复该步骤三次。
   4. 将样本浸入新鲜配制的封闭缓冲液 A（含 1% BSA、0.1% Tween 20 和 0.03% 叠氮化钠的 PBS 溶液）中，在转速为 50 rpm、温度为 24 °C 的摇床上孵育 72 小时。
   5. 在封闭缓冲液 A 中加入抗 podoplanin 的一抗（稀释比例为 1:100），将样本置于转速为 50 rpm、温度为 37 °C 的摇床上孵育 72 小时。
   6. 用洗涤缓冲液 A（含 0.1% Tween-20 的 PBS 溶液）在 24 °C 条件下洗涤样本 1 小时，重复该步骤三次。随后将样本置于洗涤缓冲液 A 中，在转速为 50 rpm、温度为 4 °C 的摇床上继续孵育 72 小时。
   7. 在封闭缓冲液 A 中加入与 Alexa Fluor 647 偶联的抗小鼠 IgG 二抗（稀释比例为 1:1000），将样本置于转速为 50 rpm、温度为 37 °C 的摇床上孵育 72 小时。
   8. 重复步骤 1.6。
   9. 将样本在 24 °C 条件下用 50% MeOH 孵育 3 小时。
   10. 将样本在 24 °C 条件下用 70% MeOH 孵育 3 小时。
   11. 将样本在 24 °C 条件下用 100% MeOH 孵育 16 小时。
   12. 将样本在 24 °C 条件下用二氯甲烷孵育 15 分钟，重复该步骤两次。
   13. 用二苄基醚在 24 °C 条件下对样本进行透明化处理 16 小时。
       注：若此时组织尚未完全透明，则继续等待不会带来显著改善。
   14. 使用光片显微镜对样本进行成像。
       注：使用配备 EC Plan-Neofluar 5×/0.16 物镜的光片显微镜；激发波长设为 63 nm，检测波长设为 648 nm；以 5.8 µm 的步长采集 Z 轴层扫图像。
       注意：甲醇、二氯甲烷和二苄基醚具有危害性。所有操作必须在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
2. Rapiclear 1.52 试剂
   1. 将样本修剪至约 5 mm × 5 mm × 2 mm 大小。
   2. 将样本转移至含 2% Triton-X 100 的 PBS 溶液中，在转速为 50 rpm、温度为 24 °C 的摇床上孵育 16 小时，以实现通透化处理。
   3. 将样本浸入新鲜配制的封闭缓冲液 B（含 5% 驴血清和 1% Triton-X 100 的 PBS 溶液）中，在转速为 50 rpm、温度为 4 °C 的摇床上孵育 16 小时。
   4. 在封闭缓冲液 B 中加入抗 podoplanin 和 VE-cadherin 的一抗（稀释比例均为 1:100），将样本置于转速为 50 rpm、温度为 4 °C 的摇床上孵育 72 小时。
   5. 用洗涤缓冲液 B（含 3% NaCl 和 0.2% Triton-X 100 的 PBS 溶液）在 24 °C 条件下洗涤样本 1 小时，重复该步骤三次。随后将样本置于洗涤缓冲液 B 中，在转速为 50 rpm、温度为 4 °C 的摇床上继续孵育 16 小时。
   6. 在 24 °C 条件下用 PBS 洗涤样本 1 小时。
   7. 在封闭缓冲液 B 中加入分别与 Alexa Fluor 647 和 568 偶联的抗小鼠 IgG 和抗兔 IgG 二抗（稀释比例均为 1:1000），将样本置于转速为 50 rpm、温度为 4 °C 的摇床上孵育 16 小时。
   8. 重复步骤 1.5 和 1.6。
   9. 用至少 5 倍于样本体积的 Rapiclear 1.52 试剂在 24 °C 条件下对样本进行透明化处理 16 小时。
      注：组织边缘区域的透明化过程在不到 1 小时内即可观察到。
   10. 将透明化后的样本嵌入置于盖玻片上的聚二甲基硅氧烷凝胶腔室中，并加入新鲜的 Rapiclear 1.52 试剂。
   11. 使用共聚焦显微镜对样本进行成像。
       注：使用配备 Plan-Apochromat 10×/0.45 M27 物镜的共聚焦显微镜；激发波长设为 633 nm 和 561 nm，检测范围分别为 641–754 nm 和 566–628 nm，使用 GaAsP 检测器；以 3.15 µm 的步长采集 Z 轴层扫图像。
3. CUBIC 技术
   1. 将样本修剪至约 5 mm × 5 mm × 3 mm 大小。
   2. 将样本在 24 °C 条件下浸入 50% CUBIC-L 溶液中预处理 24 小时，以进行脱脂。
   3. 将样本转移至 100% CUBIC-L 溶液中，在转速为 50 rpm、温度为 37 °C 的摇床上孵育 7 天，以完成脱脂。
   4. 在室温条件下用 PBS 洗涤样本 24 小时。
   5. 将样本浸入新鲜配制的封闭缓冲液 A 中，在转速为 50 rpm、温度为 24 °C 的摇床上孵育 72 小时。
   6. 在封闭缓冲液 A 中加入抗 VE-cadherin、podoplanin 和 CD31 的一抗（稀释比例分别为 1:100、1:100 和 1:200），将样本置于转速为 50 rpm、温度为 37 °C 的摇床上孵育 72 小时。
   7. 在 24 °C 条件下用洗涤缓冲液 A 洗涤样本 1 小时，重复该步骤三次，随后将样本置于洗涤缓冲液 A 中，在转速为 50 rpm、温度为 4 °C 的摇床上继续孵育 72 小时。
   8. 在封闭缓冲液 A 中加入分别与 Alexa Fluor 647、568 和 488 偶联的抗小鼠 IgG、抗兔 IgG 和抗绵羊 IgG 二抗（稀释比例均为 1:1000），将样本置于转速为 50 rpm、温度为 37 °C 的摇床上孵育 72 小时。
   9. 重复步骤 3.7。
   10. 在 24 °C 条件下用 50% CUBIC-R+(M) 对样本进行预透明化处理 16 小时。
   11. 在 24 °C 条件下用 100% CUBIC-R+(M) 对样本进行透明化处理 16 小时。
       注：若此时组织尚未完全透明，则继续等待不会带来显著改善。
   12. 使用共聚焦显微镜对样本进行成像。
       ​注：使用配备 Plan-Apochromat 20×/0.8 M27 物镜的共聚焦显微镜；激发波长设为 633 nm、561 nm 和 488 nm，检测范围分别为 641–754 nm、566–628 nm 和 479–550 nm，使用 GaAsP 检测器；以 0.78 µm 的步长采集 Z 轴层扫图像。

结果

清除后含表皮与不含表皮的人类皮肤组织在透光性上的差异
图1 展示了经透化及使用Rapiclear 1.52试剂清除后的含表皮与不含表皮人类皮肤样本的代表性照片。去除表皮可通过消除强效吸光物质黑色素而提高组织透明度，样本下方黑色线条可见度的提升证实了这一点。

人类皮肤中淋巴管的三维宏观可视化
通过结合使用iDISCO技术进行组织透明化与光片显微镜成像，并对主要淋巴管标志物podoplanin进行免疫染色，实现了人类皮肤组织中淋巴管的三维宏观可视化¹⁴（图2）。该方法可提供有关整体淋巴网络结构的全面信息，而非详细的结构特征。图像显示表皮下方存在密集的淋巴毛细血管网络，这些网络在较深的真皮层汇聚成较大的前集合淋巴管，与已确立的解剖学描述一致¹⁵。

讨论

对生物组织中淋巴网络进行三维可视化，对于理解其结构特征、生理功能以及病理变化至关重要。本方案提供了三种针对人皮肤组织优化的透明化方法，每种方法均根据特定的观察目标进行定制。

表皮去除被认为是消除黑色素的关键步骤，可提高组织透明度并避免对组织学评估造成干扰¹⁹。与此一致，采用iDISCO方法对保留完整表皮的人类皮肤样本进行免疫染色时，信号较弱，尤其在表皮下方区域更为明显，表明抗体渗透以及来自表皮侧的激光透射均受到阻碍。此外，本方案中采用短暂加热刺激的方法去除表皮。该方法相较于使用dispase等酶解法，被认为对皮肤组织结构和细胞膜蛋白的损伤更小²⁰。

在本研究中，采用了三种不同的组织透明化技术，包括 Rapiclear、CUBIC 和 iDISCO。关于 Rapiclear 试剂的使用，实验方案主要依据制造商的建议，但进行了以下修改：（1）将组织厚度减小至约 2 mm，以确保试剂有效渗透；（2）省略脱水和再水化步骤；（3）抗体孵育在 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD31抗体	R&D Systems	AF806	稀释比例为1:200
抗Podoplanin抗体	Dako	M3619	稀释比例为1:100
抗VE-钙粘蛋白抗体	Cell Signaling Technology	#2500	稀释比例为1:100
CUBIC-L	东京化成工业	T3740
CUBIC-R+(M)	东京化成工业	T3741
DMEM，低糖，含丙酮酸	Thermo Fisher SCIENTIFIC	11885084
驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647标记	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-31571	稀释比例为1:1000
驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568标记	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A10042	稀释比例为1:1000
驴抗绵羊IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-11015	稀释比例为1:1000
Rapiclear 1.52	Sunjin Lab	RC152001
ZEISS Lightsheet Z.1 显微镜	Carl Zeiss
ZEISS LSM 880 共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss