方法文章

使用微流控系统实时观察营养培养基对Pseudomonas aeruginosa生物膜发育的影响

DOI：

10.3791/69997

⸱

2026年5月15日

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

本文内容

摘要

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本方案评估了营养丰富的（TSB）和最低限度的（FAB）培养基成分对 铜绿假单胞菌 微通道中稳态流动环境下PAO1和PA14生物膜的发育

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

致病菌Pseudomonas aeruginosa是多种医院内感染的主要病因，其日益增强的抗菌药物耐药性已构成重大的公共卫生威胁。本文提供了一套全面的实验方案，详细描述了利用微流控系统对两种关键的P. aeruginosa菌株PAO1和PA14的生物膜发育过程进行实时可视化和定量分析的方法。该方法采用光学透明的多通道微流控芯片，使细菌培养物在连续稳定的培养基流动条件下生长，培养基包括胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或改良的最低限度苛养厌氧肉汤（FAB），并可调节其中碳源浓度，从而模拟临床环境中的实际条件。在24小时期间，通过自动化的实时成像，以高度可重复的方式记录生物膜的生长与成熟过程，包括生物膜表面积覆盖率、厚度以及表面粗糙度等参数。本实验旨在通过结果证明，两种菌株的生物膜形成均显著受到培养基营养成分变化的影响。本可视化方案的目标是为研究人员提供一种在稳定层流条件下研究生物膜动态行为的方法，所得见解有望用于开发针对医院环境中早期P. aeruginosa生物膜的非抗菌类清除策略。

引言

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本方法旨在观察两种不同培养基——胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和改良最低苛养厌氧肉汤（FAB）——对两种微生物生物膜生长的影响 铜绿假单胞菌 菌株，即 PAO1 和 PA14。尽管 P. aeruginosa PAO1 和 PA14 均为常用实验室参考菌株，其中 PA14 菌株可感染更广泛的宿主，范围从植物到无脊椎动物1TSB 营养肉汤是一种通用型培养基，含有 2.5 g/L 葡萄糖作为碳源，因其成分为酪蛋白和大豆蛋白胨，可提供有机氮源及天然糖类，同时含有氯化钠以维持渗透压平衡，故可培养多种细菌。2最小FAB培养基则仅含有极低浓度（降低50倍）的单一碳源，浓度为0.05 g/L，用于探究厌氧细菌的生长需求。PAO1和PA14菌株均暴露于单向层流条件下，产生0.01 Pa的低壁面剪切应力。该剪切应力值常出现在 P. aeruginosa-定植部位，包括囊性纤维化患者的支气管和胃肠道。通过实时测定生物膜百分比表面覆盖率、厚度以及表面粗糙度的算术平均值，对24小时内生物膜的生长情况进行测量。

P. aeruginosa 的生物膜是导致相当大比例的医院获得性感染的主要原因，也是囊性纤维化患者死亡的重要病因3,4,5。以往关于碳源水平对细菌生物膜发育影响的研究，忽略了生物膜形成过程中流体动力学流动的关键作用，所采用的剪切应力值无法真实反映 P. aeruginosa 感染部位的实际情况，或仅在实验结束后进行生物膜动力学和形态学分析6,7。本方法通过在微流控通道中模拟囊性纤维化患者体内的生理环境，并在稳态流动条件下对生物膜的形成过程进行实时成像，从而克服了上述局限性。

该方法相较于其他用于研究生物膜发育的技术具有显著优势。在24小时生物膜生长期间应用实时成像，可确保发育中的生物膜不受干扰，无需进行干燥或化学处理，避免了其组成成分的改变，从而获得比需要样本操作的方法更具代表性的结果8。此外，通过施加稳定的流体动力学流动条件，并在较大范围内调节碳源浓度，该方法能更准确地模拟P. aeruginosa医院感染部位所存在的生理环境。因此，与使用静态检测方法（如96孔微孔板或试片）相比，该方法更具代表性，因为后者无法反映流体流动对生物膜发育的关键影响9,10,11。

所采用的微流控装置因其尺寸与肺部支气管和细支气管等部分相似而被特别选用12。此外，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染对严重烧伤患者构成重大威胁，这些患者的葡萄糖水平可能显著偏离其正常范围13,14。

尽管本方案特别使用了两种铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株，但该方法也可适用于研究在类似条件下引起感染或定植的其他细菌的早期发育过程。此外，还可采用相同的方法研究其他营养培养基成分以及流动条件（例如脉动流、振荡流或更高的壁面剪切应力值）。

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方案

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1. 玻璃器皿清洗

  1. 将两个200 mL和三个1 L的玻璃瓶浸入10%盐酸（HCl）溶液中，用于培养基和琼脂的制备，室温下浸泡约5分钟。
    注意：盐酸具有腐蚀性。所有涉及酸的操作均应在化学通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具）。
  2. 随后将玻璃器皿从HCl溶液中取出，用自来水冲洗两次，再用蒸馏水（dH2O）冲洗一次。

2. 胰蛋白胨大豆肉汤培养基的制备

  1. 配制TSB溶液：使用洁净的称量舟和精密天平称取6 g/200 mL的TSB粉末。
    注：所用TSB粉末的成分为：葡萄糖（2.5 g∙L-1）、磷酸氢二钾（2.5 g∙L-1）、酪蛋白胰酶消化物（17 g∙L-1）、大豆粉木瓜蛋白酶消化物（3.0 g∙L-1）和氯化钠（5.0 g∙L-1）。
  2. 使用量筒量取200 mL去离子水（dH2O），倒入先前清洗干净的玻璃瓶之一中。
  3. 将6 g TSB粉末加入盛有200 mL dH2O的洁净玻璃瓶中，密封瓶口，混匀约2分钟，使粉末完全溶解，制成TSB溶液培养基。
  4. 将TSB培养基溶液在121 °C温度和1.5 atm压力下高压灭菌15–20分钟，以实现溶液的灭菌。
    注：（暂停点）TSB溶液可在使用间期于室温（约20 °C）下储存，并可用于后续实验。

3. 挑剔性厌氧菌液体培养基的制备

  1. 配制 FAB 培养基微量元素溶液。
    1. 使用独立的洁净称量舟、药匙和精密天平称量0.5–210 g范围内的质量，使用分析天平称量0.001–0.5 g范围内的质量。量取以下组分及其相应质量：CaSO4.2H2O（200 mg∙L-1），FeSO₄4.7H2O（200 mg·L⁻¹）-1），MnSO₄4.2O（20 mg·L⁻¹）-1），CuSO₄40.5H2O（20 mg·L⁻¹）-1），ZnSO₄4.7H2O (20 mg∙L-1），CoSO4.7H2O（10 mg·L⁻¹）-1），NaMoO4.2O (10 mg∙L-1）和 H3BO3 (5 mg·L⁻¹)-1)7,9.
    2. 将每种组分加入一个已清洗的1 L玻璃瓶中，瓶内含有1 L的dH₂O2O 并与 dH₂O 充分混匀2O.
    3. 将1 mL该混合物加入到另外两个1 L的无菌玻璃瓶中，每个瓶中已含有1 L的dH₂O2O 并充分混匀。
  2. 制备含20 mM柠檬酸钠的FAB培养基用于过夜培养
    1. 使用独立、洁净的称量皿和药匙，采用精密天平（称量质量为0.5–200 g时）和分析天平（称量质量为0.001–0.5 g时），准确称取以下组分及其用量：柠檬酸钠（20 mM）、(NH₄)₂SO₄（1.2 M）、NaCl（0.5 M）、MgSO₄·7H₂O（2 mM）、KH₂PO₄（50 mM）、K₂HPO₄（50 mM）和葡萄糖（20 g/L）4)2SO4 (2 g·L⁻¹)-1），Na2HPO4.2H2O (6 g·L⁻¹)-1），KH2PO4 (3 g·L⁻¹)-1)，NaCl（3 g∙L-1)，MgCl2 (93 mg·L⁻¹)-1) 和 CaCl2 (11 mg·L⁻¹)-1)7,9.
    2. 将所有组分加入另一个剩余的1 L无菌玻璃瓶中，该瓶内含有1 L的dH₂O2加入1 mL微量金属溶液。
    3. 充分混匀。
  3. 制备含0.3 mM葡萄糖的FAB培养基用于生物膜生长。
    1. 将20 mM柠檬酸钠替换为0.3 mM葡萄糖。使用步骤3.2.1中列出的相同组分和质量。
    2. 在另一个已清洗干净的1 L玻璃瓶中，将0.3 mM葡萄糖FAB组分加入1 mL的dH₂O中2加入1 mL微量金属溶液，充分混匀。
  4. 在121 °C蒸汽温度和1.5 atm压力下灭菌15–20分钟，以对培养基进行灭菌。
    注意：（暂停点）FAB 培养基溶液可在使用间隙于室温（约 20 °C）保存，并用于后续实验。

4. 胰蛋白胨大豆琼脂制备

  1. 使用精密天平和已清洗的称量舟及药匙，称取 8 g/200 mL 的 TS 琼脂。
  2. 在另一个称量舟中，使用同一台精密天平称取 1 g/200 mL 的高纯度细菌级琼脂。
  3. 使用量筒量取 200 mL 的 dH2O，并倒入预先清洗干净的玻璃瓶中。
  4. 将两种琼脂成分均加入 200 mL 的 dH2O 中，并充分混合。
  5. 在 121 °C 温度和 1.5 atm 压力下高压灭菌 15–20 分钟，以灭菌培养基。
    注意：（暂停点）TSB 琼脂可在室温（约 20 °C）下储存，供后续使用，再次使用前需重新加热。

5. 培养皿 铜绿假单胞菌 培养

  1. 将琼脂放入微波炉中加热约 5 分钟，或加热至溶液完全融化。
  2. 使用 70% 乙醇溶液打开并消毒二级生物安全柜表面，准备使用。以下所有步骤均须在该二级生物安全柜内进行。
  3. 量取 25 mL 琼脂溶液加入 50 mL 离心管中，倒入 90 mm 培养皿，静置待琼脂凝固。
  4. 从 -80 °C 冰箱中取出 P. aeruginosa PAO1 和 PA14 的冻存菌种，放入 37 °C 培养箱中约 5 分钟，或直至内容物完全解冻。
  5. 将接种环浸入任一解冻后的 P. aeruginosa 菌种中，并将样品均匀涂布于琼脂表面。
  6. 对另一种 P. aeruginosa 菌株重复步骤 5.5，制备两个独立的 P. aeruginosa 培养皿培养物，一个接种 PAO1 菌株，另一个接种 PA14 菌株。
  7. 用记号笔在每个培养皿上标注所含 P. aeruginosa 菌株名称、复苏日期及操作者姓名缩写，随后置于 37 °C 培养箱中培养 16–18 小时。
    注意：（暂停点）P. aeruginosa PAO1 和 PA14 培养皿可在 4 °C 保存最长 4 周，供后续实验使用。

6. Pseudomonas aeruginosa PAO1 和 PA14 甘油菌种保存

  1. 打开并消毒II级生物安全柜以备使用，选取八个50 mL离心管用于盛装过夜培养物。
  2. 使用先前制备的TSB和柠檬酸钠FAB培养基（第3节），将5 mL TSB培养基加入八个样品瓶中的四个，其余四个加入柠檬酸钠最低限度FAB培养基。
  3. 使用先前孵育的培养皿和接种环，分别接触五个不同的菌落 P. aeruginosa PAO1 培养皿并转移至一支 TSB 管中。对柠檬酸钠 FAB 培养基同样重复此操作。 P. aeruginosa PA14 菌株培养皿
  4. 将洁净的接种环直接浸入剩余的四支TSB和柠檬酸钠FAB培养基小瓶中，作为对照。
  5. 将全部八个试管置于摇床培养箱中，在 200 RPM 和 37 °C 条件下孵育 16–18 小时，并做好清晰标记。
  6. 取出培养管，确保接种的培养管 P. aeruginosa 呈浑浊状，而用作对照的则保持澄清。
  7. 离心四个 P. aeruginosa-接种后的试管在4000 × g 在20 °C下孵育5分钟以分离 P. aeruginosa 从培养基中取出。确保离心机已平衡。
  8. 弃去上清液，将离心后的铜绿假单胞菌菌体沉淀用1 mL含15%甘油的溶液重悬，该溶液由150 µL甘油与850 µL新鲜TSB或柠檬酸钠FAB培养基组成。
  9. 将重悬的菌液转移至1 mL小瓶中，并置于-80 °C冰箱中保存。
    注意：（暂停点）甘油菌种可在 -80 °C 长期保存，用于后续实验。

7. 测定过夜培养物的光密度

  1. 重复步骤6.1–6.5，仅使用两管TSB培养基，其中一管作为对照，另一管加入PAO1 P. aeruginosa 菌株
  2. 在II级生物安全柜中，将1 mL TSB培养基移入1 mL分光光度计比色皿中，并将0.9 mL TSB培养基转移至第二个比色皿中，加入0.1 mL过夜培养物。
  3. 将分光光度计设置为600 nm波长，使用1 mL TSB分光光度计比色皿校准仪器，测定0.1 mL悬浮液比色皿的光密度15.
    1. 如果测得的吸光度不为0.1，则需重新计算所需的悬液体积。
      注意：为获得 0.1 吸光度读数所需的悬浮液体积（V1) 可根据初始 0.1 mL 悬浮液小瓶的吸光度读数计算得出， C1，将悬浮液调节至的目标吸光度， C2以及所需浓缩过夜悬浮液的体积， V2:
      C1V1 = C2V2
      在上述示例中，如果 C1 = 3.59, C2 = 0.1 且 V2 = 10 mL，过夜悬浮液在10 mL溶液中所需的体积为0.279 mL。
  4. 将10 mL TSB培养基加入50 mL离心管中，并移除与所需菌悬液体积相等的TSB培养基，以制备10 mL、OD600 nm为0.1的菌悬液。取过夜培养物，加入计算所得体积的菌液，涡旋混匀约5秒。
  5. 将10 mL调整后的悬浮液中的1 mL转移至分光光度计比色皿中，重新测定吸光度，确保其为0.1。
  6. 重复上述 7.1–7.5 步骤，分别用于 PA14 和 TSB 培养基，且每种条件均需进行双份实验 P. aeruginosa 菌株与柠檬酸钠FAB培养基。

8. 活细胞计数

  1. 在 II 级生物安全柜内，将去离子水（dH2O）转移至一个方形培养皿中，并使用多通道移液器将 180 µL 转移至透明的 96 孔聚苯乙烯板的第 2–9 列16。
  2. 将 10 mL 的 0.1 OD 600 菌悬液转移至另一个独立的方形培养皿中，并使用多通道移液器将 200 µL 该悬液转移至 96 孔聚苯乙烯板的第 1 列。
  3. 使用多通道移液器，从 96 孔聚苯乙烯板的第 1 列中取出超过 20 µL 悬液加入第 2 列，随后将第 2 列中 20 µL 稀释后的悬液转移至第 3 列，依此类推至第 9 列，从而制备出 10-1 至 10-8 的系列稀释悬液。
  4. 在 II 级生物安全柜内，使用小瓶将 50 mL TS 琼脂（第 4 节及步骤 5.1）转移至方形培养皿中，静置直至琼脂变浑浊。
  5. 使用多通道移液器，将第 2–9 列各孔中的 10 µL 悬液以列的形式点样至 TS 琼脂培养皿上，确保各列之间不相互接触。
  6. 待转移的稀释液完全沉降后，将 TS 琼脂培养皿在 37 °C 下孵育 24 小时。
  7. 通过判断培养皿中菌落数是否在可计数范围（30 至 300 个菌落）内，计算每毫升（mL）的菌落形成单位（CFU）。
  8. 确定所用 10 mL 悬液的稀释倍数；本例中，悬液被稀释至 1/10（0.1 OD 600）。
  9. 计算每列点样板的单独稀释倍数。该值为加入每列的稀释悬液体积除以加入悬液后该列的总体积。以 96 孔板的第 2 列（即培养皿的第 1 列）为例，20 µL / 200 µL = 1/10。
  10. 通过将各列的单独稀释倍数相乘，计算总系列稀释倍数。
    注：本例中，由于每次从一列向下一列转移 20 µL，且每孔总体积为 200 µL，因此每次稀释倍数为 1/10，总系列稀释倍数为 1 × 10-8。
  11. 确定从 96 孔板转移至培养皿过程中的点板稀释倍数。为计算 CFU/mL，需将每列点板体积（10 µL）除以 1 mL。本例中：小数乘法方程：0.01/1 × 10/10 = 1/100。。
  12. 通过将原始悬液稀释倍数（0.1）乘以总系列稀释倍数（1 × 10-8）和点板稀释倍数（分数 1/100，数学概念，比例表示，基础算术教育。），确定最终稀释倍数。
  13. 计算原始样品中的 CFU∙mL-1，将平板上的 CFU 数乘以最终稀释倍数的倒数。
    注：本例中，若计数得到 200 个 CFU，则计算为 200 × 1/1 × 10-8，结果为 2 × 1010 CFU∙mL-117。

9. 微流控系统设置与实验运行

  1. 用每种菌株接种5 mL培养基肉汤 P. aeruginosa 过夜培养，在37 °C下孵育16–18小时。
  2. 建立微流控系统及配套软件。
    1. 按以下顺序启动微流控系统组件：电源、微流控系统控制器、CMOS 相机、 enclosure heaters、显微镜、计算机及关联显示器。
    2. 启动微流控软件，并在提示时输入多通道板侧面的48孔0–2 Pa多通道板相关条形码，以启动相应的控制模块界面。
  3. 设置 P. aeruginosa 多通道板孔接种程序
    1. 将过夜培养物的光密度调整至 0.1 OD600.
    2. 在II级生物安全柜中，将50 µL的0.1 OD600菌悬液平行加入六通道装置每个通道的出口孔中。
      注意：任何时候均并行运行六个通道，以最大程度提高异常结果的识别概率。
    3. 更换48孔多通道板的盖子，并将其转移至系统培养箱内的可移动载物台上并固定。
  4. 设置 P. Aeruginosa 多通道板通道接种程序。
    1. 使用微流控系统控制模块，选择以下选项以在微流控通道中接种： 手动 > 第1–4列 > 流体：37 °C 下的 TSB > 最大剪切应力（Pa）：0.1 （1 达因·厘米-2 = 0.1 Pa）并选择48孔0–2 Pa多通道板示意图中的出口孔。
    2. 选择 中止 按下按钮，停止流动 2–4 秒，然后静置芯片 30 分钟，以确保细胞在开始持续流动前已贴附于通道基质上。
      注意：30 分钟的时长可借助重力作用促进浮游生物的附着 P. aeruginosa 细菌沉降到下层通道壁所需的时间将根据细菌种类和营养培养基的类型而有所不同。
    3. 从可移动孵育台中取出多通道板，在II级生物安全柜中将1 mL新鲜TSB转移至六个通道中每个通道的入口孔内。
    4. 将多通道板转移至培养箱内的可移动载物台上，并固定到位。
  5. 设置 自动运行.
    1. 确保在24小时实验过程中使用的流速与所处环境相关 P. aeruginosa 在自然界中，通过导航至 手动 > 剪切应力：0.01 Pa，并记录体积流速（µL⋅h-1）显示。确保此值对于48孔微通道板为8.2 µL⋅h-1.
    2. 将体积流量转换为 m3·s-1，计算通道的横截面积（m²）2，并确定在0.01 Pa流体剪切应力下的流速。
      注意：通过使用并重新排列流体体积流量方程，可计算流体通过通道的流速：
      Heat transfer equation, \( \dot{Q} = UA \), formula for thermal energy exchange calculation.
      其中 U 为流体速度（m·s⁻¹）-1）而 A 是微通道的横截面积（m2多通道板中各通道的数量。
    3. 使用TSB培养基的密度 ρ 和动力黏度 µ 计算流体雷诺数，并确保其处于适当的流体流动范围内 P. aeruginosa 生物膜的形成位置。对于0.01 Pa的流体剪切应力，需确保TSB和FAB培养基中的雷诺数分别为0.0117和0.0165。若超出该范围，请检查流体条件是否设置为TSB。
      Reynolds number equation, Re=ρUDh/μ, fluid dynamics formula, educational diagram.
      何处 Dh 是所用微通道的水力直径，通过以下公式获得：
      Darcy-Weisbach equation, hydraulic diameter formula, \(D_h = \frac{2 \times w \times h}{w + h}\) diagram.
      其中，w 和 h 分别表示所用微通道的宽度（m）和高度（m）。
    4. 计算流体发展长度，以确保图像采集区域内的流体流动处于充分发展状态。
      注意：层流流体通过管道的发展长度可通过雷诺数（Re）和管道的水力直径计算得出。 Dh:
      L开发 = 0.06ReDh
    5. 设置自动运行： 编辑自动运行 > 实验方案设置 > 持续时间：24 h，重复1次，剪切应力为0.01 Pa。保存 实验方案.
    6. 在 序列设置 通过应用新创建的方案，对通道1–6进行一次重复操作，并选择流体： 37 °C 下的 TSB保存此序列。
  6. 使用以下方法设置图像采集 多维采集 窗口。
    1. 选择 多维采集 使用系统软件，然后 活体 按钮（左下角） 多维采集 窗口）。使用显微镜载物台移动样品，依次观察1–6通道 实时观察 显微镜触摸屏上的按钮和相机放大倍数为5×至40×，每次显示相机视野中的一个通道。
    2. 准备相机以进行图像采集： 多维采集 > 保存：选择用于保存图像的目录 > 延时摄影: 持续时间：24 h，与流体动力学流动相同的时间长度 > 时间间隔每幅获取图像之间的时间间隔，设定为 10 min。
    3. 选择并输入相机设置 波长 > 光照: 明场 50% 相机 50%：黑白 > 自动曝光：每次采集 > 获取：每个时间点 > 自动对焦：从不.
    4. 将放大倍数设为20×，以获得665.6 µm × 665.6 µm视野范围的图像，确定用于采集生物膜图像的相机位置，并移动至通道观察区域的中央，通道编号将刻于中心位置。
    5. 添加载物台位置，使其被相机捕获，然后导航至 阶段 标记位置，然后选择添加按钮以将其添加到目录中。
      1. 对距通道观察区域入口上游0.9984 mm和下游3.0016 mm的位置重复此操作，其中该位置代表相机视场的中心点。
        注意：选择这些成像位置旨在展示观察区域内生物膜的生长情况，同时确保通道内的流动处于充分发展状态。因此，每条微通道采集三幅图像，本实验中每10分钟共采集18幅图像。
  7. 进行实验运行
    1. 在系统中 控制模块 窗口选择 自动运行 > 运行设置 > 序列：选择创建的0.01 Pa序列，然后选择 开始.
    2. 紧接着，转至 多维采集 窗口 > 获取这标志着24小时实验过程中每10分钟采集18张图像的开始，实验结束时共产生2610张图像。
      注意：上述步骤在初始实验约48小时后，在另外六个微通道中以相同条件重复进行。

10. Z轴堆叠图像采集

  1. 每次实验结束后，打开多维采集 > 主界面，仅保留“Z序列”选项并取消其余所有选项，选择三个通道，并在40×放大倍数下沿每个通道获取三个区域的z层扫描图像。
  2. 在多维采集中选定通道上的一个区域后，进入Z序列设置，修改 > 交互设置：步进：0.5，并取消勾选两个复选框。
  3. 使用显微镜调焦旋钮，旋转至生物膜刚好失焦为止，然后点击将顶部设为当前值以输入z轴距离。重复此操作，但向相反方向旋转调焦旋钮，并点击将底部设为当前值。此步骤为显微镜设定采集z层扫描图像的范围。
  4. 在保存窗口中选择一个文件夹用于保存z层扫描图像，然后点击窗口右下角的采集按钮以开始图像采集。

11. 实验后图像与数据分析

  1. 获取生物膜表面覆盖率的百分比数据。
    1. 通过以下步骤将采集的图像加载到系统软件中：分析工具 > 查看多维数据 > 选择基础文件 > 选择目录：导航并选择保存图像的文件夹 > 查看 > 波长1，在中央方形区域水平显示所采集图像数量的部分，右键单击左上角的小灰色方框。
    2. 逐个加载各通道部分的图像，选择 载物台位置：选择要查看的位置 > 加载图像。将图像序列另存为TIFF文件。
    3. 通过选择 图像阈值 > 暗对象自动阈值 对生物膜进行高亮，然后使用 矩形区域 工具对图像进行边界划定。
      注：阈值化图像左侧的滑块可上下移动，以调整阈值强度，从而更好地区分生物膜与背景。如果图像存在阴影，请划定无阴影区域，因为阴影可能已被默认高亮，从而影响测量值。
    4. 在系统软件窗口中选择 MM标准 > 测量 > 区域测量，以获取24小时实验期间图像中生物膜覆盖表面面积百分比的数据，生成包含矩形边界内高亮生物膜数据的表格，包括 阈值面积%。选择 打开日志 以打开并保存日志文件，并按 F9：记录数据 将数据输入日志文件。
    5. 打开电子表格，利用每个通道部分的24小时生物膜数据，绘制显示24小时内生物膜表面覆盖率百分比变化的图表。
  2. 获取生物膜厚度及算术平均表面粗糙度。
    1. 通过将保存的文件拖入Fiji（ImageJ）控制栏，将z轴堆栈保存至Fiji，并将其转换为8位图像：图像 > 类型 > 8位。
    2. 增强生物膜与通道表面之间的对比度，以消除任何不必要的噪声：图像 > 调整 > 亮度/对比度。
    3. 对图像进行阈值化处理，设定生物膜像素值为255（白色），背景像素值为0（黑色）：图像 > 调整 > 阈值。
    4. 设置图像比例尺：分析 > 设置比例尺 > 像素距离：2048 > 已知距离：332.8 > 像素纵横比：1.0 > 长度单位：µm。
      注：已知距离为332.8 µm，因为所用的Hamamatsu相机具有2048 × 2048像素的视野，每个像素大小为6.5 µm，且图像在40倍放大倍数下采集。
    5. 使用自定义宏18（补充文件1）分析z轴堆栈，该宏可计算并累加每个z轴切片上生物膜的表面积，并利用输入的比例尺值计算堆栈的厚度，从而得出体积。或者，可通过将计算出的体积除以表面积来获得生物膜厚度。
    6. 通过下载ImageJ（非Fiji）插件 SurfCharJ 并将其保存至 plugins 文件夹，获取每个z序列生物膜的算术平均表面粗糙度值。
    7. 通过将保存的堆栈拖入控制栏并将其转换为32位图像，将z轴堆栈上传至ImageJ：图像 > 类型：32位。
    8. 创建表面图，显示堆栈表面灰度值的变化：分析 > 轮廓图 > 更多：高分辨率图。将高分辨率图转换为32位。
    9. 启动SurfCharJ插件以获取算术平均表面粗糙度值：插件 > SurfCharJ > 粗糙度计算：平均采样长度 ()：10。
      注：SurfCharJ插件利用z轴堆栈表面的多种灰度值来计算算术平均表面粗糙度。将生成包含表面粗糙度参数的表格，其中唯一关注的参数是算术平均表面粗糙度Ra。需将表格中的像素值转换为微米（µm）。

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结果

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本部分概述了应用上述实验方案时的代表性结果。所有实验均至少进行了三次独立的生物学重复，每次包含六个平行通道，数据以均值 ± 标准差表示。所有图表中的误差线均代表标准差，具体定义见图注。

PAO1 和 PA14 菌株的生长 在37 °C、TSB培养基中、0.01 Pa流体动力壁面剪切应力条件下培养24小时的结果如图所示 图1图中显示，在实验初期，PAO1菌株在基质表面的定植比例高于PA14菌株。PAO1菌株较高的初始附着速率与现有文献一致，表明该菌株具有相对较快形成表面附着的表型特征19然而，在实验进行约11小时时，PA14占据的表面面积超过PAO1菌株，而PAO1菌株所定植的基质面积则开始下降。PAO1菌株基质定植减少可能归因于细胞脱落和/或细胞死亡。PA14占据较大比例的表面是该菌株逐代附着过程的特征，这解释了实验初期生物膜形成水平较低，而随着实验进行逐渐增加的现象。1在此交叉之后，PA14菌株对基质表面的定...

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讨论

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该方案中的多个关键步骤共同作用，相较于其他更传统的检测方法，能够实现对生物膜形成更为全面且准确的分析。其中关键环节之一是使用48孔微通道板，其微通道尺寸为350 µm × 70 µm × 4 mm（宽 × 高 × 长）。这些尺寸可特异性地模拟医院环境中存在的流动条件和微环境，例如尿道导管或囊性纤维化患者肺部细支气管中的情况。12,21,22,23每次实验运行设置六个平行通道，每项实验至少重复三次。由于细菌行为具有内在的随机性，这种重复对于确保数据的完整性至关重要。24,25通过精确复制这些微尺度条件并进行多次重复实验，本研究的发现对实际应用具有显著更高的相关性和适用性 在体 相较于使用少量重复和宏观通道获得的环境，该系统能提供更具代表性的环境。尽管如...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢谢菲尔德大学机械、航空航天与土木工程学院（MAC）提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(NH4)2SO4Acros Organics7783-20-2用于改良FAB培养基
48孔0-2 Pa微通道板 - 玻璃盖玻片Cell Microsystems910-0047-5Pack用于培养基流动和生物膜
生长的微通道，支持实时成像
-80 °C 冰箱Thermo Fisher Scientific1.16057E+15用于保存甘油菌种，以备后续使用
琼脂，细菌级Acros Organics443570010用于琼脂平板——细菌培养
分析天平VWRVWRI611-2297用于称量培养基各组分
高压灭菌器Priorclave4304用于玻璃器皿的灭菌
BioFlux 1000HTI&L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- microsystems/device/bioflux-1000ht-
shear-flow-system/ 		用于微通道中的流体流动和生物膜生长实验
BioFlux 控制模块I&L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
microsystems/device/bioflux-1000ht- shear-flow-system/ 		用于设置和监测微通道内的培养基流动和生物膜生长
BioFlux Montage 软件I&L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		用于设置和监测微通道内的培养基流动和生物膜生长
CaCl2Fisher Scientific10043-52-4用于改良FAB培养基
CaSO4.2H2OChemCruzA1719用于配制1 L最小金属溶液
透明聚苯乙烯96孔板Corning, CostarCLS7007用于活菌计数
CoSO4.7H2OSigma-Aldrich10026-24-1用于配制1 L最小金属溶液
CuSO4.5H2OHoneywell209198-100G用于配制1 L最小金属溶液
Eppendorf 管 3810XEppendorf30125150用于铜绿假单胞菌甘油菌种保存
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005E用于配制1 L最小金属溶液
Fiji (ImageJ)美国国立卫生研究院https://imagej.net/software/fiji/downloa
ds		用于Z轴堆栈图像处理
葡萄糖Sigma-Aldrich50-99-7用于葡萄糖改良FAB培养基
甘油Sigma-Aldrich56-81-5用于铜绿假单胞菌甘油菌种保存
H3BO3Fisher Scientific10043-35-3用于配制1 L最小金属溶液
Hamamatsu Orca-Flash 4.0 相机 型号 C11440-
42U		HamamatsuC11440-42U用于微通道流动和生物膜生长
实验的实时成像
KH2PO4Fisher BioReagents7778-77-04用于改良FAB培养基
甲基化酒精Sigma-Aldrich2857用于在使用前后清洁微生物操作柜
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G用于改良FAB培养基
II级微生物操作柜Thermo Fisher Scientific42111226用于在无菌条件下执行实验步骤，避免细菌、肉汤或琼脂被污染
小型培养箱Labnet Internationalsn03171014用于从-80 °C 冰箱中取出后解冻PAO1和PA14菌株
，以及初始24小时细菌琼脂平板培养
MnSO4.H2OSigma-Aldrich10034-96-5用于配制1 L最小金属溶液
Na2HPO4.2H2OSigma-Aldrich10102-40-6用于改良FAB培养基
NaClSigma-AldrichS5886-500G用于改良FAB培养基
NaMoO4.H2OSigma-Aldrich10102-40-6用于配制1 L最小金属溶液
精密天平VWRVWRI611-2299用于称量培养基各组分
冷冻离心机Heraeus40289841用于将铜绿假单胞菌培养物与
上清液分离以制备甘油菌种
半微量比色皿Alpha LaboratoriesX72053用于光密度测量
摇床培养箱INFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator- shakers/multitron-standard用于过夜培养
柠檬酸钠Sigma-Aldrich71498-250G用于柠檬酸钠改良FAB培养基
无菌塑料接种环Microspec15782105用于将铜绿假单胞菌PAO1和PA14接种至琼脂平板和Falcon管中
胰蛋白酶大豆琼脂，含vegitoneMillipore14432-500G-F用于琼脂平板——细菌培养
胰蛋白酶大豆肉汤Sigma-AldrichT8907脱水培养基 —— 6 g/200 mL
一级水分配器Thermo Fisher Scientificsn42103311用于提供去离子水
ZnSO4.7H2OFisher Scientific7446-20-0用于配制1 L最小金属溶液

参考文献

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