跨重建基底膜研究不同类型细胞间间接相互作用的三维共培养方法

摘要

本文详细介绍了一种简便的三维共培养方法，该方法通过重建的基底膜将两种细胞类型分隔开，所需专用设备较少，并可通过多种实验技术进行便捷分析。

摘要

三维（3D）共培养是一种快速发展的技术，适用于研究人员精确研究细胞间相互作用 体外 实验。通过模拟细胞与细胞外环境之间的相互作用及细胞形态的变化，可克服单层细胞培养的局限性，包括细胞与细胞外环境间相互作用有限以及细胞形态受到干扰等问题。 体内 细胞环境。利用支架提供结构支持，并加入具有生物活性的细胞外基质成分，三维培养体系所呈现的细胞行为和形态更接近真实组织。将多种细胞类型整合到此类三维环境中，可在仿生模型系统中研究细胞间的相互作用。目前已有多种三维共培养技术，各自具有优势与挑战。这些技术通常需要专用设备、复杂的操作流程或特定的技术知识。此外，针对被重建基底膜分隔的两种细胞类型之间的间接细胞间相互作用，目前标准化的研究方法仍较为有限。本文介绍一种三维共培养方法，仅需基本实验技能，使用更广泛适用的材料，即可成功模拟跨越基底膜的间接细胞间相互作用。该方法首先将一层细胞覆盖于细胞外基质（以Matrigel形式）之上，随后在基质层上方接种第二类细胞。共培养体系维持培养五天，之后可通过免疫荧光分析细胞形态变化，或从共培养体系中提取细胞进行更深入的基因组、转录组或蛋白质组分析。该实验方案特别适用于研究当细胞间因基底膜阻隔而无法直接接触时，细胞通讯对细胞行为的影响。随着研究人员持续倾向于采用更 体内相关 细胞培养方法需要一种简化的途径，以避免过高的入门门槛。

引言

体外 细胞培养是一种可靠、快速且广泛应用的研究技术。尽管传统的细胞培养方法功能强大，但其与真实生理环境存在显著差异 体内 环境。单层细胞培养的空间限制性会导致基因表达、形态学和生物化学的改变^1,2,3三维（3D）培养技术可解决这一差异，细胞在模拟器官和组织中细胞外基质（ECM）的支架中生长。在3D培养中，细胞表现出的形态和行为更接近于体内所观察到的情况 体内^4,5 然而，仅靠三维培养并不能完全重现一个组织的多种组分 体内 微环境，因为它缺乏其他细胞类型的贡献⁶.

细胞间的直接（细胞间接触）和间接相互作用在细胞行为中起着重要作用 在体内^7,8. 要重现这些相互作用，需要采用三维共培养模型，即将多种细胞类型共同培养于三维环境中。利用这些技术，可实现 体内类生长环境可以被建立 体外，提高结果的生物学相关性^9,10然而，特定实验所需的环境越精确，其方法学就变得越复杂。目前尚缺乏一种标准化的模型系统，可用于研究被基底膜基质分隔的细胞之间的细胞间相互作用。因此，本实验方案旨在以一种稳健且可重复的方式，模拟跨越基底膜基质的细胞间相互作用。该方案改编自先前建立的三维培养模型¹¹该技术利用一层Matrigel（下文简称ECM胶），在培养过程中将两种不同类型的细胞进行物理分隔，同时允许分泌因子通过。该方法最初设计用于研究脂肪细胞对间充质型乳腺癌细胞的间接影响，但可轻松改造以适用于多种细胞类型。在实验设计中应审慎评估该方法的适用性。此方法不允许细胞间的直接接触，因此应仅限于模拟细胞间非直接相互作用的场景 体内 涉及细胞通过基底膜基质进行间接通讯的场景。例如，该系统不适合用于模拟细胞毒性T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，因为这两类细胞通常直接接触。相反，应考虑那些在生理条件下基底膜天然分隔两种目标细胞类型的生物学场景。例如，该方法可用于研究肿瘤细胞在侵入血管前与血管内皮细胞之间的相互作用。

一种常见的替代性三维共培养方法涉及使用专用的微流控芯片，即"器官芯片（organ-on-a-chip, OoC）"。OoC 系统功能强大，可针对特定实验进行定制，但需要投入大量时间与资源用于芯片设计、材料选择、外围设备配置、系统优化及数据采集^12,13。此外，目前尚无标准化的材料或方法能够在提供基底膜基质生物学和物理信号的同时，又不干扰微流控系统的流体流动¹⁴。因此，将 OoC 技术应用于跨越基底膜的细胞间相互作用研究时面临更多挑战。本实验方案所描述的方法旨在提供一种标准化的替代方案，在保持生物学相关性的同时提升实验的可及性。

方案

本方案（图1A）介绍了一种三维共培养系统，旨在模拟细胞间通过基底膜基质的相互作用。该系统可进一步通过共聚焦显微镜进行下游分析（图1B），或从共培养体系中收获细胞进行分析（图1C）。本方案采用“三明治”结构，即将一层细胞外基质（ECM）凝胶置于两层细胞之间，无需特殊设备，仅需掌握现代细胞培养技术的基本知识即可操作。

1. 三维共培养体系的制备

注意：本方案旨在以3T3-L1脂肪细胞与MDA-MB-231乳腺癌细胞为例，展示三维共培养方法的代表性应用。若使用不同类型的细胞，则需优化细胞接种密度，并预先测试不同批次的细胞外基质（ECM）凝胶，以确保其有效性。本方案包含无脂肪细胞对照组和条件培养基对照组的设置。根据具体实验目的，可能还需增设其他对照组。

1. 细胞培养与溶液配制
   1. 获取并建立3T3-L1前脂肪细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞系的培养物。在II级生物安全柜中，采用无菌技术及标准贴壁细胞培养方法，分别独立培养和维持所有细胞。¹⁵. 在添加10%（v/v）新生牛血清（NBCS）和1%青霉素-链霉素（10,000 U/mL）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养3T3-L1细胞。在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（10,000 U/mL）的RPMI 1640培养基中培养MDA-MB-231细胞。
      ​注意：在维持培养期间，切勿使3T3-L1细胞融合度超过80%，且不可使用传代次数超过20代的细胞培养物。^th 传代次数
   2. 获取或配制含有 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 的 1×磷酸盐缓冲液（PBS）储备液₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4。
   3. 将0.375 g甘氨酸加入50 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制50 mL PBS-甘氨酸洗涤液，终浓度为100 mM甘氨酸。4 ˚C保存，可存放长达12个月。
   4. 加入50 µL Triton X-100 至9.5 mL PBS中，配制10 mL通透缓冲液。加液至10 mL，使Triton X-100终浓度为0.5%（v/v）。4 ˚C保存，1个月内使用。
   5. 通过将 50 µg 牛血清白蛋白（BSA）、100 µL Triton X-100 和 25 µL Tween-20 加入 45 mL PBS 中，配制 50 mL 免疫荧光（IF）缓冲液。加水定容至 50 mL，得到终浓度为 0.1%（w/v）BSA、0.2%（v/v）Triton X-100 和 0.05%（v/v）Tween-20 的溶液。4 ˚C 保存，1 个月内使用。
   6. 通过将1 mL动物血清加入9 mL IF缓冲液中，配制10 mL封闭缓冲液，使血清终浓度为10%。4 ˚C保存，1个月内使用。
      ​注意：血清的物种特异性取决于所用的二抗荧光抗体的宿主物种（见 2.2.4）。
   7. 在4 °C条件下过夜解冻ECM胶（总蛋白浓度约为9-9.5 mg/mL）。将500 µL分装至1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存。
      注意：ECM 胶具有高度变异性，必须验证其在每种细胞类型中是否可诱导出预期行为。不同细胞类型可能需要不同的蛋白浓度或基质硬度。
      注意：操作 ECM 胶时务必使用预冷的移液器吸头和容器，以避免在室温下发生聚合。操作过程中应始终将 ECM 胶置于冰上。
2. 脂肪细胞分化
   1. 在4孔板的2个孔中，分别接种50,000至80,000个3T3-L1前脂肪细胞，每孔加入0.5 mL标准生长培养基。空余的孔用于设置无脂肪细胞对照和条件培养基对照。
      ​注意：腔室载玻片细胞培养物易受机械干扰。避免使用真空抽吸法去除培养基，应使用手动移液器轻柔吹打。
   2. 在24孔组织培养板的一个孔中接种50,000至80,000个3T3-L1前脂肪细胞，加入0.5 mL标准生长培养基。该孔用于收集条件培养基，作为条件培养基对照。
   3. 使两种培养物在24小时内均达到100%汇合度。
   4. 通过更换为脂肪生成诱导培养基来启动脂肪生成，该培养基由添加了10%胎牛血清（FBS）、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和1 µM地塞米松的DMEM组成。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时。₂ 培养箱
   5. 48小时后，将用过的培养基更换为新鲜的脂肪生成促进培养基，该培养基由含10%胎牛血清和10 µg/mL胰岛素的DMEM组成。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下继续培养48小时。₂ 培养箱
   6. 在继续进行三维共培养之前，需通过肉眼确认脂滴的存在 >60% 的细胞。如果脂滴积累较慢，则将诱导分化培养基更换为添加了10% FBS的DMEM，并每24小时监测一次脂质含量。
3. 三维共培养的覆层与维持
   1. 在进行覆盖操作前，将ECM胶在4 °C下过夜解冻。
      ​注意：为了避免批次间差异的影响，建议在同一项研究中的所有实验使用同一批次的ECM胶。
   2. 3T3-L1细胞成功分化后，移除用过的培养基，保留约50 µL的培养基作为缓冲液。
   3. 向载玻片培养腔中每个含有脂肪细胞的孔内小心加入 110 µL 的 ECM 胶，注意不要扰动脂肪细胞单层。
      注意：ECM胶在室温下会迅速凝固。为防止基质过早聚合，应始终将ECM胶置于冰上，并使用预冷至-20˚C的移液枪头。
   4. 向无脂肪细胞的对照孔中加入 110 µL ECM 凝胶。为确保 Matrigel 均匀铺展，需逐滴加入孔的四个角及中央位置。用移液器吸头轻轻将 Matrigel 均匀涂布于培养表面，避免刮擦。
   5. 在37 °C下孵育载玻片1小时，使ECM凝胶聚合。
   6. 在此孵育步骤期间，收集并计数 MDA-MB-231 细胞
      可选：有关这些细胞的荧光标记细节，请参见步骤 1.4。
   7. 在含有2% ECM凝胶（v/v）的乳腺生长培养基中制备MDA-MB-231细胞的稀释悬液，浓度为30,000个细胞/mL。
      注意：最佳细胞接种密度因细胞类型而异，需在实验前进行优化。 注意：乳腺生长培养基是一种市售的细胞培养基，专为乳腺上皮细胞优化，含有0.4%牛垂体提取物、10 ng/mL表皮生长因子（重组人源）、5 µg/mL胰岛素（重组人源）和0.5 µg/mL氢化可的松。共培养培养基的选择必须谨慎，以满足两种细胞类型的生长需求。
   8. ECM凝胶聚合后，向每孔中轻柔加入450 µL MDA-MB-231细胞悬液，最终每孔细胞数为13,500个。
      注意：在此步骤中，细胞悬液在凝胶上的覆盖可能不均匀。应目视评估腔室侧面，并轻轻敲击腔室四周，以使液体均匀分布。
   9. 向24孔板中的脂肪细胞培养物中加入450 µL含有2% ECM凝胶（v/v）的乳腺生长培养基。每48小时收集并更换培养基。
   10. 共培养时间最长不超过5天，每48小时更换一次培养基。
       ​注意：避免使用真空抽吸，应轻柔吹打。在共培养维持过程中，可能出现细胞外基质凝胶脱落的问题。
   11. 仅针对条件培养基对照孔，在第2天和第4天更换共培养的耗尽培养基时，将收获的脂肪细胞（来自步骤1.3.9）的条件培养基用新鲜培养基按1:1比例稀释后使用。
       注意：此时共培养阶段已结束，需对培养物进行分析，可通过固定和染色以确定形态学特征和标志物表达（参见 第2节）或通过从共培养环境中提取细胞并制备用于后续分析的细胞（参见 第3节).
4. 荧光细胞标记（可选）
   ​注意：可在步骤 1.3.7 之前对标记的覆盖细胞进行染色，以帮助在免疫荧光成像过程中识别覆盖细胞。
   1. 将10 mg CFSE溶于4.22 mL DMSO中，配制5 mM的羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）储备液。分装为500 µL每份，于-20 °C避光保存。
   2. 在完成步骤1.3.6的细胞计数后，用5 mL PBS洗涤细胞一次。将所得细胞沉淀重悬于1×PBS中，调整细胞浓度至1,000,000个细胞/mL。
   3. 每毫升细胞悬液中加入1 µL的5 mM CFSE，使终工作浓度为5 µM。将细胞悬液于室温避光孵育20分钟。
   4. 加入5倍体积的培养基以终止CFSE染色，室温下再孵育5分钟。
   5. 离心收集细胞，用PBS洗涤两次以去除残留的CFSE。将细胞重悬于预热的乳腺生长培养基中，在室温下继续孵育10分钟，以确保无残留染料。
   6. 按照步骤1.3.7所述接种荧光标记的细胞。后续步骤可按所述进行。

2. 免疫荧光

1. 固定
   注意：为避免ECM凝胶去聚合及洗涤过程中样本丢失，请在使用前将所有试剂于室温平衡约30分钟。
   1. 共培养5天后，将培养基替换为500 µL PBS。
      ​注意：步骤2.1.2至2.3.7可在非无菌条件下进行。
   2. 移除PBS，加入新配制的含2%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，室温孵育10分钟。
      ​注意：ECM凝胶对PFA敏感，可能导致凝胶层脱落。
      ​警示：PFA会随时间分解为甲醛。避免吸入蒸气，确保通风良好，操作PFA时务必佩戴适当的个人防护装备（如手套、实验服、眼部防护）。
   3. 移除PFA，加入500 µL PBS-甘氨酸洗涤液，室温下轻柔振荡洗涤15分钟。
      注意：使用PBS-甘氨酸洗涤液对于防止游离醛基产生背景荧光至关重要。切勿使用不含甘氨酸的PBS进行洗涤。
   4. 重复步骤2.1.3两次，共洗涤三次。如需储存，请参见步骤2.1.5；若无需储存，则跳至步骤2.2.2。
   5. 此时可暂停实验流程，最多可保存1周，将玻片置于4 °C保存。保存时，向所有孔中加入1 mL PBS，并用一层薄Parafilm封住腔室玻片的盖子。将玻片平放于避光容器中，并置于湿润的柔软纸巾上，以确保培养物不会干燥。
2. 抗体染色
   1. 将先前保存的玻片恢复至室温，移除PBS，加入500 µL新鲜PBS，轻柔振荡洗涤15分钟。若直接从步骤2.1.4继续操作，则可跳过此步骤。
   2. 加入500 µL通透缓冲液，室温下静置孵育15分钟（无需振荡）。
   3. 加入500 µL PBS，轻柔振荡洗涤15分钟。重复两次，共洗涤三次。
   4. 向每孔加入500 µL封闭缓冲液，室温轻柔振荡孵育1小时。
      ​注意：确保封闭缓冲液中的血清来源物种与二抗的宿主物种一致。本方案中使用驴血清和驴源二抗。
   5. 根据生产商推荐浓度，将目标一抗用IF缓冲液稀释。移除封闭液后，向每孔加入300 µL稀释后的一抗溶液。
   6. 用Parafilm封住腔室玻片盖子，将玻片置于避光容器中，4 °C轻柔振荡过夜孵育。
   7. 加入500 µL IF缓冲液，轻柔振荡洗涤15分钟。重复两次，共洗涤三次。
   8. 根据生产商推荐浓度，将合适的荧光标记二抗用IF缓冲液稀释。向每孔加入300 µL稀释后的二抗溶液，室温轻柔振荡孵育1小时。
      ​注意：自此步骤起应避免长时间光照，以减少光漂白。
   9. 重复步骤2.2.7。
   10. 将300 µM的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）储备液用PBS按1:800稀释。向每孔加入300 µL，室温轻柔振荡孵育20分钟。
   11. 加入500 µL PBS，轻柔振荡洗涤5分钟。重复一次。
3. 玻片封片
   1. 尽可能移除残留PBS，同时避免扰动培养物。盖上盖子，使用腔室玻片制造商提供的工具将腔室与玻璃玻片分离。
   2. 使用柔软的擦拭纸小心擦拭玻片边缘，去除残留PBS，避免扰动ECM凝胶。
   3. 使用注射器和18G针头，沿玻片边缘缓慢挤入硅酮密封剂。静置3分钟使其固化。
   4. 在硅酮固化期间，向每孔加入1–2滴抗荧光淬灭封片剂，避免产生气泡。若形成气泡，可用移液器小心吸除，避免损伤培养物。
   5. 硅酮固化后，以较小角度缓慢放下盖玻片。使用镊子或移液器枪头在盖玻片下排出空气泡。施加轻微压力，避免压碎盖玻片。
   6. 将玻片置于室温避光容器中，静置过夜使其完全固化。之后可将玻片存于4 °C，实验流程可暂停最多1周。
      ​注意（可选）：为更好地密封玻片，可在加盖玻片1小时后，在盖玻片边缘涂一层透明指甲油。
   7. 使用共聚焦荧光显微镜在10–20倍放大倍数下成像。随机采集五个视野，以最小化操作者偏差。

3. 收获共培养物以进行下游分析

注意：收获细胞或生物分子与免疫荧光染色不兼容。建议将用于其他下游分析的共培养体系在标准的24孔培养板中进行培养，所用细胞浓度和体积应与第1和第2部分所述条件相同。

1. 细胞提取
   1. 移除用过的培养基，用预冷的 PBS 轻柔洗涤孔板。重复一次，共洗涤两次。
   2. 使用宽口移液枪头，向每孔加入 1 mL 预冷的细胞回收液（以下简称回收液）。轻柔吹打数次，以破坏 ECM 凝胶层。将液体转移至 1.5 mL 微量离心管中。
      ​注意：细胞回收液是一种市售的非酶解溶液，旨在温和释放嵌入 ECM 凝胶中的细胞。其成分为专有配方，可能与某些细胞类型不兼容。作为替代方案，可考虑使用温和蛋白酶（如 Dispase 或 Accutase）对 ECM 凝胶进行酶解去聚合。此方法需在 37 °C 下孵育，并优化孵育时间。
   3. 向每孔加入 250 µL 预冷的回收液，以收集残留的细胞。将液体转移至相应的微量离心管中。
   4. 将离心管倒置 4–5 次以混匀。
   5. 将离心管置于冰上，于 4 °C 轻柔振荡孵育 60 分钟。每隔 10 分钟，倒置离心管 2–3 次，以防止管内物质沉降。
   6. 在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟
   7. 确认可见细胞沉淀的存在。小心吸除上清液，加入 1 mL 预冷的 1x PBS。在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。重复一次，共洗涤两次。预计沉淀中包含最初接种细胞的 80–90%，且各细胞类型的比例保持不变。
      ​注意：此时可对细胞沉淀进行裂解，以提取蛋白质或核酸。裂解后的沉淀可保存于 -80 °C，本实验方案可在此暂停长达 3 个月。但裂解步骤与步骤 3.2 不兼容。
2. 单细胞悬液制备
   1. 将沉淀重悬于 200 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中，随后在 37 °C 孵育 3–4 分钟。
   2. 加入 600 µL 完全培养基以终止胰蛋白酶消化。
   3. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，加入 500 µL 室温 PBS。
   4. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。重复一次，共洗涤两次。
   5. 将沉淀重悬于 80 µL 含 0.04% BSA 的 PBS 中，使用 40 µm 细胞筛过滤悬液。
   6. 取 5 µL 悬液与 5 µL 台盼蓝混合稀释。在血细胞计数板上进行细胞计数并评估细胞活力。细胞现可用于后续分析。

结果

为了证明本方案在研究跨越基底膜的细胞间相互作用效应方面的有效性，图2 和 图3 改编自先前发表的研究（Pallegar 等人¹⁶），用作代表性结果。图4 和 图5 为新获得的数据，生成目的在于展示本方案适用于非乳腺癌细胞，以及从共培养环境中收获细胞并用于后续实验的能力。

采用该方法成功进行共培养后，可获得清晰的图像，其中目标细胞类型的独特形态特征可被测量和分析（图2）。根据所选共培养细胞的类型及其细胞间相互作用的程度，形态学变化可能有所不同。形态学变化通过比较属于不同形态学类群的细胞数量来进行量化。在乳腺癌细胞与脂肪细胞共培养的情况下，观察到间充质-上皮转化（MET）现象，因此构建的形态学分类也反映了这一变化。简言之，使用ImageJ软件，...

讨论

传统细胞培养中缺乏复杂的细胞间相互作用，凸显了建立更优的器官和组织模型的必要性，以更准确地研究药物反应和疾病进展的体内情况（in vivo）。三维共培养系统的发展在一定程度上弥补了这一不足，使得无需开展体内（in vivo）研究即可探究细胞间相互作用的后果^9,12。然而，许多此类方法在机械上较为复杂，建立过程需要大量资源、时间以及专业技术经验^10,12。相比之下，本方案采用标准化的实验技术，所需特定技术经验极少。此外，本方案所需的材料具有更广泛的适用性，很可能在本方法之外也具有应用价值。

该实验方案的关键在于利用一种具有生物学相关性的物理屏障——三维基质，将两种细胞分隔开来 。该基质不仅提供结构支持和多种生长信号，还有利于细胞间的间接相互作用⁹。目前已有多种...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔组织培养板	Corning	3524
24 × 60 mm 盖玻片	Ultident Scientific	170-C2460
PBS中4%多聚甲醛	Invitrogen	J61899.AK	用1×PBS稀释至2%
4孔腔室载玻片	Falcon	354114
Alexa Fluor 647标记的AffiniPure Fab片段驴抗山羊IgG（H+L）	Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.	705-607-003
亮线血细胞计数板	Hausser Scientific	3120
CellTrace CFSE细胞增殖检测试剂盒	Invitrogen	C34570
细胞回收溶液	Corning	354253
DAPI	Sigma-Aldrich Canada Co.	D9542
驴抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 594标记	Invitrogen	SA5-10168
驴抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647标记	Invitrogen	A31573
DMEM/F-12，无酚红	Gibco	21041025
杜尔贝科改良伊格尔培养基（高糖型，含丙酮酸钠）	Gibco	11995-065
胎牛血清，加拿大来源	Gibco	12483-020
Flowmi细胞筛，40 µM	Bel-Art	136800040
GE高级硅胶门窗密封胶，透明	Henkel International	2811093
山羊多克隆抗ZO-1抗体	SantaCruz Biotechnology	SC8146	一抗，已停产
大鼠单克隆抗ZO-1抗体	SantaCruz Biotechnology	SC33725	替代一抗，用于替代已停产的SC8416抗ZO-1抗体
乳腺上皮细胞基础培养基	Promocell	C-21210
Matrigel，无酚红，生长因子减少型，无LDEV	Corning	356231	蛋白浓度：9–9.6 mg/mL
小鼠单克隆抗波形蛋白抗体	Sigma-Aldrich Canada Co.	V2258	一抗
新生牛血清，新西兰来源	Gibco	16010159
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Gibco	10010023
ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36934
纯化的小鼠抗E-钙黏蛋白抗体	BD Biosciences	610181	一抗
兔多克隆抗Claudin 7抗体	Abcam	AB27487	一抗
RPMI 1640培养基（含谷氨酰胺）	Gibco	11875-093
补充剂混合液	Promocell	C-39115
台盼蓝染液（0.4%）	Gibco	15250-061
胰蛋白酶0.25%-EDTA	Gibco	25200056