用于测定和分析柑橘果皮提取物中总酚类和黄酮醇类物质的整合微孔板与高效薄层色谱策略

摘要

本研究提出了一种结合AlCl₃/Folin–Ciocalteu的方法，用于柑橘类果皮中黄酮醇/5-羟基黄酮及酚类化合物的高效薄层色谱（HPTLC）分析与定量，并辅以微孔板分析。

摘要

酚类化合物和黄酮类物质对柑橘副产物的抗氧化活性及功能价值具有重要贡献。然而，常规的比色法检测虽然应用广泛，但缺乏色谱分离步骤，易受到化学干扰的影响。本实验方案介绍了一种整合分析流程，将微孔板分光光度法与高效薄层色谱（HPTLC）相结合，用于测定和分析柑橘果皮提取物中的总酚含量（TPC）以及总黄酮醇加5-羟基黄酮含量（TFHC）。采用96孔微孔板格式，分别通过福林-酚（Folin–Ciocalteu，FC）法和氯化铝（AlCl₃）法测定青柠（Citrus aurantifolia）和蜜橘（Citrus reticulata）果皮的乙醇提取物，并随后采用两种连续流动相系统及双重色谱后衍生化方法进行HPTLC分析。微孔板检测结果显示，青柠和蜜橘的TPC值分别为74.2 mmol/g和72.8 mmol/g，TFHC值分别为15.5 mmol/g和6.0 mmol/g。HPTLC分离在青柠中分辨出4个酚类条带，在蜜橘中分辨出6个条带。经AlCl₃衍生化后，青柠中的两个条带被特异性显色，符合黄酮醇或5-羟基黄酮的特征。HPTLC估算的酚类条带总含量在青柠和蜜橘中分别为22.0 mmol/g和20.8 mmol/g干重，TFHC在青柠中达到13.4 mmol/g，而在蜜橘中未检出。这些结果表明，微孔板检测可快速、灵敏地估算总含量，而HPTLC通过化合物分离及官能团特异性衍生化显著提高了选择性。该联合策略实现了高通量筛选与色谱确证的结合，为复杂植物基质中植物化学成分的表征提供了一个实用且可重复的技术平台。

引言

柑橘类果皮是果汁工业的副产品，已被证实含有抗氧化剂等功能性化合物¹。它们已被用作神经保护性食品²、抗炎和抗痤疮的药妆品³，以及食品添加剂⁴。这些生物活性中的许多归因于黄酮类化合物⁵和酚类化合物⁶。文献中已建立了多种用于测定总黄酮和总酚含量的通用方法⁷，其中最常见的是采用福林-酚法（Folin-Ciocalteu）测定总酚含量（TPC）⁸，以及采用氯化铝法通过分光光度法测定总黄酮化合物（TFC）⁹。福林-酚法于1927年首次发表¹⁰，该方法基于对福林-丹尼斯反应（Folin-Denis）的改进¹¹，两者均依赖于磷钨酸-磷钼酸化合物的氧化还原反应。福林-酚法测定的是酚类化合物的还原能力¹²。氯化铝与黄酮类化合物的检测方法最早于1960年提出，其原理基于金属离子与黄酮配体之间形成的络合物¹³。

两种分光光度法测定均为估算和比较植物材料中常见植物化合物总体含量的有用工具。然而，这些方法存在多种局限性。例如，某些局限性源于使用外部标准品¹⁴，通常假设标准品的化学性质不会显著影响信号响应。但在实际中，这一假设难以验证，因为摩尔吸光系数依赖于共轭体系及其他结构特征等因素，而这些因素在天然产物中难以标准化。例如，Appel 等人¹⁵对11种橡树物种的总酚含量（TPC）进行了评估，并提出了所谓的“自标准”方法，发现校准曲线斜率差异超过50%。自标准方法是一种旨在代表样品中相同化合物组成混合物的策略，从而更准确地反映样品中实际的总酚含量（TPC）¹⁶。自标准品还可提供有关反应基团比例和平均分子量的一些信息；然而，该方法操作繁琐且难以标准化。

近年来的研究已对基于氯化铝络合反应的总黄酮化合物测定方法进行了深入评估^17,18，结论指出AlCl₃仅与两类黄酮化合物特异性形成络合物：黄酮醇类和5-羟基黄酮类。通常，黄酮醇类在约440 nm处呈现最大吸收峰，而5-羟基黄酮类则在415 nm附近吸收。此外，某些黄酮类化合物即使未经衍生化处理，也可能在415–440 nm范围内表现出固有吸光度，且不同化合物在形成络合物后吸光度的增强程度各异。更重要的是，这两种比色测定法均缺乏分离能力，因而无法区分不同的酚类成分；尽管这一特性在估算总含量时可能具有优势，但其特异性有限。上述因素凸显了建立一种分析策略的必要性，即在比色检测前先分离各组分，从而将真实的测定响应与光谱或化学干扰区分开来。

尽管存在这些局限性，此类检测方法仍是筛选植物和水果提取物中生物活性酚类化合物的有价值工具¹⁹。为评估潜在干扰，可采用高效薄层色谱法（HPTLC），该方法分别使用Folin–Ciocalteu试剂和AlCl₃试剂进行显色，是一种有效的解决方案。色谱分离能够检测在络合反应发生前已具有吸收带的干扰物质，而摄影记录技术则可实现对多个吸收峰的同时分析。此外，与HPLC–MS/MS等更复杂的色谱技术相比，HPTLC分析具有多项优势，包括溶剂消耗量更低、由于可同时处理多个样品（每块板最多18个样品）而显著缩短分析时间²⁰，以及通过色谱后衍生化反应的选择性，更便于解析复杂混合物的组成²¹。

本研究提出了一种综合方案，用于测定柑橘果皮提取物中总多酚含量（TPC）以及总黄酮醇和5-羟基黄酮类化合物（TFHC）的具体组分，该方案结合了高效薄层色谱（HPTLC）分离技术，并采用微孔板比色法进行总体含量的初步估算。采用福林-酚试剂（Folin–Ciocalteu）对酚类化合物进行平面色谱定量分析，而氯化铝衍生化则专门用于黄酮醇和5-羟基黄酮类化合物对应色谱带的定性鉴定。在此方法中，TFHC的测定依赖于经色谱分离并经化学确认的化合物对福林-酚试剂的响应，而非依赖氯化铝络合反应进行定量。HPTLC分析可实现化合物特异性的分离与可视化，有助于鉴定单个酚类组分，并检测潜在的光谱干扰。此外，本文还介绍了一种基于微孔板的分光光度法，用于快速估算总TPC和TFHC含量，为复杂植物基质提供一种互补的高通量筛选工具。

方案

1. 果皮的制备

1. 从每种水果中取约 50 g 果皮，并与可食用部分分离。在本研究的代表性结果中，柑橘购自当地商店（从智利进口，Isabelline 品种），青柠采自哥斯达黎加圣何塞附近的一棵树上（凭证标本 JVR-16434）。
2. 将果皮放入塑料自封袋中，在 -20 °C 下冷冻至少 2 小时。
3. 将冷冻的果皮转移至预冷的冷冻干燥机中，保持袋子敞开，施加真空（0.1 mbar）过夜，直至完全干燥。
4. 使用刀片研磨机将每种干燥材料研磨至粒径约 0.1 mm。

2. 提取

1. 称取约 100 mg 干燥的研磨柑橘果皮（青柠或橘子），置于 15 mL 玻璃试管中。
2. 向试管中加入 3 mL 60% 乙醇。
3. 将混合物在超声水浴中于 40 °C 超声处理 10 分钟，以破坏植物细胞并促进植物化学物质的释放。
4. 在 850 × g 条件下离心样品 10 分钟。
5. 使用巴斯德移液管小心地将乙醇上清液转移至 10 mL 容量瓶中，避免扰动沉淀物。
6. 向含有湿润固体残渣的试管中再加入 3 mL 60% 乙醇。
7. 重复步骤 2.3 和 2.4 中所述的超声和离心步骤。
8. 将上清液转移至同一容量瓶中，与前次提取液合并。
9. 通过重复前述步骤（2.6–2.8）进行第三次提取。
10. 向合并后的提取液（约 9 mL）中加入两滴 0.1 mol/L HCl 进行酸化（以提高花青素及其他酚类化合物的稳定性），再用甲醇定容至 10 mL。
11. 每份样品均需重复该操作三次。

3. 采用微孔板分光光度法测定总黄酮醇和5-羟基黄酮含量（TFHC）

1. 制备槲皮素储备液（100 µg/mL）或等效的黄酮类标准品。
   1. 使用精度为0.1 mg的天平称取10 mg槲皮素。
   2. 将槲皮素溶于约5 mL的95%乙醇中，并将溶液转移至标记为储备液的10 mL容量瓶中。
   3. 用2 mL的95%乙醇冲洗烧杯两次，并将洗涤液一并加入容量瓶中。
   4. 用60%乙醇定容至刻度线。
   5. 根据表1在1.5 mL微量离心管中配制标准溶液（10–100 µg/mL）和空白样。
   6. 确保所有样品和标准品的吸光度值处于0.2–0.8范围内，必要时调整浓度。
   7. 按照图1所示，向每孔中加入60 µL空白样、样品或标准品，完成微孔板布局。每个样品或标准品设三个重复孔。
   8. 将2%氯化铝水溶液、5%乙酸钠水溶液和80%甲醇分别加入不同的试剂储液槽中。
      注意：操作氯化铝和含甲醇溶液时应小心。氯化铝溶液具有刺激性，甲醇可通过摄入、吸入和皮肤吸收产生毒性。避免接触皮肤和眼睛，并穿戴适当的个人防护装备。
   9. 使用8通道多通道移液器，向每孔中依次加入10 µL AlCl₃溶液、10 µL乙酸钠溶液和200 µL 80%甲醇。
   10. 以中等强度振荡微孔板10秒，随后在避光条件下孵育30分钟。
   11. 在415 nm波长下测定吸光度。若无振荡设备，可在孵育前使用微量移液器手动混匀（图2）。
   12. 根据标准曲线插值计算样品的吸光度值，并根据需要应用稀释倍数、体积和质量校正因子。

表1： 总黄酮醇和5-羟基黄酮含量（TFHC）标准曲线所用槲皮素标准品的用量。 请点击此处下载该表格。

图1： 总黄酮醇和5-羟基黄酮含量（TFHC）微量滴定板分析的板式布局。 （A）微量滴定板示意图。（B）Gen5软件板式设计程序。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：用于总黄酮醇和5-羟基黄酮含量分析的微孔板软件设置。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 采用微孔板分光光度法测定总多酚含量（TPC）

1. 制备没食子酸标准曲线（0.000–0.120 mg/mL）。
   1. 使用分析天平称取约 0.0123 g 没食子酸（纯度 98%），并用蒸馏水溶解。
   2. 将溶液转移至 10 mL 容量瓶中，冲洗两次，并用蒸馏水定容至刻度，得到储备液。
   3. 取 1 mL 储备液用蒸馏水稀释至 10 mL，制备工作液。
   4. 根据表 2进一步稀释工作液，制备校准标准品。
   5. 若吸光度值超出 0.2–0.8 范围，需调整浓度。
   6. 将市售福林-酚试剂用蒸馏水按 1:14 比例稀释，配制福林-酚工作试剂。
      注意：福林-酚试剂和盐酸溶液具有腐蚀性，避免飞溅和直接接触。应在通风橱内操作试剂。
   7. 按照图 3A的布局，使用多通道移液器将每种样品、标准品或空白样各 30 µL 加入 96 孔微孔板中，每个样品设三个重复。
   8. 使用多通道移液器向每孔加入 215 µL 福林-酚工作试剂。
   9. 向每孔加入 50 µL 20% 碳酸钠溶液，并用微量移液器充分混匀。
   10. 将微孔板在 40 °C 下振荡孵育 20 分钟（图 3B）。
   11. 在 755 nm 处测定吸光度。

表2：总酚含量（TPC）标准曲线所用没食子酸标准品的用量。 请点击此处下载该表格。

图3： 总酚含量（TPC）微孔板分析的微孔板布局与软件设置。（A）布局。（B）软件程序。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 高效薄层色谱分析所采用的通用条件

1. 标准曲线
   1. 按照上述第3节和第4节所述方法，分别配制槲皮素和没食子酸的储备液（浓度均为100 µg/mL）。
   2. 将没食子酸分别以2、4、6、8、10和12 µL的体积点样至六个点样通道中。
   3. 分别取5 µL没食子酸和槲皮素，点样于不同的通道中用于鉴定。
2. 薄层板布局：
   1. 使用尺寸为10 × 20 cm、以铝箔为基底的硅胶60 F₂₅₄薄层色谱板作为固定相。
   2. 设置点样参数如下：Y位置7.0 mm，条带长度6.0 mm，起始X位置14.0 mm，通道间距9.4 mm。
   3. 使用氮气作为喷雾气体，每条带点样10 µL提取物。
   4. 设定溶剂前沿迁移距离为70 mm。
3. 薄层板展开：
   1. 将薄层板置于手动展开室中，加入40 mL流动相进行展开；在展开室内放置与流动相接触并紧贴器壁的滤纸，以促进流动相蒸气对展开室环境的饱和，饱和时间约10分钟。
   2. 使用MP1或MP2作为流动相进行展开，必要时进行二次展开。流动相1（MP1）由乙酸乙酯:甲酸:乙酸:水（100:11:11:26）组成；流动相2（MP2）由甲苯:乙酸乙酯:甲酸（5:4:1）组成。
      注意：HPTLC板应在通风橱中展开。流动相组分（乙酸乙酯、甲苯、甲酸和乙酸）具有挥发性，且甲苯和乙酸乙酯高度易燃。应避免吸入蒸气，并消除任何点火源。
   3. 将展开后的薄层板在室温下自然干燥。
4. 衍生化处理
   1. 用福林-酚试剂（300 µL试剂 + 600 µL 50%乙醇）均匀喷雾薄层板，用加热枪短暂吹干后，再喷雾1 mL含10%碳酸钠的50%乙醇溶液。
   2. 另取其他薄层板，单独喷雾含1%三氯化铝的50%乙醇溶液。
5. 用加热枪均匀加热薄层板，直至显色稳定且板面完全干燥。

6. 高效薄层色谱法测定总黄酮醇和5-羟基黄酮含量（TFHC）及总酚含量（TPC）的分析方法开发

1. 将样品以三份平行样上样，并设置没食子酸和槲皮素参考样道（用于鉴定，如步骤5.1.4所述）。
2. 使用MP1展开薄层板。
3. 再次使用MP2展开薄层板。
4. 按照前述方法，使用FC试剂对薄层板进行衍生化处理。
5. 分别在白光照射以及254 nm和366 nm紫外光照射下对薄层板进行拍照记录。
6. 重复该实验流程，将最后一步替换为AlCl₃衍生化处理，如图4所示。

图4：通过高效薄层色谱法（HPTLC）分析总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFHC）的VisionCats步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

提取条件
此处所述的通用提取方案采用60%乙醇，如先前报道²²。当外推至其他植物来源时，可根据溶剂极性和提取循环次数优化提取条件。关于溶剂选择和循环次数的系统性依据已在其他文献中详细阐述¹⁶。溶剂的选择可参考已有文献和极性指数；通常推荐使用乙醇或甲醇的水-有机混合液，以及丙酮。最佳提取循环次数（n）可通过将固定的10 mL总体积分成1–5次循环（每次10/n mL）进行评估，随后合并各次提取的液体提取物。通过统计学方法比较不同提取循环次数的效率，以确定在总酚含量（TPC）测定中产生最大吸光度的条件。

微孔板与高效薄层色谱定量分析
微孔板检测和高效薄层色谱（HPTLC）分析的标准校准曲线见图5。采用没食子酸作为参比化合物，分别建立了Folin–Ciocalteu微孔板法测定总酚含量（TPC）以及使用相同试剂衍生化HPTLC板的校准曲线。选择没食子酸不仅因其是TPC定量中最常用的参比标准之一，还因为其可在与青柠和柑橘样品相同的流动相条件下被洗脱。研究也评估了槲皮素作为HPTLC检测潜在标准品的可能性；然而，该化合物在此色谱体系中与溶剂前沿共洗脱，无法实现可靠定量，因此不适用。尽管如此，总黄酮醇和黄酮含量（TFHC）的测定仍采用槲皮素作为参比标准，因为没食子酸不属于黄酮醇或5-羟基黄酮，不能与氯化铝形成有色络合物。

图5：青柠、柑橘、没食子酸和槲皮素的高效薄层色谱板，依次使用MP1和MP2展开，并分别用氯化铝（AlCl₃）和福林-酚试剂（FC）进行显色衍生化。图中显示的是经AlCl₃衍生化后的色谱图谱。缩写：FC，福林-酚试剂衍生化；AlCl₃，氯化铝衍生化；W，白光照射；366，366 nm紫外光照射。请点击此处查看该图的高清版本。

总酚含量（TPC）和总黄酮及羟基肉桂酸含量（TFHC）的结果见表3。与预期一致，TFHC值显著低于TPC值，在青柠样品中约低五倍，在柑橘样品中约低十二倍。

表3：采用微孔板法测定的柑橘和青柠总酚含量结果。 缩写：Abs：吸光度，CV：变异系数，DF：稀释倍数，GAE：没食子酸当量，IR：独立重复，QE：槲皮素当量，Rep：重复次数，SD：标准偏差，TFHC：总黄酮醇及5-羟基黄酮化合物，TPC：总酚含量，以及 平均值。*基于干物质计算。 请点击此处下载该表格。

同样，HPTLC 分析获得的结果总结于表4中。色谱分离可使对应于不同化合物的各个条带得以显现。在青柠样品中检测到四种酚类成分，在柑橘样品中检测到六种。这些条带均未与所用参比标准品（没食子酸和槲皮素）的保留因子相匹配，该结果符合预期。

表4：总酚含量测定结果及使用AlCl₃衍生化后HPTLC显示的对应AlCl₃的化合物条带。 请点击此处下载该表格。

表4 还报告了通过高效薄层色谱（HPTLC）分析估算的总酚含量，该值计算为色谱法检测到的各个化合物含量之和（类似于总酚含量TPC）。此外，该表还包括被指认为黄酮醇或5-羟基黄烷的条带（在酸橙中Rf值为0.46和0.62；在柑橘中未检测到）的累积含量。这些条带经AlCl₃衍生化后呈黄色，在366 nm紫外光照射下显示黄绿色荧光。然而，如图5所示，在衍生化之前未观察到可见的颜色变化。

在高效薄层色谱（HPTLC）分析中，福林-酚试剂（Folin-Ciocalteu，FC）衍生化可全面检测酚类化合物，尽管可能存在轻微干扰。此外，氯化铝（AlCl₃）衍生化可选择性地对部分黄酮类化合物进行显色。联合使用这两种试剂有助于提高方法的标准化程度，并减轻单一方法固有的某些局限性。值得注意的是，非黄酮类化合物同时在FC试剂下呈现特征性蓝色、并在AlCl₃试剂下显示黄-红色吸收的可能性极低。此外，若某些原有生色团在衍生化前即以相同强度可见，则可将其排除为干扰因素。

如图5所示，青柠提取物在Rf值为0.62和0.46处显示出两条谱带，这些谱带在未展开的薄层板上无法检测到，但在经Folin–Ciocalteu（FC）和AlCl₃衍生化后变得清晰可见。该行为支持其黄酮类化合物的性质，可能对应于新橙皮苷（neoeriocitrin）和橙皮苷（hesperidin）²³。在青柠中还观察到Rf值为0.21和0.37的其他酚类成分，而在柑橘中则观察到Rf值为0.36、0.39、0.42、0.46、0.54和0.89的酚类成分。这些谱带在FC衍生化后可被检测到，但在AlCl₃处理后不可见，提示它们可能属于非黄酮类酚类化合物。根据文献报道，柑橘中主要的非黄酮类酚类化合物包括绿原酸（chlorogenic acid）和反式阿魏酸（trans-ferulic acid）^24,25。在青柠中，先前报道的其他化合物还包括香豆酸（coumaric acid）和二羟基阿魏酸（dihydroxyferulic acid）²³。然而，上述成分的鉴定仍需通过更多标准品进行进一步分析以确认。

高效薄层色谱流动相比较
两种流动相均是在先前报道的体系基础上进行改进而得到的^26,27,28。与MP2相比，极性更强的流动相（MP1，图6A）对酚类成分提供了更优的分离效果。相比之下，极性较弱的流动相（MP2）（图6B）能够在同一色谱运行中同时保留样品组分和对照标准品。然而，在MP2条件下，样品组分的Rf值相对较低，部分化合物仍停留在原点附近，如图6所示。为克服这一局限，采用了先使用MP1、再使用MP2的二次展开程序。该策略不仅改善了样品组分的迁移和分离分辨率，还可在相同色谱条件下于同一薄层板上以没食子酸标准品进行定量分析。槲皮素在AlCl₃处理前呈微弱的黄色，衍生化后颜色增强。对于青柠和蜜柑提取物，在原点处除有一条带外，还观察到两条明显不同的条带。此外，经AlCl₃衍生化后，出现了一条Rf值为0.14的黄色条带，清晰可见。

图6： 青柠、柑橘、没食子酸和槲皮素的高效薄层色谱板，分别使用流动相1（A）和流动相2（B）展开。 每块板从左至右的条带依次对应：展开后未衍生化样品、福林-酚试剂衍生化样品和AlCl₃衍生化样品。图像在白光照射下进行观察。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

样品采集与储存是确保植物化学分析完整性的关键步骤。采集后，样品应置于冷藏条件下运输，并尽快进行冷冻干燥，以最大限度地减少降解。尽管干燥的生物材料通常较为稳定，但溶液中的提取物则明显更不稳定，即使在冷藏条件下储存亦是如此。因此，分析测定最好在 freshly prepared 提取物上进行。长期储存，即使在低温避光条件下数天，或在室温下数小时，也可能导致色谱图谱出现可观察到的变化，包括条带强度的改变以及沉淀物的形成。这些变化通常与氧化、水解或络合反应等化学转化过程相关。因此，所有试剂和提取物均应于低温避光条件下储存和操作，以保持其化学稳定性。

比较两种技术（表3 和 表4）时，可明显观察到系统性的定量差异。在青柠和柑橘中，微孔板法测得的总酚含量（TPC）值均约为高效薄层色谱法（HPTLC）所测值的三倍。在青柠中，微孔板法测得TPC为74.2 mmol/g，而HPTLC法测得为22.0 mmol/g干物质（DM）；总黄酮醇含量（TFHC）分别为15.5 mmol/g和13.4 mmol/g。在柑橘中，微孔板法测得TPC为72.8 mmol/g，而HPTLC法测得为20.8 mmol/g。对于TFHC，微孔板法结果为6.0 mmol/g，而HPTLC未检测到相应的条带。

这些差异可通过每种方法的内在局限性和响应机制来解释。福林-酚法（Folin–Ciocalteu，FC）测定不仅与酚类化合物反应，还可能与其他非酚类还原性物质发生反应，包括抗坏血酸、酪氨酸、甲酸和乙酸²⁹，以及其他低分子量还原剂。这些化合物会贡献总体的分光光度信号，可能导致总酚含量（TPC）被高估。此外，在微量滴定板测定中，即使某些微量酚类成分的个体浓度过低，无法在高效薄层色谱（HPTLC）中产生明显且可定量的条带，它们仍可能共同增加总吸光度。一些分子量较小或极性较强的代谢物也可能在所采用的色谱条件下无法被有效保留、分离或显色。

图7： 黄酮醇和5-羟基黄酮与AlCl₃形成的配合物的示意图。（A） 黄酮醇和（B） 5-羟基黄酮。请点击此处查看此图的放大版本。

检测化学方法的差异进一步导致了观察到的变化。FC反应由于试剂被还原，会引起吸光度显著增加，从而具有较高的分析灵敏度。相比之下，AlCl₃法特异性较弱，依赖于与某些黄酮类化合物形成络合物。黄酮醇通常在约410 nm处呈现最大吸收，而5-羟基黄酮的吸收峰则在440 nm附近¹⁸，其与Al³⁺形成的络合物如图7所示。然而，络合后吸光度的增加相对较小，使得AlCl₃测定法更容易受到样品基质中色素成分（包括黄酮类化合物本身）的干扰。

尽管存在这些局限性，FC 与 AlCl₃ 衍生化在高效薄层色谱（HPTLC）中的联合使用仍代表了一种强大的互补性酚类分析策略。该方法结合了FC反应的高灵敏度以及AlCl₃络合与色谱分离所提供的结构区分能力。此外，已知多种黄酮醇在紫外照射下会呈现特征性的黄绿色条带³⁰，可进一步支持化合物的分类与确证。

微孔板方法在高通量筛选中具有显著优势。该方法所需的样品前处理步骤极少，试剂消耗量低，并可同时分析数十个样品。在常规实验室条件下，使用广泛可用的仪器可在约4小时内完成一次完整的微孔板检测。这些特点使微孔板检测非常适用于快速比较研究、常规质量控制以及对大量样品集的初步评估。相比之下，高效薄层色谱法（HPTLC）耗时更长且劳动强度更大，完整的分析流程通常需要7–8小时。此外，该方法依赖于某些可能并非所有实验室都具备的专用仪器，且专用板和衍生化试剂的使用增加了单次分析的成本。另一个局限性在于，在标准显色条件下，浓度极低的代谢物可能无法被检测到。然而，这些在实际操作和灵敏度方面的局限性，可通过色谱分离这一关键优势得到弥补^30,31。HPTLC能够分离复杂植物基质中的各个组分，确认检测信号的真实性，并检测潜在的干扰化合物。此外，选择性的色谱后衍生化反应可简便地将化合物按官能团分类（例如黄酮醇和5-羟基黄酮），从而在化学解析方面超越仅对总含量进行估算的层次。

因此，在大规模研究中，分析流程可首先采用微孔板检测法，快速鉴定出目标化合物水平升高的样品。随后对所选样品进行高效薄层色谱（HPTLC）分析，通过双重衍生化来可视化各个组分、评估选择性并评价可能的干扰。这种整合策略（如图8所示）将检测速度与高通量优势，同化学特异性和结构信息分析相结合。

图8：样品筛选与分析的建议工作流程。（A）对大量样品进行高通量微孔板筛选。（B）对选定样品进行高效薄层色谱（HPTLC）分析，采用福林-酚法（Folin–Ciocalteu method）进行定量，并通过AlCl₃衍生化鉴定黄酮醇和5-羟基黄酮。 请点击此处查看该图的放大版本。

与高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（HPLC–HRMS）——文献中报道的最常见替代方法——相比，高效薄层色谱（HPTLC）在单个化合物的检测灵敏度和结构确证方面具有无可比拟的优势³²。然而，HPLC–HRMS 分析本身速度较慢，因为每次色谱运行必须依次进行，且在仪器设备、溶剂纯度要求和溶剂消耗方面涉及更高的成本。此外，化合物官能团类别筛查通常需要复杂的数据处理和针对特定化合物的解析，而 HPTLC 在衍生化后可实现化合物的直接可视化归类。因此，HPTLC 在快速微孔板筛查与全面的 HPLC–MS 分析之间提供了一个有效的中间平台，在通量、成本和化学选择性之间实现了良好平衡。

黄酮类和酚类物质分析在食品科学、营养保健品、制药、农业和材料研究领域具有广泛的应用。在食品科学中，该分析用于评估果汁、葡萄酒和茶等产品的抗氧化能力、真实性、保质期和质量控制，同时也支持农学研究，例如根据酚类成熟度确定最佳采收时间³³。在营养保健品领域，酚类成分分析对于植物提取物及商品化产品的标准化和质量保证至关重要，例如绿茶提取物胶囊、葡萄籽提取物补充剂、槲皮素片剂和柑橘类生物类黄酮制剂。在药物和生物医学研究中，此类分析有助于筛选具有抗氧化、抗炎和抗菌潜力的生物活性化合物⁶。在农业与植物生理学中，酚类物质的测定有助于评估植物对胁迫的响应，并指导作物改良策略。此外，在材料科学领域——特别是在植物源腐蚀抑制剂的研究中^34,35——酚类物质的表征有助于将化学组成与吸附行为及防护效率相关联。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	Eppendorf
10 mL 容量瓶	Eisco Labs	CH0451B	带 10/19 聚丙烯塞、硼硅酸盐玻璃、琥珀色 – 白色刻度线，容差 ±0.025 ml
100 µL 和 1000 µL 移液器吸头	通用
100–1000 µL 移液器	Eppendorf	Research Plus
10–100 µL 移液器	Eppendorf	Research Plus
15 mL 带盖玻璃管	通用
50 mL 烧杯	通用
8通道多通道移液器	ThermoSciecntific
96孔微孔板	Greiner	655891	聚环烯烃材质，玻璃底，黑色
分析天平			±0.0001 g
自动薄层色谱点样仪	CAMAG	ATS4
离心机	ThermoSciecntific	Sorvall ST8R	≥850 × g
滤纸	Whatman		用于层析缸饱和
冷冻干燥机	LABCONCO	Model 10
塑料试剂储液槽	Eppendorf
一端平头一端勺形的药匙	Merck chemicals	HS15906
Synergy HT 多功能微孔板检测仪	BioTek Instruments	Synergy HT
薄层色谱硅胶 60 F254 铝基板（10 × 20 cm）	Merck
薄层色谱喷雾器	Sigma-Aldrich		20 mL
薄层色谱观察仪	CAMAG	2
超声波清洗仪	Creworks	ZX-040	带温度控制，40 °C
紫外灯	UPV	UVGL-58
VisionCATS 软件	CAMAG
自封袋	通用		1/4 加仑规格