多发性骨髓瘤患者血浆中卡非佐米定量的快速液相色谱-串联质谱方法的开发与验证

摘要

本研究旨在开发并验证一种快速、灵敏的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），用于定量测定人血浆中的卡非佐米。该方法经过全面验证，可支持多发性骨髓瘤患者的治疗药物监测，从而实现个体化剂量优化。

摘要

卡非佐米是一种第二代蛋白酶体抑制剂，需要进行治疗药物监测（TDM）。本研究旨在建立并验证一种灵敏、稳健的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），用于定量测定人血浆中的卡非佐米浓度。血浆样本采用乙腈（ACN）进行蛋白沉淀处理。色谱分离在C₁₈柱（2.1 mm × 100 mm，3.5 µm）上完成，柱温维持在40 °C，流动相为乙腈 与含10 mmol/L乙酸铵的水溶液（80:20，v/v），流速为0.35 mL/min。该方法在2.00–1000.00 ng/mL浓度范围内表现出良好的线性关系。此外，日内和日间精密度与准确度均较高，卡非佐米的回收率范围为84.1%–93.0%。该经过验证的LC-MS/MS方法可准确、高效且灵敏地测定多发性骨髓瘤患者血浆中的卡非佐米浓度，从而支持基于卡非佐米的治疗方案优化。

引言

多发性骨髓瘤（MM）是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓中浆细胞发生克隆性增殖¹。该病在全球范围内是第二常见的血液系统恶性肿瘤²，约占所有血液系统肿瘤的10%³。近年来，随着药物治疗的进步，包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物和单克隆抗体的应用，治疗效果已显著改善。然而，仍有相当一部分（20%-30%）的MM患者面临无进展生存期（PFS）较短^4,5、不良反应（ADRs）、耐药以及复发等挑战⁶。

^{硼替佐米是首个上市的蛋白酶体抑制剂7}，已彻底改变了多发性骨髓瘤（MM）的治疗格局。尽管其疗效显著，但大多数患者最终仍会发展为复发或难治性疾病，常伴随对硼替佐米的耐药性^8，9，以及治疗反应率和生存率的下降^10，11。这些挑战凸显了开发新型治疗方法以改善MM患者预后的迫切需求。卡非佐米是一种由美国食品药品监督管理局（FDA）批准的第二代蛋白酶体抑制剂，具有更稳定的药代动力学特征，可实现对糜蛋白酶样活性的持续抑制，并产生强效的抗骨髓瘤作用。该药物通常适用于既往接受过至少两种治疗方案（包括硼替佐米和一种免疫调节药物）的多发性骨髓瘤患者^1，11。研究表明，与硼替佐米相比，卡非佐米在骨髓瘤细胞中可实现更强烈的蛋白酶体抑制作用，并具备克服硼替佐米耐药性的能力^12，13。

用于定量生物基质中药物浓度的最常用方法包括高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。¹⁴尽管高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）具有操作简便和成本较低的优点，但其应用受限于相对较低的灵敏度和选择性。因此，对目标分析物进行准确定量，特别是在低浓度条件下或复杂的生物基质中，仍然具有挑战性¹⁵ELISA 具有高灵敏度，但其应用面临若干局限性，包括开发周期较长、依赖高质量的抗体，以及易与样品中结构相似的化合物发生交叉反应。这些因素共同影响了该检测方法的特异性。¹⁶相比之下，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）具有极高的选择性、优异的灵敏度以及快速的分析通量。这些优势使其成为治疗药物监测（TDM）和药代动力学研究的金标准方法。¹⁷卡非佐米具有广泛的血浆蛋白结合特性，渗透性差 体内 稳定性和较窄的治疗窗。LC-MS/MS 技术可对目标化合物进行快速定量分析，有效降低基质效应，为临床精准用药提供科学依据。

卡非佐米的药物暴露水平与其治疗效果及不良反应（ADR）密切相关^18,19。卡非佐米具有剂量依赖性特征²⁰，其体内暴露水平随剂量增加而呈正向升高，可能直接影响其治疗效果。一项研究表明，卡非佐米治疗多发性骨髓瘤（MM）的完全缓解（CR）率为28%，非常好的部分缓解（VGPR）率为73%，总体缓解率（ORR）为93%²¹。此外，与对照组相比，接受卡非佐米治疗的患者心脏毒性发生率显著升高，而周围神经病变的发生率无明显变化。另一项研究也提及了卡非佐米治疗MM的有效性与安全性，并证实卡非佐米在提升疗效的同时可能增加心脏毒性的风险²²。因此，卡非佐米的疗效和不良反应与其暴露水平相关。迄今为止，针对人血浆中卡非佐米定量的经验证的LC-MS/MS方法报道较少，尤其是符合严格生物分析验证标准（如FDA指南）的方法。现有研究主要集中在动物模型或其他生物基质上^23,24，凸显了在MM患者中用于治疗药物监测（TDM）的临床适用性检测方法的缺失。

因此，迫切需要建立一种快速、精确且灵敏的检测方法，用于监测多发性骨髓瘤（MM）患者中卡非佐米的浓度，以优化其治疗效果和安全性。在本研究中，我们开发并验证了一种可靠的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，可在3分钟内定量人血浆中的卡非佐米，表现出优异的灵敏度和重复性。该方法专为MM患者中卡非佐米的治疗药物监测（TDM）而设计，可支持剂量优化及暴露-效应关系评估。使用者必须注意该药物在血浆中的不稳定性；为实现准确定量，血液样本需在采集后4小时内完成处理。

方案

本研究方案经海军军医大学第二附属医院（上海长征医院）伦理委员会批准。所有参与研究的患者均签署了知情同意书。

1. 液相色谱-串联质谱仪设备

1. 使用超高效液相色谱（UHPLC）系统，该系统配备带有电喷雾离子源（ESI）的三重四极杆质谱仪，用于方法开发和样品分析。
2. 配置UHPLC系统，使其包含在线脱气机、二元泵、自动进样器和柱温箱。
3. 使用仪器制造商提供的数据采集软件进行数据采集和处理。

2. 液相色谱条件

1. 使用 ZORBAX-SB C₁₈ 色谱柱（2.1 mm × 100 mm，3.5 µm）实现色谱分离。
2. 将色谱柱温度维持在 40 °C。
3. 采用等度洗脱，流动相由 20% 含 10 mmol/L 醋酸铵的水溶液和 80% 乙腈（ACN）组成。
4. 设定流速为 0.35 mL/min。
5. 在该条件下，确保待测物和内标物（IS）均具有对称的峰形和合适的保留时间。
   注意：选择卡非佐米-d8 作为内标物，因其与卡非佐米结构相似，可保证相近的提取回收率、色谱行为和离子化效率。
6. 设定总运行时间为 3.0 min。

3. 质谱条件

1. 以负离子电喷雾电离（ESI）模式操作质谱仪。
2. 将毛细管电压设置为 -6000 V。
3. 使用氮气作为雾化气和干燥气。
4. 使用高纯度氮气作为碰撞气，压力为 0.2 MPa。
5. 保持雾化器压力为 20 psi。
6. 将干燥气加热至 400 °C，并以 10 L/min 的流速输送。
7. 设置鞘气温度为 350 °C，流速为 12 L/min。
8. 以多反应监测（MRM）模式采集数据。
9. 采集卡非佐米（图 1A）和内标物（IS）（图 1B）的产物离子谱，以说明其裂解模式。
10. 使用 MS2 扫描模式鉴定母离子。
11. 使用 MS2 SIM 模式优化碎裂电压（Fragmentor voltage）。
12. 使用产物离子模式确定最佳碰撞能量（CE）。
13. 列出卡非佐米和内标物（IS）优化后的质谱参数（表 1）。

4. 校准品和质控样品

1. 准确称取2.0 mg卡非佐米，置于2 mL容量瓶中，加入甲醇（MeOH）溶解并定容至2 mL，配制成卡非佐米储备液（1.0 mg/mL）。
   注意：甲醇（MeOH）易燃且有毒。操作时应在通风橱中进行，避免吸入蒸气或接触皮肤。应佩戴适当的个人防护装备，包括手套及眼部/面部防护装置。
2. 将储备液储存于-80 °C。
3. 用10%甲醇对储备液进行系列稀释，配制浓度分别为100.0 µg/mL、10.0 µg/mL和1.0 µg/mL的工作溶液。
4. 将工作溶液加入空白血浆中，制备校准标准品。
5. 将加标血浆与空白血浆按1:9（v/v）的比例稀释，得到终浓度为2.0、5.0、50.0、200.0、500.0、750.0和1000.0 ng/mL的校准标准溶液。
6. 采用相同方法独立配制质控（QC）样品，浓度分别为5.0 ng/mL（低浓度）、200.0 ng/mL（中浓度）和750.0 ng/mL（高浓度）。

5. 样品制备

1. 向血浆样品（100 µL）中加入20 µL的4%磷酸溶液进行预处理。
   警告：磷酸具有腐蚀性。操作时需佩戴手套、护目镜和实验服，以防皮肤和眼睛接触。若发生接触，应立即用大量清水冲洗。
2. 使用标准实验室涡旋混合器，以最大速度涡旋振荡样品2分钟。
3. 向混合物中加入200 µL乙腈（ACN），确保其中含有浓度为200.0 ng/mL的内标（IS）溶液²⁵。
   警告：乙腈（ACN）易燃、易挥发且有毒。所有操作必须在通风橱中进行，并远离热源和明火。应使用适当的个人防护装备，包括手套以及眼部/面部防护装置。
4. 再次涡旋振荡混合物。
5. 将混合物在4 °C条件下以12,500 ×g离心10分钟²⁵。
6. 收集100 µL上清液。
7. 将100 µL上清液与100 µL水混合。
8. 将所得溶液转移至配有玻璃插件的HPLC小瓶中。
9. 取10 µL最终溶液注入LC-MS/MS系统进行分析。

6. 特异性评估

1. 通过比较六个不同批次的空白血浆、内标（IS）加标血浆、定量下限（LLOQ）样品以及真实血浆样品中卡非佐米和内标（IS）的响应，评估方法的特异性。
2. 若待测物的响应低于定量下限（LLOQ）响应的15%，且内标（IS）的响应低于其自身响应的5%，则认为干扰可接受。

7. 线性评估

1. 通过在不同日期（至少两天）分析三组校准标准品来评估线性。
2. 采用加权线性最小二乘回归模型，基于至少六个校准标准品生成校准曲线。
3. 将最低浓度标准品定义为定量下限（LLOQ）。
4. 要求每个标准品回算浓度与其标称值的偏差在 ±15% 以内，LLOQ 的偏差允许在 ±20% 以内。

8. 精密度与准确度的测定

1. 在至少两个不同的日期，分别对三个浓度水平的质控样品和LLOQ样品进行五次重复分析，以确定日内和日间精密度与准确度。
2. 以相对标准偏差（RSD%）表示精密度，要求质控样品的RSD% ≤ 15%，LLOQ样品的RSD% ≤ 20%。
3. 以相对误差（RE%）表示准确度，要求质控样品的RE%在±15%以内，LLOQ样品的RE%在±20%以内。

9. 回收率与基质效应测定

1. 通过比较在提取前向血浆中添加卡非佐米的峰面积与在相同浓度下向提取后基质中添加卡非佐米的峰面积，确定回收率。
2. 通过比较在提取后基质中添加卡非佐米的峰面积与在相同浓度下卡非佐米在纯净溶液中的峰面积，评估基质效应。
3. 若基质效应因子的相对标准偏差（RSD%）小于15%，则表明空白血浆基质对分析物信号的影响具有一致性。

10. 污染残留评估

1. 通过在最高校准标准品之后立即进样空白样品，检测前一次进样残留的分析物信号，以评估残留效应。
2. 若空白样品中卡非佐米的响应值低于定量下限（LLOQ）的20%且低于内标（IS）响应值的5%，则认为残留效应可接受。

11. 稀释效应评估

1. 通过将添加了分析物且浓度超过定量上限（ULOQ）的血浆样本用空白血浆稀释，使浓度落入校准范围内，从而评估稀释效应。
2. 将测得的浓度与标称浓度进行比较。

12. 稳定性评估

1. 通过在不同储存条件下分析三个浓度水平的质控样品来评估稳定性。
2. 将质控样品在室温下储存，并在6小时后进行分析。
3. 将处理后的样品储存在自动进样器中，并在0、2、4和6小时进行分析。
4. 将质控样品在−20 °C和室温之间交替储存，经历三次冻融循环后进行分析。
5. 将质控样品在−80 °C下储存两个月后进行分析。
6. 将测得的浓度与标称值进行比较，确认偏差在±15%以内（相对误差%）。

13. 患者入组与样本采集

1. 从所有患者处获取书面知情同意书。
2. 纳入多发性骨髓瘤（MM）患者，并使用卡非佐米进行治疗。
3. 在药物给药后立即采集血液样本（静脉输注持续30分钟）。
4. 将采集于EDTA-3K管中的血液样本在4 °C条件下以4500 ×g离心10分钟，获得血浆样本。

结果

LC-MS/MS 优化

为了优化卡非佐米的检测，比较了分析物在正离子化模式和负离子化模式下的响应值。负离子化模式下卡非佐米的响应值高于正离子化模式，因此选择负离子化模式进行后续分析。我们比较了C₈、C₁₈和T3-C₁₈色谱柱的性能以选择最优色谱柱。C₁₈色谱柱为卡非佐米提供了最佳的峰形和响应。通过优化洗脱梯度，卡非佐米的保留时间从6.0 min缩短至3.0 min。初始实验采用甲醇作为有机相、氨水溶液作为水相，结果峰形不对称且拖尾明显。随后改用乙腈作为有机相、10 mmol/L乙酸铵溶液作为水相，获得了尖锐且对称的峰形。

样本提取优化

采用不同比例（1:2、1:3）的蛋白质沉淀剂（包括甲醇和乙腈）对血浆样品进行预处理。使用乙腈作为沉淀剂时，卡非佐米的回收率（84%–109%）高于使用甲醇的情况。鉴于卡非佐米具有较高的血...

讨论

与传统的高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）和酶联免疫吸附测定（ELISA）方法相比，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）具有卓越的选择性、灵敏度和分析速度，能够有效克服前代方法的局限性。这些优势确立了其在复杂生物基质中药物分析领域的金标准地位，尤其适用于治疗药物监测（TDM）和药代动力学研究¹⁷。 我们已建立并验证了一种用于定量人血浆中卡非佐米（carfilzomib）的LC-MS/MS方法。该方法的一个重要实际优势在于其简单的样品前处理过程：仅需使用两倍体积的乙腈（ACN）进行一次蛋白沉淀，随后进行稀释步骤即可。这一简化的操作流程避免了复杂且耗时的提取过程。

在方法开发中，C₁₈ 色谱柱由于具有更长的烷基链和更强的疏水性，对卡非佐米的保留作用更强，而 C₈ 色谱柱保留较弱，可能影响分离效果和灵敏度。T3-C₁₈ 色谱柱可降低硅醇活性，从而改善极性分析物的峰形并减少拖尾。通过系统比较这些固定相，最终选择 C₁₈ 色谱柱作为卡非佐米...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈（ACN）	默克公司（德国达姆施塔特）	34888	LC-MS级
乙酸铵	默克公司（德国达姆施塔特）	9689	分析纯度： ≥ 99.0%
分析天平	赛多利斯（德国）		精度：0.01 mg
分析柱	安捷伦科技公司（美国）		安捷伦 ZORBAX SB-C18，2.1 × 100 毫米，3.5 µm
卡非佐米	中国上海源叶生物科技有限公司（中国上海）	868540-17-4	分析标准样品，纯度 > 99%
Carfilzomib-d8	中国上海源叶生物科技有限公司（中国上海）		分析标准样品，纯度 > 98%
数据采集软件	安捷伦科技公司（美国）		安捷伦 Masshunter 数据处理软件（版本 6.0）
数据分析软件	安捷伦科技公司（美国）		安捷伦 MassHunter 定量分析软件（版本 10.1）
蒸馏水	中国深圳华津蒸馏水有限公司（中国深圳）	LC-MS级
HPLC 小瓶 &和 插件	中国上海，上海泰坦科技有限公司		-
液相色谱系统	安捷伦科技公司（美国）		Agilent 1200 系列包括二元泵、在线脱气机、自动进样器和柱温箱。
甲醇（MeOH）	默克公司（德国达姆施塔特）	1.06035	LC-MS级
微量移液器	Eppendorf（德国）		多个测量范围（例如，10 µL，100 µL, 200 µ升，1000 µL
办公室 &和统计软件	-		Microsoft Office 365；GraphPad Prism 9.5
磷酸	默克公司（德国达姆施塔特）	49685	分析纯度，85 质量分数%
冷藏离心机	Eppendorf（德国）		对于在 4 ℃ 离心的样品°C
三重四极杆质谱仪	安捷伦科技公司（美国）	G6475AA	安捷伦 1200 系列，配备电喷雾离子源（ESI）
涡旋混合器	Labnet 美国	S0200	可调速度