研究文章

转录组学分析揭示特应性皮炎皮损中由线粒体驱动的亚组

DOI：

10.3791/70240

⸱

2026年5月26日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特应性皮炎（AD）是一种具有显著分子异质性的慢性炎症性皮肤病。本研究鉴定了两种在转录组水平上截然不同的AD亚组，其差异由线粒体基因表达和免疫细胞浸润的不同所驱动，并揭示了四个枢纽基因可作为患者分层的潜在生物标志物。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特应性皮炎（AD）是一种常见且慢性的炎症性皮肤病，具有全球流行性。其临床异质性和复杂的分子机制为有效治疗方案的开发带来了重大挑战。本研究旨在利用皮损皮肤转录组数据探索AD的分子异质性，表征其生物学与免疫学特征，并鉴定介导分型差异的关键基因。通过DESeq2鉴定差异表达基因，随后分别采用GSEA和WGCNA进行通路分析和共表达分析。via 将差异表达基因与WGCNA模块与MitoCarta3.0数据库取交集，提取线粒体相关基因，并通过GO和KEGG富集分析评估其功能相关性。通过蛋白质-蛋白质相互作用网络分析鉴定枢纽基因，并进一步用于构建分类模型。使用hTFtarget预测转录调控因子，同时采用CIBERSORT量化免疫细胞浸润情况。研究识别出两个分子亚组：Cluster 1在细胞信号传导和黏附通路中富集，而Cluster 2则表现出氧化磷酸化和蛋白酶体相关过程的上调。两组间共有85个与线粒体相关的差异表达基因，主要参与能量代谢过程。蛋白质互作网络分析鉴定出四个枢纽基因（BAD、BOLA1、CHCHD5 和 ISOC2），在Cluster 1中显著上调。基于枢纽基因构建的分类器表现出较强的判别能力（曲线下面积 > 0.7）。预测的关键转录调控因子包括 ATF3、BRD2、BRD4 和 CEBPA。免疫特征分析显示，Cluster 1中调节性T细胞浸润水平较高，而Cluster 2中滤泡辅助性T细胞比例增加。本研究揭示了两种在分子特征和免疫学上均不同的AD亚型，其特征表现为线粒体功能和免疫微环境特征的差异。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特应性皮炎（AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，影响高达20%的儿童和10%的成人1。其特征为剧烈瘙痒和反复发作的湿疹样皮损2。临床上，AD由多基因易感性（例如FLG功能缺失突变）、免疫失调以及环境暴露（如低湿度和微生物群失调）之间的动态相互作用引起3。尽管AD与银屑病具有一些共同的病理生理特征，但两者的临床表现截然不同，在共享通路中存在不同的遗传效应以及独特的免疫改变4。

特应性皮炎（AD）是一种异质性疾病，不同患者群体和疾病症状之间表现出多样的转录组特征5。对皮肤组织和外周血单个核细胞的整合分析表明，红斑和丘疹等临床特征与不同的免疫学特征相关，反映了局部皮肤免疫与系统性免疫反应之间的相互作用6。大规模转录组学研究进一步强调了IL-13通路在AD发病机制中的作用，而AD相较于银屑病具有更高的分子异质性，其基因表达模式的差异与疾病严重程度、发病年龄以及遗传背景相关5,7。这些差异凸显了AD发病机制的复杂性，以及在研究和治疗中采取个体化策略的必要性。

线粒体蛋白通过调控异常的氧化应激和代谢通路在特应性皮炎（AD）的发病机制中发挥重要作用。研究表明，非皮损区AD角质形成细胞中线粒体复合物I和复合物II活性升高，导致长链脂肪酸过度氧化以及活性氧（ROS）产生增加，从而加剧表皮屏障功能障碍8,9。同时，蛋白质组学分析发现AD表皮中NRF2抗氧化通路相关蛋白及线粒体组分表达减少，削弱了氧化应激的清除能力10。线粒体DNA损伤进一步促进炎症反应，而采用靶向线粒体的抗氧化剂干预可有效减轻ROS水平，恢复表皮稳态11,12。这些发现强调了线粒体蛋白不仅是AD病理过程的驱动因素，也是潜在的治疗靶点。

近期对特应性皮炎（AD）的转录组学分析显著加深了对其遗传结构和分子异质性的理解。首次针对AD开展的RNA测序分析揭示了TREM-1信号通路和IL-36细胞因子表达上调13。基于基因表达谱的加权基因共表达网络分析（WGCNA）进一步发现了多个独特的分子模块及核心基因，例如HSPA4、LCE3E和LCE3D，这些基因协调调控炎症反应和角化过程，提示了潜在的治疗靶点14。这些研究凸显了多组织转录组学与多基因风险建模在优化疾病预测、揭示AD复杂分子机制方面的价值。然而，现有研究主要集中于AD整体的转录组特征，尚未专门解析线粒体基因在定义分子亚组中的作用。本研究在既往转录组分析基础上进一步推进，通过整合多个GEO数据集，基于一致性聚类识别AD分子亚组，并系统整合差异表达基因、WGCNA模块以及人工审编的线粒体基因目录，以精准鉴定定义亚组特征的核心线粒体基因，这些基因可能作为新型生物标志物。

基于特应性皮炎（AD）皮损皮肤中存在分子特征不同的转录组亚群的假设，这些亚群以线粒体基因表达差异为特征，可能构成AD临床异质性的基础。为验证这一假设，本研究整合了已发表研究中的RNA测序数据，并收集了来自266名AD患者的皮损皮肤样本的基因表达数据。基于基因表达的一致性聚类分析鉴定了分子亚群，并比较了两个分子亚群之间的基因表达差异。驱动这种差异的基因在细胞信号传导和氧化磷酸化功能上表现出显著富集。此外，研究进一步分析了区分这两个分子亚群的线粒体基因，并在蛋白质-蛋白质相互作用网络中鉴定了关键枢纽基因。这些发现强调了AD疾病的遗传异质性，并拓展了对线粒体蛋白在AD病理过程中作用的认识。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究使用了来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）的公开基因表达数据集。未访问任何可识别患者身份的数据，也未收集新的患者样本。因此，对该公共数据的二次分析无需机构审查委员会（IRB）批准或患者知情同意。所使用的软件和数据库列于材料表中。

1 数据与资源

特应性皮炎（AD）患者的转录组数据来自 GEO 数据库，包括四项研究：GSE121212（N = 55）5、GSE157194（N = 57）15、GSE193309（N = 111）16 和 GSE277961（N = 43）17。所有数据集均包含来自病变皮肤活检样本的原始或预归一化的计数数据。下载原始计数矩阵并在各研究间进行整合。使用 ComBat-seq 方法（sva R 软件包，v3.44.0）校正跨研究的批次效应，以在下游分析前协调这四个 GEO 数据集的表达谱。所有四个数据集均基于对人类皮肤活检样本进行的 RNA-seq，采用各研究特定的分析流程比对至人类参考基因组 GRCh38。基因水平的表达定量使用 Ensembl 基因注释（v105）完成。

2 一致性聚类

使用 ConsensusClusterPlus R 软件包（v1.64.0）18 对来自特应性皮炎（AD）患者的 266 份病变皮肤样本进行无监督共识聚类分析，依据其转录组谱进行分层。在聚类之前，整合了所有研究的原始计数数据，并利用 limma 软件包中的 removeBatchEffect 函数校正跨研究的批次效应。随后，使用 DESeq2 对基因表达数据进行方差稳定化转换（VST），并筛选保留变异程度最高的前 5,000 个基因。聚类分析采用层次聚类法，基于 Pearson 相关系数和平均连接法，在 1,000 次迭代中每次对 80% 的样本进行重采样。通过评估共识累积分布函数（CDF）、delta area 图以及聚类共识得分，确定最优聚类数目（k 范围为 2 至 10）。所得聚类结果通过共识热图和主成分分析（PCA）进行验证，并用于后续的生物学与临床分析。

3 差异基因表达分析

使用 DESeq2 R 软件包（v1.46.0）19 比较了不同分子亚组之间的基因表达水平。将原始计数数据输入以估计基因特异性离散度，并拟合负二项分布模型。通过 Wald 检验鉴定差异表达基因（DEGs），并使用校正后 p 值 < 0.01 且绝对 log2 倍数变化 > 1 的显著性阈值对结果进行筛选。

4 基因集富集分析

使用 clusterProfiler R 软件包（v4.12.6）20 进行基因集富集分析（GSEA）。所有基因根据其在差异表达分析中得到的 log2 倍数变化值进行排序，并以 eps = 0、minGSSize = 10、maxGSSize = 500 为参数运行 GSEA 函数，其余设置保持默认。富集分析针对 MSigDB Hallmark 基因集进行。对于每个分子簇（Cluster 1 和 Cluster 2），根据名义 p 值和标准化富集评分（NES）选取富集最显著的前三条通路。结果使用 GseaVis R 软件包（v0.1.0）21 进行可视化。

5 加权基因共表达网络分析

对阿尔茨海默病（AD）患者的基因表达谱进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），以鉴定与转录组亚型特征相关的基因共表达模块，分析使用 R 软件包 WGCNA（v1.73）22 进行。筛选基因时保留在所有样本中变异度最高的前 75%。通过软阈值化方法构建有符号的共表达网络，软阈值幂次参数从 1 到 30 中选择，以逼近无标度拓扑结构。采用系统聚类和动态树剪切法识别基因模块。通过将共表达模块的特征基因（eigengene）与分子亚型标签进行相关性分析，研究模块与性状的关联性；选择与分子亚型显著相关（p < 0.05）的模块用于后续分析。

6 阿尔茨海默病分子亚组中的线粒体蛋白

为了鉴定差异表达基因（DEGs）和WGCNA模块中与线粒体相关的基因，将这些基因集与MitoCarta3.0数据库中整理的线粒体蛋白列表进行比对23。交集中的基因被视为与阿尔茨海默病（AD）疾病背景相关的潜在线粒体蛋白。

7 基因本体和 KEGG 富集分析

为了鉴定区分分子亚组的主要细胞功能和生物学过程，使用 clusterProfiler 对线粒体相关基因进行 GO 和 KEGG 富集分析。GO 富集分析分别针对生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）三个类别，采用 enrichGO 函数进行，参数设置为 OrgDb = “org.Hs.eg.db”，ont = "ALL"，其余参数使用默认值。KEGG 通路富集分析使用 enrichKEGG 函数进行，物种设置为 "hsa"。以校正后的 p 值 < 0.05 作为判断富集项具有显著性的标准。

8 蛋白质-蛋白质相互作用网络

在 STRING 数据库（https://string-db.org）24 中查询了 85 个差异表达基因（DEGs）与阿尔茨海默病（AD）相关模块重叠的线粒体基因，以获取已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。采用七种指标（Degree、Closeness、Betweenness、Eigenvector、PageRank、Hub 和 Authorities）进行网络拓扑分析，以评估每个蛋白质节点的重要性。选取每种指标排名前 30 的基因，并通过 UpSet 图可视化七种方法之间的交集。基于四种指标共同交集的 4 个基因，利用其基因表达水平构建分类模型。通过计算模型准确率、敏感性、特异性以及受试者工作特征曲线下的面积（AUC）来评估分类性能。

9 转录调控分析

利用 hTFtarget 数据库（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget）25 查询了四个交集枢纽基因的实验支持的转录因子-靶基因相互作用。使用 igraph26 和 ggraph27 R 软件包构建并可视化了所得的转录因子-基因调控网络。

10 个批量 RNA 测序免疫细胞浸润分析

采用CIBERSORT28算法（https://cibersort.stanford.edu/）估算皮损皮肤转录组数据中22种免疫细胞类型的相对比例。将标准化后的基因表达数据与LM22特征矩阵一同输入CIBERSORT（v0.1.0）程序。分析过程中设置1,000次置换检验，并关闭分位数标准化。仅保留CIBERSORT输出的p值< 0.05的样本用于后续分析。使用Wilcoxon秩和检验比较不同分子亚组间的免疫细胞比例，并对22种免疫细胞类型进行多重比较的FDR校正（p.adjust.method = “FDR”），结果通过ggplot229 R软件包以箱线图形式可视化展示。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特应性皮炎中的转录组亚型

对来自266例阿尔茨海默病（AD）患者样本的RNA-seq数据进行分析，以研究该疾病内部的转录异质性。在经过质量控制并校正多个研究间的批次效应后，无监督的一致性聚类揭示了两个不同的分子亚组（图1A）。通过累积分布函数（CDF）图（图1B）、delta面积图（图1C）和一致性矩阵热图（图1D）评估了聚类的稳定性及最优聚类数目。综合这些结果支持AD中存在两种稳定的转录亚型，反映了其潜在的遗传异质性。

AD 亚组间差异表达基因

基于标准化基因表达矩阵的t-SNE图进一步验证了通过一致性聚类识别出的转录亚组。t-SNE图显示了两个明显分离的簇，每个簇对应于先前定义的一个亚组（图2A），支持阿尔茨海默病（AD）患者之间存在不同的分子特征。随后使用DESeq2分析两个亚组之间的差异表达，筛选阈值为校正后p值 < 0.01且|log₂倍数变化| > 1。所得的火山图（图2B）展示了差异表达基因（DEGs），表明存在显著的转录差异。在簇1中，表达上调最显著的前10个基因为ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN和AHNAK，而在簇2中为C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D和PMPCA（图2C）。

与阿尔茨海默病亚组相关的基因集

基因集富集分析（GSEA）揭示了两个转录组簇之间不同的功能富集特征（图3A）。簇1在细胞信号传导和黏附相关通路中显著富集，包括黏着斑（图3B）和MAPK信号通路（图3C），提示其处于一种细胞-细胞及细胞外基质相互作用增强并伴随增殖活跃的状态。相比之下，簇2在线粒体氧化磷酸化（图3D）和蛋白酶体功能（图3E）方面显著富集，提示其具有活跃的氧化代谢和蛋白水解代谢表型。

阿尔茨海默病分子亚组中的共表达基因

为了鉴定与转录组亚型相关的共表达模块，在数据预处理后进行了WGCNA分析。首先基于样本距离的层次聚类识别并剔除离群样本，以确保下游网络构建的稳健性（图4A）。随后根据无标度拓扑准则选择软阈值幂参数，最终选定幂值为6，以达到无标度R2 > 0.85的标准（图4B）。通过层次聚类和动态树切割方法识别基因模块，并进一步利用特征基因聚类合并高度相关的模块（图4C 和 图4D）。最终构建的基因网络采用拓扑重叠热图进行可视化，证实了不同基因共表达模式的存在（图4E）。模块-性状关联分析显示，MEyellow模块（Ngene = 743）与分子亚组之间存在强烈且显著的相关性（图4F）。

阿尔茨海默病亚组相关线粒体基因的功能富集

随后对差异表达基因（DEGs）、MEyellow 模块中的基因以及来自 MitoCarta3.0 的线粒体蛋白列表之间的交集基因（N = 85）进行 GO 和 KEGG 富集分析（图 5A），以探究驱动不同聚类间转录差异的线粒体相关基因的功能作用。KEGG 通路分析发现，氧化磷酸化和代谢通路显著富集（图 5B）。GO 富集分析显示，与线粒体功能相关的术语显著过表达，包括质子驱动力驱动的线粒体 ATP 合成、呼吸链复合物以及 NADH 脱氢酶活性（图 5C），提示这些基因主要参与线粒体能量代谢和能量调控。

阿尔茨海默病分子分化中的枢纽线粒体基因

为了鉴定与85个线粒体转录组亚群相关基因中的关键基因，构建了一个PPI网络（图6A）。根据七种拓扑学指标中的每项排名（见方法部分），筛选出排名前30的基因，并对其交集进行分析，结果以UpSet图可视化呈现（图6B）。该分析基于所有排序标准，一致鉴定出四个作为中心节点的枢纽基因BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2）。在两个转录组簇中分析了它们的表达谱，发现与簇2相比，簇1中所有四个枢纽基因均显著上调图6C）。成对基因表达相关性分析显示，这四个基因之间均呈正相关，表明存在协同调控，且 CHCHD5 和 ISOC2 表现出最强的相关性（图6D）。此外，我们利用这四个基因的表达构建的分类模型在两个簇之间表现出强大的判别能力，ROC曲线下的面积（AUC） > 0.7 (图6E）。此外，还进行了转录因子（TF）调控网络分析，以研究调控四个已鉴定枢纽基因表达的调控机制。从hTFtarget数据库中查询了所有已知和预测的可能调控这些枢纽基因的转录因子，并将结果整合后可视化为转录调控网络图7）。在TF-hub基因调控网络中， BAD 转录因子数量最多，且 ATF3, BRD2, BRD4，以及 CEBPA 每个基因均与全部四个枢纽基因相互作用，表明存在共同的调控机制。

AD 亚组间免疫细胞浸润的比较

为了研究与转录组学亚组相关的免疫图谱，使用CIBERSORT进行了免疫细胞浸润分析，该分析基于批量转录组数据估算22种免疫细胞类型的相对比例（图8）。在这些免疫亚群中，调节性T细胞（Tregs）在1型聚类中显著更为丰富，提示该组可能存在与线粒体活性及上调信号通路相关的免疫抑制微环境。相比之下，滤泡辅助性T细胞在2型聚类中显著富集，表明该亚组可能具有更活跃的适应性免疫应答。

数据可用性：

本研究中分析的转录组数据已公开提供于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO），登录编号分别为 GSE121212、GSE157194、GSE193309 和 GSE277961（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。

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图1：基于转录组谱的特应性皮炎皮损样本的共识聚类分析。（A）特应性皮炎（AD）样本间共识矩阵的热图及层次聚类结果。（B）用于确定最优聚类数（k = 2–10）的共识累积分布函数（CDF）图。（C）Delta面积图，显示每个k值下CDF曲线下面积的相对变化。（D）k = 2时的共识聚类分配结果。每列代表一个独立样本，颜色表示所属聚类（聚类1，红色；聚类2，蓝绿色）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：特应性皮炎分子亚型的差异基因表达。（A）特应性皮炎（AD）样本的t分布随机邻域嵌入（t-SNE）图。每个点代表一个投影到二维空间的样本，并根据聚类分配进行着色。（B）Cluster 1与Cluster 2之间差异表达基因（DEGs）的火山图。每个点代表一个基因，按log2倍数变化（x轴）和−log10校正p值（y轴）绘制。红色和蓝色的点分别表示在Cluster 1和Cluster 2中显著上调的基因，灰色点表示无显著差异的基因。（C）Cluster 1和Cluster 2中表达水平最高的前10个基因的热图。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：特应性皮炎分子亚型的基因集富集分析。（A）Cluster 1 与 Cluster 2 之间基因集富集分析（GSEA）结果的双向柱状图，显示最显著富集的通路。Cluster 1 中富集的通路显示在右侧，Cluster 2 中富集的通路显示在左侧。（B–E）黏着斑、MAPK信号通路、氧化磷酸化和蛋白酶体通路的代表性富集图。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 4：特应性皮炎样本的加权基因共表达网络分析。（A）基于基因表达谱的样本聚类树状图。（B）无尺度拓扑拟合指数和平均连接度在不同软阈值幂次（1–30）下的变化情况。（C）模块特征基因的聚类与热图，颜色表示两两之间的相关性。（D）显示基因被聚类为共表达模块的层次聚类树状图。（E）拓扑重叠矩阵（TOM）热图，表示基因对之间的共表达相似性。（F）模块-性状关系热图，展示模块特征基因与临床性状之间的相关性。每个单元格内显示相关系数，颜色强度表示相关性的大小和方向（红色为正相关，蓝色为负相关）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：亚型相关线粒体基因的基因本体（Gene Ontology）与KEGG通路富集分析。（A）差异表达基因（DEGs）、亚型相关模块基因与线粒体基因之间的重叠部分的维恩图。（B）交集基因的前20个富集KEGG通路的气泡图。（C）生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）类别中前10个富集的基因本体（GO）条目。所有富集分析均以校正后p值 < 0.05（错误发现率）作为显著性阈值。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：蛋白质-蛋白质相互作用分析及枢纽基因的鉴定。（A）85个交集基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。节点代表蛋白质，边表示来自STRING数据库的预测或实验验证的相互作用。（B）基于七种网络中心性度量对排名前30的基因进行UpSet图展示其交集情况。（C）箱线图显示Cluster 1和Cluster 2中四个枢纽基因的表达水平。（D）四个枢纽基因之间的成对相关性分析。（E）受试者工作特征（ROC）曲线显示分类性能，以敏感性对特异性作图。曲线下面积（AUC）表示总体准确性。图（C）中的统计学显著性通过Wilcoxon秩和检验进行评估（*p < 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：枢纽基因的调控网络。红色圆圈代表枢纽基因，蓝色圆圈代表相关的转录因子（TFs）。边线表示调控相互作用。每个枢纽基因节点的大小反映了与其相互作用的转录因子的数量。请点击此处查看该图的放大版本。

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图8：特应性皮炎亚组间免疫细胞浸润的比较。 箱线图显示了每个簇（簇1，红色；簇2，青绿色）中22种免疫细胞类型的估计比例。星号（*）表示通过Wilcoxon秩和检验结合多重比较的错误发现率校正后，簇间具有统计学显著性差异。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特应性皮炎是一种常见且具有遗传异质性的炎症性皮肤病，为个体化治疗策略的制定带来了显著挑战。本研究通过对266例特应性皮炎患者皮损皮肤样本进行分析，揭示了该病的分子异质性，鉴定了两种不同的转录亚组。这两个亚组在生物学功能富集和免疫细胞浸润方面表现出差异：Cluster 1以细胞信号传导和黏附通路活跃为特征，并富集调节性T细胞（Tregs）；而Cluster 2则表现为氧化磷酸化和蛋白酶体功能增强，同时伴有滤泡辅助性T细胞的增加。重要的是，四个线粒体相关基因（BAD、BOLA1、CHCHD5，以及 ISOC2在第1簇中发现上调的基因（或蛋白/分子）. 它们是85个基因PPI网络中的枢纽基因，这些基因定义了两种转录组亚型，并可被包括在内的转录因子同时调控 ATF3, BRD2, BRD4，以及 CEBPA.

根据基因表达模式确定了两个不同的聚类，表明特应性皮炎（AD）存在显著的基因表达异质性。既往研究表明，这种异质性可能由遗传、表观遗传以及免疫介导的机制所驱动，这些机制定义了不同的分子内型5,30,31。在两个聚类之间还观察到不同的免疫细胞浸润情况：聚类1以调节性T细胞（Treg）为特征，而聚类2则富集滤泡辅助性T细胞（Tfh），提示AD队列中存在潜在的免疫学异质性以及可能不同的疾病机制。以Treg为主的聚类提示存在一种以调节机制占主导地位的免疫环境，可能反映了机体试图控制炎症或对慢性免疫激活产生的代偿性反应32,33。然而，在AD中，尽管Treg数量增加，其功能可能受损，因而无法有效抑制炎症。相比之下，富集Tfh细胞的聚类提示B细胞辅助功能增强、生发中心活性升高，并可能伴有IgE产生增多，这些特征常见于过敏反应以及更严重或外源性类型的AD34,35。Tfh细胞已知可促进B细胞分化和抗体类别转换，其扩增与疾病活动度及过敏致敏状态相关36。这些不同聚类的存在可能反映了不同的临床表型、疾病严重程度或对治疗的反应差异，凸显了在AD研究与治疗中采用个体化策略的重要性。

已知线粒体功能障碍通过维持表皮屏障37、产生活性氧38以及调节免疫细胞反应39等机制在阿尔茨海默病（AD）的发病过程中发挥重要作用。研究发现四种线粒体蛋白是与转录组差异相关基因网络中的核心节点，能够高精度预测分子亚型（AUC>0.7）。尽管此前尚无研究证实这些基因与AD之间存在直接关联，但这些结果提示它们可能是用于对AD患者进行分层以及评估AD患者线粒体功能障碍的潜在生物标志物。BAD（细胞死亡相关BCL2激动剂）是BCL-2家族中促进凋亡的成员，参与线粒体介导的凋亡信号通路；其在1型聚类中的上调可能反映了该亚型中线粒体凋亡启动增强。BOLA1是一种参与铁硫簇生物合成和氧化应激调控的线粒体蛋白。CHCHD5（含卷曲螺旋-螺旋-卷曲螺旋-螺旋结构域蛋白5）是一种定位于线粒体内膜、与嵴结构组织及电子传递链效率相关的蛋白。ISOC2（含异分支酸酶结构域蛋白2）已被证实与代谢过程及线粒体功能相关。这四个基因在1型聚类中的协同上调提示该AD亚组存在线粒体代谢活性增强及凋亡信号激活的状态。

本研究存在若干局限性。尽管本研究鉴定了两个在线粒体基因表达和免疫细胞浸润方面具有明显差异的分子亚组，但我们缺乏详细的临床表型数据，无法将这种分层与疾病严重程度及长期治疗反应相关联。为了充分理解这四个核心基因在第1簇中高表达的意义，未来的研究应整合全面的临床元数据，并理想地在角质形成细胞或小鼠模型中进行功能验证。此外，本研究依赖于公开的批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据；尽管该方法适用于大规模分析，但在特定细胞类型的分辨率上存在不足。这一局限性使得我们难以确定所观察到的线粒体基因差异表达是来源于角质形成细胞、浸润的免疫细胞，还是其他皮肤常驻细胞群体。随着单细胞和空间转录组学技术的广泛应用，未来研究将极大受益于解卷积表达信号的能力，从而在细胞水平上更精确地描绘转录组特征。此外，所有数据均来自钻孔活检标本，其取样为全层皮肤。未来若结合胶带剥离法（tape-strip）RNA-seq，可能提供一种互补的非侵入性方法，用于分析表层表皮的转录组，并可在微创条件下验证所识别的亚组特征。未来整合单细胞RNA测序与空间转录组数据，将进一步提升特异性细胞类型线粒体特征在特应性皮炎（AD）皮肤中的解析能力。

综上所述，本研究分析了266个样本中阿尔茨海默病的转录组异质性，鉴定了关键的线粒体基因和独特的免疫细胞浸润特征，从而区分了不同的亚组。这些发现加深了对阿尔茨海默病分子异质性的理解，并强调了基于特定分子特征开发精准治疗策略的潜力。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CIBERSORT斯坦福大学v0.1.0；免疫细胞去卷积分析；https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfilerBioconductorv4.12.6；GSEA 与 GO/KEGG 富集分析；https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlusBioconductorv1.64.0；无监督一致性聚类；https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2Bioconductorv1.46.0；差异基因表达分析；https://bioconductor.org/packages/DESeq2
基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）美国国家生物技术信息中心（NCBI）公共转录组数据存储库；数据集 GSE121212、GSE157194、GSE193309、GSE277961；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2CRAN数据可视化；https://ggplot2.tidyverse.org
ggraphCRAN图与网络可视化；https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVisGitHub（junjunlab）v0.1.0；GSEA 可视化工具；https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget华中科技大学人类转录因子靶基因数据库；http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraphCRAN网络构建与可视化；https://igraph.org
limmaBioconductorremoveBatchEffect 函数；https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0布罗德研究所（Broad Institute）人工整理的线粒体蛋白数据库；https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB（Hallmark 基因集）布罗德研究所（Broad Institute）GSEA 基因集数据库；https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org.Hs.eg.dbBioconductor人类基因组注释数据库；https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
RR 核心团队（R Core Team）统计计算环境；https://www.r-project.org
STRING欧洲分子生物学实验室（EMBL）v12.0；蛋白质-蛋白质相互作用数据库；https://string-db.org
sva（ComBat-seq）Bioconductorv3.44.0；批次效应校正；https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNACRANv1.73；加权基因共表达网络分析；https://cran.r-project.org/package=WGCNA

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