用于评估骶神经和外周神经刺激对膀胱功能影响的大鼠动物模型

摘要

本方案详细描述了在麻醉大鼠中刺激骶神经、胫神经和腓神经的手术技术。这些模型可用于研究神经调节对膀胱功能的影响，有助于确定最佳刺激参数，并可用于探讨骶神经及外周神经刺激疗法的作用机制。

摘要

神经调节作为一种治疗多种器官功能障碍的疗法，在治疗下尿路功能障碍方面已显示出有效性。尽管其在临床上取得成功，但神经调节的作用机制尚未完全阐明，因此迫切需要建立标准化且可重复的动物模型。利用骶神经和外周神经刺激建立的膀胱神经调节临床前模型已有二十多年历史；然而，现有文献对手术操作方法的描述极为有限。本文详细描述并以可视化方式展示了成熟的骶神经刺激技术，介绍了一种改良的胫神经刺激方法，并提出一种在大鼠模型中利用腓总神经刺激进行膀胱神经调节的全新方法。改良的胫神经刺激方法涉及暴露并刺激胫神经在其作为坐骨神经分支的起始部位，而非如以往研究所述的内踝处。鉴于腓总神经刺激在临床实践中已被新近引入用于膀胱神经调节，本文提出一种独特的大鼠模型，以研究其在调控下尿路功能中的作用机制。本文为上述三种神经调节方法提供了分步操作指南，涵盖神经暴露、电极放置以及基于特征性运动反应验证电极成功定位的操作流程。此外，还包括一个代表性实例，展示在乙酸诱导的膀胱过度活动大鼠模型中，腓总神经刺激对膀胱功能的影响，以证明该方法的适用性。本文提供了一套标准化且技术上易于实施的操作方案，可用于研究神经调节机制，包括膀胱感觉信号的改变、脊髓及脊上调控通路、刺激参数的优化，以及不同刺激靶点疗效的比较。

引言

神经调节通过低幅度电刺激来改变终末器官的功能¹。在下尿路功能障碍（如膀胱过度活动症（OAB）、非梗阻性尿潴留、神经源性膀胱和膀胱疼痛综合征）的治疗中，对于行为疗法和药物治疗无效的患者，神经调节被作为三线治疗手段²。针对OAB患者的神经调节，临床实践中已广泛应用胫后神经刺激和骶神经刺激（SNS）。目前，针对其他外周神经（包括阴部神经和腓总神经）的实验性神经调节方法也正在研究中^3,4,5,6。

尽管神经调节已用于膀胱和肠道疾病治疗数十年，但其作用机制尚未完全阐明。正如多学科专家组综述所述，目前使用的刺激参数大多由制造商基于试错法确定⁷。因此，继续利用动物模型阐明其潜在通路并优化刺激参数以提高治疗效果至关重要。已有多个临床前实验采用清醒或麻醉状态下的动物开展，包括小鼠、大鼠、绵羊、狗和猫⁴。鉴于全球范围内的伦理指南和研究政策鼓励使用结构更简单、体型更小的物种，近年来啮齿类动物模型的应用最为广泛。

在膀胱功能障碍的大鼠模型中，躯体神经刺激（SNS）主要采用两种方法学途径。第一种方法由 Zvara 等人描述，涉及使用血管套管针或脊髓穿刺针将刺激电极植入骶骨孔⁸。第二种方法则需要暴露 L6 神经根，并将刺激电极置于 L6 神经下方，同时使用硅胶固定电极与神经之间的接触⁹。在骶骨孔内放置电极的技术与临床方法相似。而暴露 L6 神经根的方法虽然技术上更具挑战性，但可实现更精确的定位，并更稳定地接触神经。

文献中已描述了模拟胫后神经刺激的大鼠动物模型。最常用的方法是通过手术暴露后肢踝关节上方内侧的胫神经^{10,11,12,13,14,15,16}。另一种方法是在胫神经附近经皮插入针状电极¹⁷。本文旨在详细描述在臀大肌与股二头肌之间坐骨神经分叉处进行的胫神经刺激，该位置坐骨神经分为三个分支：胫神经、腓总神经和腓肠神经。此外，本研究引入腓总神经刺激作为一种新型动物模型，用于探索一种新的神经调节方法。该大鼠模型的转化应用价值得到了近期临床研究的支持，即腓总神经刺激已被应用于膀胱神经调节^18,19。

方案

动物饲养于南丹麦大学动物护理中心，遵循机构制定的指导原则。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）关于实验动物护理和使用的指南进行。本研究方案已获丹麦动物实验监察局伦理委员会批准（方案编号：2022-15-0201-01158）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 电极的制备

注意：胫神经、腓神经和 L6 神经刺激采用双极钩状电极²⁰。以下步骤简要描述了电极的设计与制作方法。

1. 剪取两根相同长度的125 µm聚四氟乙烯（PTFE）涂层银丝，并将其绞合在一起。
2. 从导线一端剥去4–5 mm的PTFE涂层，修整裸露端使其齐平，并将末端在23 G针头上向上弯曲，形成两个相距2 mm的平行钩状结构。
3. 将电极固定于平板上，使钩端朝上并伸出平板边缘。
4. 将双组分硅胶混合5秒，在距离钩端1–2 mm处滴加一滴胶液，静置干燥约5分钟。
5. 从电极另一端剥去1–2 cm长的PTFE涂层，以便连接刺激器。

2. 动物准备

注意：在无菌条件下，将一端经加热扩口的PE-50导管植入雌性Sprague-Dawley大鼠（250–300 g）的膀胱顶部，并用荷包缝合线固定。导管远端从动物背部引出，并盘绕于皮下囊袋中²¹。术后给予5天时间使膀胱恢复。

1. 按照机构批准的方案，使用尿烷（1.5 g/kg，腹腔注射）对动物进行麻醉。将尿烷分为三等份，每隔15分钟给药一次，实验开始前约2小时完成给药。
2. 将动物转移至加热垫上，并使其呈俯卧位。
3. 进行胫神经和腓神经刺激时，剃除大鼠后肢大腿区域以及背部下半部分的毛发。将大鼠尾巴和一支5 mL注射器置于其左后肢下方，并按图1A所示固定尾巴和腿部。
4. 进行骶神经刺激（SNS）时，剃除大鼠从尾部至胸椎的背部毛发，并在腹部下方放置一支50 mL离心管，以抬高腰骶区域。
   注意：所有神经刺激实验均为非存活性操作。请采用无菌外科技术。

3. 腓肠神经和胫神经的分离及电极植入

1. 使用手术刀在膝关节与坐骨结节之间的中点处做一个 3–3.5 cm 的切口（图 1B）。
2. 将剪刀插入皮下，剪开结缔组织，分离皮肤与肌肉。
3. 使用牵开器撑开皮肤，暴露臀大肌与股二头肌之间相连的筋膜（图 1C）。
4. 使用直剪刀剪开筋膜，并解剖臀大肌与股二头肌之间的间隙，直至观察到坐骨神经（图 1D，E）。
5. 将牵开器重新放置于股二头肌上，以充分暴露坐骨神经及其分支——胫神经、腓总神经和腓肠神经（图 2A）。此处“腓总神经”指在尚未分为深、浅腓总神经之前的共同干。胫神经是最大的分支；腓肠神经最小，腓总神经直径居中。
6. 使用弯头镊子和显微剪刀将腓总神经从周围结缔组织中分离。然后用显微镊子小心地向两侧及下方撑开组织，以游离出一段长约 5 mm 的神经。对胫神经重复相同操作，用于胫神经刺激（图 2B）。
   注意：避免用镊子夹持神经造成压伤，尽量减少对神经的牵拉。
7. 使用手术刀在背部下半段做一长约 5 mm 的切口，将止血钳经该切口插入皮下，建立皮下通道。小心推进止血钳，直至其尖端从后肢切口处穿出（图 2C）。
8. 用止血钳夹住电极未钩连的一端，缓慢将其从背部下半段的切口拉出。使用两把镊子将电极另一端（钩状端）弯折成与皮下平面呈 90° 角，并确保电极钩位于神经（腓总神经或胫神经）旁侧且与之垂直（图 2D）。
   注意：正确放置电极对于避免神经受牵拉至关重要。
9. 使用弯头显微镊子抬起神经，将电极的钩子滑入神经下方。将双组分硅胶混合 5 秒，用棉签擦干神经表面，并涂抹足量胶水覆盖电极钩及邻近神经区域（图 2E–G）。
   注意：在涂抹胶水前，应先将电极连接至刺激器，并在运动阈值水平刺激神经，以确认电极位置正确。运动阈值定义为引发足部节律性运动所需的最低电压。刺激腓总神经会引起足背屈的节律性运动，而刺激胫神经则引起足跖屈。若刺激后无运动反应，应检查刺激器与电极之间的连接。
10. 在背部切口处的结缔组织中缝合一针 5-0 尼龙固定缝线，留出足够长度的线头。这些线头用于固定电极，确保其位置稳定。
11. 使用 4-0 Vicryl 缝线缝合后肢切口处的皮肤。

L6神经暴露及电极植入

1. 使用手术刀在腰椎区域和骶骨上方做一条 4–5 cm 的正中切口。放置牵开器以撑开切口，暴露下方的背部肌肉以及椎骨棘突的尖端（图 3A）。
2. 触诊髂嵴，并以其为解剖标志定位 L6 棘突。L6 棘突可识别为位于髂嵴正下方的第一个棘突（图 3B）。
3. 使用剪刀去除覆盖于 L5 至 S2 椎骨上方的筋膜。然后仔细双侧分离并剥离椎旁肌，以暴露棘突、椎板和关节突。使用显微剪刀清除残留的结缔组织和肌肉，直至骨性结构清晰可见（图 4A、B）。
   注意：此操作形成一个解剖学窗口，暴露关键解剖标志，并提供对 L6 神经干的通路。识别 L6 的后关节突；L6 神经干走行于该关节的尾侧。同时识别骶骨及骶髂关节；L6 神经干走行于该关节的尾侧和内侧（图 4B）。
4. 使用咬骨钳小心去除 S1 棘突，并逐渐咬除 S1 与 S2 椎骨之间区域的骶骨小块骨质，以暴露 L6 神经干（图 4C）。
5. 使用弯头镊子和显微剪刀将 L6 神经从周围组织中分离。将神经钩置于双极聚四氟乙烯（PTFE）涂层银丝电极上，并如步骤 3.9 所述，使用生物相容性硅胶将其与周围组织隔离（图 4D）。
   注意：刺激 L6 神经可引起盆底肌肉收缩和尾部抽动。
6. 在对侧重复相同操作，以实现双侧神经刺激。
7. 使用 4-0 Vicryl 缝线缝合皮肤。

5. 将刺激电极插入骶孔

1. 使用手术刀在骶骨上方做正中切口，并使用牵开器撑开切口，暴露下方的背部肌肉。
   注意：如步骤4.2所述，触诊髂嵴以定位L6/S1解剖标志。
2. 采用钝性分离法将椎旁肌与棘突分离。调整牵开器的位置，使椎旁肌被牵开，充分暴露棘突，并便于进入S1骶孔（图5A）。
3. 确定S1孔的位置，其位于S1棘突的尾侧和外侧。使用预装单极电极的18号针头探查S1骶孔（图5B）。
   注意：使用直径180 µm的PTFE涂层不锈钢丝，两端各剥除5 mm绝缘层。
4. 将针尖置于S1孔处，保持与脊柱平行，并相对于动物背部倾斜约30°。在缓慢退出针头的同时，轻柔地沿神经走行推进导线。在对侧S1孔重复该操作，以实现双侧刺激。
   注意：为确认电极位置正确，将导线远端连接至刺激器。电刺激可引起尾巴抽动。
5. 使用5-0 Vicryl缝线将导线固定于相邻的L6棘突上（图5C）。
6. 使用手术刀在颈部背部做1 cm切口，用止血钳从颈部切口处向骶部切口处皮下钝性分离，建立皮下隧道。
7. 将导线远端经皮下隧道引出，从颈部背部切口处穿出（图5D）。
8. 使用4-0 Vicryl缝线缝合骶部的筋膜和皮肤，以及颈部背部的皮肤。

6. 膀胱压力测定记录

1. 5天后，在进行刺激实验之前，将PE-50导管外置，并连接至压力传感器和输注泵。
2. 以3 mL/h的速率持续向膀胱输注2小时，以使膀胱参数达到稳定状态。
3. 使用单次排尿周期的膀胱内输注法，在神经刺激前、刺激期间和刺激后评估膀胱测压参数，包括基础压力、阈值压力、膀胱顺应性、排尿压力和膀胱容量²¹。
4. 每次实验结束后，根据伦理标准，通过过量麻醉处死动物。

结果

为了演示评估神经调节对下尿路功能影响的实验设计，本研究展示了一项在膀胱过度活动大鼠模型中应用腓神经刺激的研究，该模型通过膀胱内灌注0.5%乙酸诱导。在刺激前、刺激期间和刺激后，采用单次排尿周期的膀胱压力测定法记录膀胱功能（图6 A,B）。实验设置包括两种不同持续时间的腓神经刺激，采用双相刺激波形，频率为10 Hz，脉冲持续时间为0.2 ms，刺激强度为运动阈值的3倍（1.2–3 V）。

在整个刺激期间，通过观察到足背周期性背屈，确认腓神经刺激成功。

腓神经刺激引起了排尿模式的明显变化，包括在刺激期间和刺激后膀胱容量均减少。长时间（1小时）刺激期间，排尿压力升高；短时间（10分钟）刺激后，基础压、阈值压和排尿压力均发生变化。

讨论

本文详细描述了在麻醉大鼠中植入电极以进行骶神经、胫神经和腓神经刺激的手术方法。

将引线电极植入骶孔以对S3骶神经进行持续低幅度刺激，是治疗下尿路（LUT）功能障碍和大便失禁的广泛接受的方法。在患者中，电极通常放置于S3骶孔，靶向有髓和无髓轴突的混合神经纤维²²。该位置对应于大鼠脊髓的L6–S1节段。在大鼠中准确定位目标神经具有挑战性，因此需要一份详细的分步操作方案，辅以清晰的视觉指引，并利用神经刺激诱发运动反应，以确认目标神经已被成功刺激。

在大鼠中使用胫神经刺激的研究，以往通常采用解剖分离胫神经并在踝关节内侧上方进行刺激，或使用针电极进行经皮刺激。本文介绍的方法通过单一切口暴露胫神经和腓神经自坐骨神经发出的起始部位，能够同时刺激这两条神经，同时显著简化操作步骤并降低手术侵入性。

2021年，Krhut等人首次提出将腓神经刺激作为一种神经调节方法，用于治疗膀胱过度活动症（OAB）患者^23<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18 G 一次性注射针头	KRUUSE	121282
Dumont 5TM 型镊子	DUMONT	1708-5TM-PO	弯曲型
Dumont 7XL 型镊子	DUMONT	0508-7XL-PO	弯曲型
Grass SD9 方波脉冲刺激器	Somatco	1077/183
止血钳	Fine Science Tools/Teleflex	13018-14/PO181059	≥ 14 cm，细尖头
虹膜剪	World Precision Instruments	14218	直剪
Kwik-Sil 硅胶弹性体	World Precision Instruments	KWIK-SIL	双组分胶
微型 Adson 镊子	World Precision Instruments	501245
显微剪刀	S&T	SAC-15 R-8	弯曲尖端 ≤ 10 mm 长
0.9% 氯化钠溶液 100 mL	B.Braun	N/A
PE-50 导管	Instech	BTPE-50
Prolene 5-0 缝合线	Ethicon	EH7257
咬骨钳	George Tiemann & Co	160-424-08	细弯曲尖端
手术刀	Swann-Morton	0505
乌拉坦	Sigma-Aldrich	U2500
Vicryl 4-0 缝合线	Ethicon	V451
Vicryl 5-0 缝合线	Ethicon	V303
直径 0.125 mm 银-聚四氟乙烯涂层导线	World Precision Instruments	AGT0525
直径 0.18 mm 不锈钢-聚四氟乙烯涂层导线	World Precision Instruments	SST30407-50