Bex-Plex 实现蛋白质标志物与核糖核酸转录本的同时可视化，用于完整组织的深度空间分析

摘要

本文介绍了一种将迭代蛋白染色技术（IBEX）与RNAscope相结合的实验方案。 原位 用于完整固定冷冻组织深度空间表型分析的杂交技术，适用于高分辨率空间谱型分析应用。

摘要

本文介绍一种可在完整组织中以单细胞分辨率同时进行蛋白质和核糖核酸（RNA）标志物空间分析的实验方案。实体瘤癌症研究面临的核心问题之一是无法预测患者对治疗干预的响应。解析这些复杂性需要在完整组织内对细胞行为、相互作用及表型进行定量测量。具体而言，蛋白质组和转录组提供的是部分重叠但非冗余的信息，这些信息对于设计合理的免疫治疗策略至关重要。然而，目前尚无简单且经济高效的方法，能够在保留肿瘤微环境中所有细胞关键空间定位信息的同时，深入分析其转录状态和功能状态。为此，我们成功地将IBEX（迭代漂白扩展多重性）平台与HiPlex RNAscope技术相结合，实现了在单细胞分辨率下对高重蛋白质标志物和高重核糖核酸（RNA）转录本的同步可视化。该方法引入了一步改良的RNA靶标修复步骤，以保持细胞核形态，并实现各循环间准确的图像对齐。“Bex-Plex”技术使我们能够在固定冷冻组织上先执行标准的IBEX流程，随后进行HiPlex RNAscope流程，并在其中采用改良的RNA靶标修复步骤，确保与IBEX各循环在细胞核水平上的精确对齐。本方案针对固定冷冻组织进行了优化，支持对转录状态和功能状态的细胞进行整合性空间分析。在单细胞水平上进行此类分析的能力，不仅为组织本身提供了丰富的信息资源，还有助于预测驱动治疗响应的精细细胞间相互作用，从而为研究肿瘤微环境及相关系统中的空间生物学提供了有力框架。

引言

自2011年问世以来，通过阻断抑制性免疫检查点分子（如PDL-1和CTLA-4）以减轻细胞毒性T细胞受抑制的癌症免疫疗法，已成为实体瘤治疗的金标准¹。然而，尽管在患者中广泛应用，这些药物的临床疗效差异显著，因为许多实体瘤本身即具有内在耐药性，或最终会发展出对这些疗法的耐药性²。在许多情况下，这是由于实体瘤具有高度异质性，即使在同一癌症类型中亦如此³。更深入地理解实体瘤中发生的细胞间关系，是开发更优治疗策略的关键。因此，明确介导并维持这种耐药性的具体机制和相互作用，已成为癌症研究的前沿课题。本文旨在建立一种方法，实现对完整组织中蛋白质和RNA表达的整合性空间分析，以更准确地表征这些复杂的细胞相互作用。

肿瘤微环境（TME）由非癌细胞及其结构组分构成，可影响肿瘤生长和免疫应答，其中包括与肿瘤相关的成纤维细胞、浸润性免疫细胞、血管组分以及细胞外基质⁴。近年来，研究已明确TME的组成与空间结构显著影响肿瘤是否允许或抵抗免疫细胞浸润，这是决定免疫治疗疗效的关键因素之一⁵。在多种癌症中，存在一种“免疫荒漠”表型，其特征是T细胞数量较少且富含高度免疫抑制性的髓系细胞群体，该表型与对免疫检查点阻断疗法反应不佳密切相关^6,7。趋化因子信号通路调控了多种免疫细胞的募集过程。例如，CXCL1和CCL2可吸引具有免疫抑制功能的髓系细胞，而CXCR3-CXCL9/CXCL10轴则介导细胞毒性T细胞和调节性T细胞向肿瘤组织的迁移⁸。因此，特定微环境中的信号网络可强烈影响细胞的表型与功能。例如，在结直肠癌患者中，CCL5-CCR5轴调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的免疫抑制功能，阻断该信号通路可使TAMs向抗肿瘤表型转化，并与更好的临床疗效相关⁹。此外，免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞和/或肿瘤细胞之间通过ICAM和PDL-1发生的直接相互作用，可诱导免疫耗竭并削弱抗肿瘤免疫应答¹⁰。综上所述，这些发现凸显了开展空间分辨分析的重要性，以深入理解TME如何影响治疗效果。

免疫荧光（IF）成像仍是可视化组织中蛋白质表达和细胞间相互作用的基础方法。该领域已从传统的3-4色IF发展为依赖多轮染色与成像的高通量成像工作流程。在这些方法中，通过反复进行抗体标记、成像以及荧光染料的淬灭或去除，从而实现更多标志物的染色与成像，生成大规模数据集¹¹。近期推出的迭代淬灭扩展多重性（Iterative Bleaching Extends Multiplexity, IBEX）是一种用户友好且成本效益高的迭代成像平台¹²。IBEX可兼容商用抗体和常规显微镜，利用硼氢化锂（LiBH₄）淬灭多种常用荧光染料的信号，同时不破坏组织中的抗原表位，从而可在单个组织样本中获取多达75个参数¹³。通过循环染色获得的图像使用SimpleITK开源软件进行配准，生成适用于高维空间分析的整合数据集。

与蛋白质水平的表型分析相辅相成，空间转录组学方法能够提供细胞在其原生微环境中转录状态的宝贵信息。值得注意的是，原位杂交（in-situ hybridization, ISH）是一种常用技术，可用于鉴定特定组织中DNA或RNA序列的定位¹¹。RNAscope是一种成熟的ISH方法，采用具有独特Z结构的探针，在单分子分辨率下特异性扩增RNA转录本，并适用于多种不同类型的样本¹⁴。作为由Advanced Cell Diagnostics（ACD）公司提供的广泛应用且商业化平台，RNAscope提供了针对多种靶标的经验证探针，从而简化了各类应用的实验设计。

通过在同一组织中联合检测蛋白质和RNA，可以获得更全面的细胞身份与功能信息。短寿命的分泌蛋白（如细胞因子和趋化因子）传统上难以通过免疫组化（IHC）实现可靠的抗体染色，但通过定量其mRNA转录本可获取相关表达信息。以往的RNA与蛋白质共检测方法（如传统的显色IHC或TSA-OPAL）受限于非线性的信号放大以及耗时的抗原修复步骤¹⁵。与这些方法相比，Bex-Plex技术能够在保持空间背景和细胞核形态以实现精确图像配准的同时，实现高重蛋白质和RNA的同步检测。

本文介绍了“Bex-Plex”技术，该方案整合了IBEX和RNAscope平台，可对天然组织中细胞的转录和翻译状态进行同步、可量化的表征。在Bex-Plex中，固定后包埋于OCT中的组织首先进行标准的IBEX流程，随后采用稍作修改的RNAscope HiPlex工作流程，其中靶点修复步骤在60°C下孵育1小时，而非原始方案中的99°C孵育5分钟。此条件有助于保持细胞核结构的完整性，从而在将免疫荧光（IF）和原位杂交（ISH）循环获得的独立图像整合为一幅图像时，实现定位标记的精确对齐。该方案特别适用于需要在完整组织中同步进行蛋白质与RNA表达空间分析的研究，尤其适用于组织样本有限或空间结构的保存至关重要的研究场景，例如肿瘤微环境分析或免疫谱型研究。

Bex-Plex 实验使用广泛可得的试剂，并且兼容大多数成像平台，任何熟悉荧光成像并可使用常规显微镜的技术熟练科研人员均可开展该实验。本文所展示的方案已针对固定冷冻样本进行了优化。目前，该方案已在固定冷冻组织中得到验证，若应用于其他类型的样本（如福尔马林固定石蜡包埋样本或人类临床标本），可能需要进一步优化。

对于组织样本有限或珍贵的情况（如组织活检或样本量有限的动物实验），以及使用解离技术难以提取的细胞表型分析，该工作流程将具有重要价值。Bex-Plex 能够在保留细胞空间位置信息的同时，提供单个细胞转录组和翻译组的同步、可量化数据，这些数据特别适用于研究细胞在其原始环境中相互关系及信号交流的问题。

方案

本方案中所述实验程序已获得加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会（协议编号 S24049）的批准。实验所用小鼠为7至12周龄、C57BL/6遗传背景的雄性和雌性小鼠，饲养于特定病原体阴性条件下。

1. 组织制备

1. 采用批准的首要和次要措施（如 CO₂ 安乐死和颈椎脱位）对实验小鼠实施安乐死，并将目标组织收获至添加补充物的培养基中。 
2. 通过将4%的多聚甲醛（PFA）储备液用1×PBS稀释至0.5%或1%的终浓度，配制新鲜的组织固定液。对于体积较小的组织（如淋巴结），使用0.5% PFA；对于体积较大的组织（如肿瘤），使用1% PFA。
   警告：多聚甲醛具有可燃性，若摄入或吞咽则有毒。操作时应穿戴适当的个人防护装备，避免接触皮肤或眼睛。
3. 将组织转移至24孔板中，每孔加入2 mL固定液，并于4°C下过夜孵育。
   注意：孵育时间超过16小时可能导致过度固定问题。
4. 用1×PBS填充新的24孔板各孔，并将组织从固定液孔板转移至其中。
   暂停点：如有需要，组织可在4°C条件下于1×PBS中保存最多7天。
5. 使用解剖显微镜和工具逐个修剪组织上的多余脂肪或碎片。在修剪过程中，直接向组织上添加少量1×PBS以防止组织脱水。
6. 通过将粉末状蔗糖储备物溶解于1×PBS中，配制30% w/v的蔗糖溶液。
7. 将组织转移至24孔板中，每孔加入2 mL 30%蔗糖溶液，并于4°C下过夜孵育以完成脱水。当组织沉降至孔底时，表明脱水已充分。
8. 向已标记的冷冻模具中填充OCT包埋剂，并逐个将组织放入模具中。组织的摆放方向取决于其来源，但通常建议将组织的最大表面与模具底部保持平行。确保组织完全浸没于OCT中。
9. 置于干冰上冷冻10分钟，随后于-80°C保存。

2. 组织切片

注意：本方案所用的所有试剂和实验材料必须为无RNase的。处理载玻片时需注意防止污染。

1. 用15 µL无RNase的明矾铬胶将无RNase载玻片涂覆，在60°C烘箱中孵育1小时。涂有明矾铬的载玻片可在室温下保存长达一个月后再使用。
2. 将OCT包埋的组织从-80°C冰箱中取出，放入-20°C冷冻切片机/切片机中，平衡至少20分钟。
3. 将组织切片至明矾铬涂层载玻片上，厚度为10–15 µm。
4. 将带有切片的载玻片在4°C保存；若当天染色，则让载玻片恢复至室温。切片后的载玻片可在4°C保存最多5天后再使用。

3. 蛋白质染色

1. 在染色缸中，将待染色的切片浸入无RNase的1×PBS中5分钟，以去除组织中多余的OCT。
2. 使用疏水屏障笔在载玻片上的组织周围画圈，室温静置 2 分钟使其干燥。
3. 配制10 µg·mL⁻¹ RNase-free 1X PBS 中的抗小鼠 FC 受体阻断剂 将封闭缓冲液加入载玻片上的样本，用量需足以形成完全覆盖组织的液滴（100–150 μL）。 µL·部分^-1).
   注意：对于较难处理的组织和/或标记物，有时需在封闭缓冲液中添加 FBS 或 BSA（通常为 1–2%）。
4. 将切片置于湿润染色盒中，室温孵育1小时，然后将其完全浸入盛有无RN酶的1×PBS的浸洗槽中，洗涤5分钟。 
5. 在无RNase的1×PBS中配制一抗染色液，每张切片计划使用100–200 μL µ每组织切片加入 L。标准抗体稀释比例为 1:50–1:200，但建议进行单染滴定实验，以确定特定抗体和/或组织类型的最优稀释倍数。加样前需涡旋振荡并瞬时离心抗体溶液，以防止荧光聚集物的形成。
6. 从洗涤液中取出载玻片，使用吸水纸从样本区域的角落轻轻吸去多余液体，以避免稀释抗体溶液。 
7. 以与封闭液相同的方式将抗体溶液加至组织上，使液体在组织上形成气泡。  
8. 将载玻片水平放置于37°在烤箱中孵育1小时。或者，在湿盒中室温孵育3–4小时。可使用已针对目标组织优化的标准免疫荧光（IF）方案。孵育过程中应将切片置于湿润环境中，以防止脱水（例如，在染色盒底部使用湿润的纸巾）。
9. 将切片浸入无RN酶的1×PBS中洗涤2分钟，重复两次，共洗涤三次。如果染色方案需要，可在此期间用无RN酶的1×PBS配制二抗染色液。标准抗体稀释比例范围为1:500–1:1000，但建议进行单染滴定实验，以确定特定抗体和/或组织类型的最优稀释倍数。
10. 用吸水纸擦去玻片上多余的 PBS，并加入 100–200 µL 的二抗染色液加入每张组织切片中。将载玻片水平放置于 37°在烘箱中于37 °C孵育30分钟。或者，也可将载玻片置于湿盒中于室温染色1–2小时。
11. 将切片浸入1×无RN酶的PBS中洗涤2分钟，重复两次，共洗涤三次。
12. 将DAPI核染料稀释至终浓度为0.2 µg·mL⁻¹ 在无RNase的1×PBS中，并加入100–200 µ每片组织切片加入 L。
13. 在湿盒中室温孵育切片10分钟，然后将其浸入无RN酶的1×PBS中，上下轻摇短暂浸泡，洗涤一次。
14. 用吸水纸擦去玻片上多余的液体，并加入 20–30 µ向每张切片加入适量水性抗荧光淬灭封片剂，小心盖上盖玻片，避免产生气泡，并让封片剂固化15–30分钟。
15. 对染色后的切片进行成像。有关IBEX的面板设计考量及图像采集的更详细说明，请参见已发表的原始IBEX实验方案。^12,13.
    暂停点： 将已装片的载玻片避光保存于 4°在4°C下最多可保存3天，但我们建议立即进行后续操作，以确保RNA降解最小化。

4. 荧光团淬灭与迭代性蛋白质染色

1. 将切片浸入无RNase的1X PBS中，直至盖玻片可轻松滑落而无需施加外力。根据盖玻片封片时间的长短，此过程可能需要长达16小时。
2. 在切片浸泡的同时，通过轻轻混匀使LiBH₄溶于无RNase的去离子H₂O中，配制成1 mg·mL^⁻1的溶液，并静置10分钟以激活。当溶液中出现气泡时表明已激活，激活后的溶液活性可维持长达4小时。
   注意：LiBH₄遇水反应，应避免粉末原液过度接触湿气，并按规定妥善处理废弃物。
3. 用无RNase的1X PBS将切片洗涤一次，每次2分钟，以去除任何封片介质残留，然后向每张组织样本上加100–150 µL LiBH₄溶液。在湿盒中孵育15分钟。
   备注：根据染色所用的荧光染料不同，此孵育时间可能需要延长（详见IBEX方法学文献）^12,13。
4. 将切片浸入无RNase的1X PBS中，上下轻轻晃动，短暂浸洗一次。
5. 按照步骤3.5–3.15对切片进行额外蛋白标志物的染色。无需重新染核染料，因其不会被LiBH₄漂白。如有必要，可重复蛋白染色。
   暂停点：封片后的切片可在进行最后一次蛋白/IBEX循环漂白并转入RNA步骤前，在4°C下过夜保存。
6. 在完成最后一轮荧光染料漂白后，应立即进入RNAscope HiPlex步骤。尽管已有研究在未造成组织或表位丢失的情况下完成了多达六个标准IBEX循环，但由于长时间操作可能导致RNA转录本质量下降，本方案不建议蛋白染色循环超过三次。

5. RNAscope HiPlex 的载玻片制备

1. 将切片完全浸入无RN酶的1×PBS中，直至盖玻片无需施加外力即可轻松滑落。根据盖玻片封片时间的长短，此过程可能需要长达16小时。用无RN酶的1×PBS洗涤一次，每次2分钟，以去除残留的封片介质。
2. 配制 200 mL 50% 乙醇、200 mL 70% 乙醇和 400 mL 100% 乙醇。
3. 打开杂交炉并将其温度设置为 60°C. 将10X靶点修复试剂用无RN酶的去离子水稀释至1X工作液₂O，并在步骤5.8之前将其放入烘箱中预热。
   注意：未将靶标修复试剂预热至 60°C 将影响不同周期图像的下游配准。靶点修复试剂必须保持在 60°在靶标 retrieval 步骤期间保持在 C。
4. 将切片浸入50%乙醇中，在室温下孵育5分钟。
5. 将切片从50%乙醇中取出，浸入70%乙醇中，在室温下孵育5分钟。
6. 从70%乙醇中取出载玻片，浸入100%乙醇中。室温孵育5分钟，更换新鲜的100%乙醇，重复一次。
7. 从100%乙醇中取出载玻片，在室温下干燥5分钟。
8. 加入100–150 µL 的 60°将1X靶点修复试剂加入每个组织切片，并将切片置于杂交炉中。在60℃下孵育°C，1 小时。
9. 取出切片，浸入无RN酶的去离子水中漂洗15秒。此时，将烘箱的设定温度更改为40°C.
10. 将切片转移至100%乙醇中，孵育5分钟，然后在室温下干燥至少5分钟。
11. 向载玻片上的组织切片加入蛋白酶III，每张组织切片1–2滴。将载玻片放入杂交炉中，在40℃下孵育°30 分钟，C
12. 将切片浸入无RNase的去离子水中₂O，并通过短暂上下浸入蒸馏水中进行洗涤。用新鲜蒸馏水重复洗涤一次，共洗涤两次。

6. RNAscope 试剂准备与探针杂交

1. 将RNAscope HiPlex探针原液和HiPlex探针稀释液置于40°C烘箱或水浴中加热10分钟，使其充分解冻。
2. 短暂离心所有50X探针原液。使用RNAscope探针稀释液将每种特异性靶标探针稀释至1X浓度，配制工作探针混合液。每张组织切片使用50–100 µL探针混合液，使用前充分涡旋混匀。RNAscope HiPlex实验流程最多可支持3轮、每轮4种探针（共12种探针，标记为T1-12）的检测。有关探针设计的指导，请参考ACD公司发表的原始RNAscope实验方案¹⁴。
3. 将RNAscope HiPlex Amp 1–3和HiPlex Fluoro T1-T4试剂置于室温平衡。
4. 取出经Protease III处理的切片，向每张组织切片上滴加50–100 µL探针混合液。将切片水平放入杂交炉中，在40°C条件下孵育2小时。
5. 将切片完全浸入1X洗涤缓冲液中清洗2分钟，更换新鲜缓冲液重复清洗一次，共清洗两次。
   暂停点：根据ACD公司RNAscope实验方案描述，切片可在室温下保存于5X SSC缓冲液中过夜。若使用此暂停点，则次日早晨需用1X洗涤缓冲液再进行两次、每次2分钟的清洗。

7. 探针扩增

注意：将试剂应用于载玻片前，请确保所有试剂均已平衡至室温。

1. 向切片上加入 1–2 滴 HiPlex Amp1 试剂，在杂交炉中 40°C 下孵育 30 分钟。将切片完全浸入 1X 洗涤缓冲液中清洗 2 分钟，重复清洗共 2 次。
2. 向切片上加入 1–2 滴 HiPlex Amp2 试剂，在杂交炉中 40°C 下孵育 30 分钟。将切片完全浸入 1X 洗涤缓冲液中清洗 2 分钟，重复清洗共 2 次。
3. 向切片上加入 1–2 滴 HiPlex Amp3 试剂，在杂交炉中 40°C 下孵育 30 分钟。将切片完全浸入 1X 洗涤缓冲液中清洗 2 分钟，重复清洗共 2 次。
4. 向切片上加入 1–2 滴 HiPlex Fluoro T1-T4 试剂，在杂交炉中 40°C 下孵育 15 分钟。将切片完全浸入 1X 洗涤缓冲液中清洗 2 分钟，重复清洗共 2 次。
5. 向每个组织切片上加入 3–4 滴 HiPlex DAPI 试剂，在室温下孵育 1 分钟。
6. 用吸水纸轻轻吸去切片上的 DAPI 液体。立即向每个切片加入 100 µL 水性抗荧光淬灭封片介质（可使用与 IBEX 染色步骤中相同的试剂）。小心盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，并让封片介质干燥 15–30 分钟。
7. 进行成像。
   暂停点：封片后的切片可在 4°C 避光保存最多 3 天，但我们建议尽快进行成像以确保 RNA 降解最小化。

8. 裂解荧光团与迭代RNA杂交

1. 从载玻片上取下盖玻片：将载玻片浸泡于 4X SSC 缓冲液中，室温下至少 30 分钟。用新鲜的 4X SSC 缓冲液完全浸没载玻片，上下轻晃短暂清洗一次。
2. 打开一支新的裂解液安瓿，用 4X SSC 缓冲液稀释配制 10% 的工作液。
3. 将载玻片放入湿盒中，加入 3–4 滴 10% 裂解液。室温孵育 15 分钟，然后将载玻片完全浸入 0.5% PBST 中清洗 2 分钟。更换新鲜 PBST 重复清洗一次，共清洗两次。
4. 若需进行 RNAscope 面板的第二轮成像循环，请将 HiPlex Fluoro T5-T8 试剂平衡至室温。
5. 打开杂交炉，将温度设定为 40°C。
6. 向载玻片上加入 HiPlex Fluoro T5-T8 试剂，在杂交炉中 40°C 孵育 15 分钟。将载玻片完全浸入 1X 洗涤缓冲液中清洗 2 分钟。更换新鲜洗涤缓冲液重复清洗一次，共清洗两次。
7. 小心用吸水纸吸去载玻片上多余的液体。立即向每个组织区域加入 100 µL 封片介质，并小心地在载玻片上加盖盖玻片。封片介质干燥 15–30 分钟后，即可进行成像。
8. 根据需要，使用 HiPlex Fluoro T9-T12 试剂重复步骤 8.1–8.7，最多完成 3 轮 RNAscope 循环。需注意，尽管 RNAscope HiPlex 协议支持 3 轮循环，但本方案中额外的蛋白染色时间可能影响 RNA 质量。因此，具体靶向的转录本不同时，3 轮循环未必总能实现。

9. 图像处理

1. 分别处理每一轮的原始文件，并使用一致的参数进行图像处理，包括背景扣除设置、平滑滤波器和配准变换类型。通道名称应使用一致的分隔符字符（例如：第1轮：CD45 AF532，其中“:”用于区分轮次与标记物/荧光染料）。
2. 启动 SimpleITK 软件（https://github.com/niaid/sitk-ibex），点击 Imaris 扩展 > SimpleITK > 基于共用通道的 z-stack 图像仿射配准。
3. 从每个多重轮次中上传一幅图像文件，并输入所有通道名称中使用的分隔符字符（例如“:”）。
4. 选择用于图像配准的通道以及作为固定图像的参考图像，其余图像将据此对齐。推荐使用 DAPI 作为基准标记，但也可选用所有轮次中均存在的任意共用通道。
5. 点击“配准”，然后点击“重采样并保存合并图像”。
6. 使用您选择的软件进行后续分析。有关图像处理与配准的更多信息，请参考原始 IBEX 方案^12,13。

结果

图1： Bex-Plex工作流程概览。
固定后的冷冻组织切片置于铬矾涂层载玻片上，进行最多3轮标准IBEX流程，随后进行最多3轮RNAScope HiPlex流程，其中初始靶标修复步骤在60°C下进行1小时。来自不同循环的图像随后利用定位标记物（例如DAPI）进行图像配准与对齐，以生成用于下游分析的多重数据集。请点击此处查看该图的放大版本。

我们采用上述方案对小鼠胰腺导管腺癌（PDAC）模型的肿瘤微环境（TME）进行表征 （...

讨论

Bex-Plex 工作流程将迭代性蛋白质染色平台 IBEX 与 RNAscope 原位 杂交技术相结合，能够在单细胞分辨率下同时检测蛋白质和RNA转录本。本实验方案的主要目标是提供一种可重复的方法，用于对完整组织内蛋白质和RNA表达进行整合式空间分析。在同一组织中同时检测蛋白质和RNA表达此前面临诸多技术挑战：成本高昂、抗原修复步骤复杂、多重检测能力有限、分辨率不足（非单细胞水平）、信号放大非线性，以及下游分析需要复杂的生物信息学流程^17,18,19。与现有的多重免疫荧光、OPAL/TSA染色和空间转录组学平台相比，Bex-Plex 能够在保持空间背景和细胞核形态完整的前提下，实现可重复、定量且高重数的同步检测。此外，Bex-Plex 可在标准实验室环境中完成，生成的数据具有单细胞分辨率，且易于后续处理。利用该方案深入理解多种组织环境中（如肿瘤微环境）的细胞间相互作用，对于开发更有效的免疫疗法并改善不同疾病状态下的患者预后至关重要。

我们的方法在包埋于OCT中的固定组织上进行，遵循标准的IBEX工作流程而不作修改，随后采用稍作调整的RNAsc...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 微量离心管	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 证明乙醇（EtOH）	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC 缓冲液	Invitrogen	AM9765
24 孔板
Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD11b 抗体	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 抗小鼠 CD3e 抗体	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly6G 抗体	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 抗小鼠 CD68 抗体	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm 固定与通透溶液	BD	554722
铬明胶	Fisher	NC1692262
共聚焦显微镜（例如 Leica Stellaris）
冷冻模具	VWR	25608-922
冷冻切片机（例如 CryoStar NX50 Cryostat）	Thermofisher Scientific	957100
冷冻切片机刀片（例如 Leica 低剖面一次性刀片 DB80LX）	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
解剖显微镜（例如 Zeiss SteREO Discovery.V8）
解剖工具
干冰
载玻片染色浸渍罐（例如 Simport Scientific EasyDip 载玻片染色罐）	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
加热恒温水浴
组织学刷（例如 Ted Pella 驼毛刷）	Fisher Scientific	NC2023341
杂交炉（例如 HybEZ II 杂交系统）	ACD	321710
可选图像分析软件
ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
硼氢化锂	STREM Chemicals	93-0397
微量移液器（P-10、P-20、P-200、P-1000）
小型微量离心机（例如 Corning LSE 小型微量离心机）	Corning	6770
小鼠 BD Fc 封闭剂	BD	553142
1.5 号盖玻片	VWR	48393-241
移液器吸头（P-10、P-20、P-200、P-1000）
RNAscope HiPlex 探针，mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex 探针，mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 试剂盒 v2（包含检测试剂、裂解储备液、蛋白酶试剂、靶点修复试剂和洗涤缓冲液）	ACD	324409
RNAscope 蛋白酶 III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK 软件：https://github.com/niaid/sitk-ibex
载玻片染色托盘/湿室
蔗糖 Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus 显微载玻片	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT 包埋剂	VWR	25608-930
Tween-20，分子生物学级	Promega	H5152
UltraPure 无 DNase/RNase 水	Fisher Scientific	10977023