方法文章

利用人源天冬酰胺合成酶的冷冻电镜图谱可视化蛋白质构象动态的工作流程

DOI：

10.3791/70312

⸱

2026年3月20日

1Department of Biochemistry, Molecular Biology and Pharmacology, Indiana University School of Medicine

本文内容

摘要

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本方案概述了如何在CryoSPARC中进行三维变异性分析（3DVA），并在Phenix中进行变异性精修，以分析冷冻电镜数据中的构象异质性。以人源天冬酰胺合成酶为例，本方案详细说明了如何生成变异性图谱、可视化主成分，并对相应的原子模型进行精修。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用CryoSPARC中的三维变异性分析（3DVA）和Phenix中的变异性精修，对单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）数据中的构象异质性进行系统分析的完整工作流程。该方案描述了如何基于颗粒图像计算主成分方向上的变异性图谱，可视化主要的结构变化模式，并针对各个变异性帧精修相应的原子模型集合。最终输出结果包括一系列三维变异性图谱、代表离散构象状态的精修多模型原子结构，以及适用于比较性结构分析和动画生成的可视化文件。该工作流程广泛适用于分辨率范围通常为~2.0–6.0 Å的冷冻电镜重构数据，在此分辨率下可对主链和侧链水平的构象异质性进行有意义的解释。该方法特别适用于捕捉连续的结构域运动、铰链弯曲运动以及仅靠离散分类难以分辨的协同局部重排。变异性图谱与精修模型集合的联合使用，可实现对构象极端状态的直接结构比较，支持诸如均方根涨落（RMSF） 等定量分析，并为关联动态结构特征与生化或功能假说提供框架。本文以人源天冬酰胺合成酶（ASNS）为例，演示该工作流程的实际应用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

表征大分子结构中的构象异质性在单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）分析中正变得日益重要。本实验方案旨在提供一个实用的工作流程，用于从冷冻电镜数据集中直接提取、可视化并精修主要的结构变异模式，该流程结合了CryoSPARC1中的三维变异性分析（3DVA）与Phenix2中的变异性精修。本文旨在指导读者判断该计算方法是否适用于其数据，并理解该工作流程所产生的各类输出结果。

传统的实验技术（例如氢-氘交换、核磁共振波谱、质谱）可提供有关蛋白质运动的重要信息3,4,5，但通常受限于分子大小、样品需求或实验复杂性。冷冻电镜（cryo-EM）技术的进步使得对大尺寸和异质体系进行高分辨率结构解析成为可能，从而能够分析颗粒群体内的构象变异性。CryoSPARC1 中实现的三维变异性分析（3D variability analysis, 3DVA）可将冷冻电镜颗粒数据集分解为主成分，以描述结构变异中的主要连续模式。当该方法与 Phenix2 中的变异性精修相结合时，可生成沿每个主成分离散位置对应的原子模型，从而实现基于实验数据推导出的替代构象的可视化与比较。

该实验方案最适合用于近原子分辨率至中等分辨率（通常约为 2–6 Å）的冷冻电镜数据集。在更高分辨率下，该工作流程可捕捉主链的重排以及有限的侧链变异6；而在较低分辨率下，则更适用于识别结构域层面或二级结构的运动2,7。该方法适用于捕捉在数据集中广泛存在的、占主导地位的连续运动模式，例如铰链运动、结构域呼吸运动，或结构域之间或亚基之间的协同重排。足够的颗粒数量和充分的角度覆盖至关重要；在柔性较强或分辨率较低的区域，由于侧链位置不明确，解释结果可能会受到限制。与聚焦分类8或广泛的子分类策略相比，三维变异性 refinement 工作流程将构象异质性表示为连续轨迹，而非离散的类别。这使得该方法在对预期会采样多种构象的酶、分子机器以及多结构域复合物进行探索性分析时尤为有用。

人源天冬酰胺合成酶（ASNS）被用作示例，以展示本方案的实施过程。ASNS 是一种依赖谷氨酰胺的酰胺基转移酶，由两个功能结构域组成，这两个结构域通过分子内氨通道相连9,10。先前的研究表明，涉及如 Arg-142 等残基的构象变化可能调控该通道的开闭6。本文中，ASNS 仅作为代表性体系，用于演示 3DVA 和变异性精修如何生成变异性图谱、精修后的原子模型集合以及可视化结果。详细的机制性解释将在结果与讨论部分展开。尽管分子动力学（MD）模拟常被用作探索构象景观的补充手段11,12，但本方案无需进行 MD 模拟。与 MD 模拟的比较可作为可选的下游分析进行，但本文所述工作流程（图 1）专注于从冷冻电镜数据中提取并可视化构象异质性。

显示模型中构象异质性的三维重建和变异性分析示意图。
图 1．工作流程概览。 从单颗粒数据重建出一致性的冷冻电镜图谱，并进行三维变异性分析（3DVA），以生成沿主成分方向的变异性图谱。变异性精修（Phenix.varref）利用一致性原子模型生成相应的原子模型，用于可视化和比较。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

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1. 数据准备

  1. 生成共识 EM 图谱
    1. 使用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）测定大分子复合物的共识三维结构。
    2. 将样品在冷冻电镜载网上玻璃化，并使用配备直接电子探测器的高压透射电子显微镜进行成像。
    3. 对采集的电影数据进行处理，校正电子束诱导的运动，估计成像参数，并挑选颗粒图像。
    4. 对颗粒进行迭代分类与精细化，以生成共识 EM 图谱。
    5. 使用 CryoSPARC（v4 或更高版本）13 进行数据处理，因为将实施三维变异性 分析（3DVA）。
  2. 生成共识模型
    1. 构建原子模型，并依据共识图谱对其进行精细化。使用标准准则验证精细化后模型的质量
      注：对于 ASNS，结构是通过基于模板的颗粒挑选策略确定的。在 CryoSPARC13 中，使用来源于人源 ASNS 的 X 射线结构（PDB 6GQ3）9 的模板，以高效筛选高质量颗粒。这些颗粒经过多轮迭代的二维分类、Ab initio 重构，以及施加 C2 对称性的非均一和异质精细化，最终获得分辨率为 3.5 Å 的共识图谱。原子模型通过将晶体结构9 拟合到 EM 图谱中生成，随后在 Phenix14,15 中进行实空间精细化，并在 Coot16 中进行手动调整，最终得到如文献所述的 ASNS 共识结构6。

2. 执行三维变异性分析（3DVA）

  1. 使用粒子堆栈和掩膜（非最终优化后的图谱）进行最终优化
    注意：通常将非均匀优化任务的结果用于三维变异性分析（3DVA）。
  2. 在CryoSPARC中创建一个三维变异性（3D Variability）任务，输入来自非均匀优化任务的粒子堆栈和掩膜。
  3. 设置求解模式数量（Number of modes to solve）为主成分（PCs）数量5个。
    注意：由于大分子结构存在于三维空间中，通常至少需要三个主成分来描述其主要的空间运动模式。为确保不遗漏其他可能较小但具有功能相关性的构象变化，额外增加了两个主成分。
  4. 设置滤波分辨率（Filter resolution）为4.0 Å，高通滤波分辨率（Highpass resolution）为20。其余参数保持默认值，启动任务。
    注意："滤波分辨率"设为4.0 Å，以匹配数据集的整体质量，同时避免对高频噪声过拟合。由于最终共识图谱的分辨率为3.5 Å，采用略低的滤波分辨率（4.0 Å）可确保变异性分析聚焦于真实的结构运动，而非接近分辨率极限的噪声。
  5. 获得一组输出的变异性体积图（图2A）

3. 执行三维变异性展示

  1. 在 CryoSPARC 中创建一个 3D 变异性显示（3D Variability Display）任务，以可视化 3DVA 识别出的连续构象变化。
  2. 输入来自 3DVA 任务生成的粒子堆栈和变异性体积数据。
  3. 选择Simple作为输出模式（见下文）。
  4. 将Filter resolution设置为 4.0，将Highpass resolution设置为 20。其余参数保持默认值。启动 该任务。
  5. 获得 20 个变异性图谱作为输出结果（帧 0 至 19），对应 5 个主成分（PC，编号 0 至 4）（图 2B）
    注意：3D 变异性显示程序中的"simple mode"可对每个主成分上的构象变化提供直观的可视化展示。该模式在 3DVA 识别出的极端状态之间生成线性轨迹，从而清晰、直接地呈现粒子群体内的运动模式。

4. 电影和 Phenix 3D 变量精修的数据准备

  1. 下载3DVA变异图：从CryoSPARC下载包含主成分0-4（共五个压缩包）的变异图压缩文件。
  2. 整理目录：创建一个主文件夹（例如 3DVA/），并在其中为每个主成分创建一个子文件夹（comp0、comp1、comp2、comp3、comp4）。
  3. 将每个压缩包移至对应的子文件夹中，并解压其内容。
  4. 确认每个文件夹包含20个变异图（帧0-19），并对comp1至comp4重复此步骤。
    注意：为防止不同主成分之间的帧混合，请为每个主成分保持独立的文件夹。

5. 在 UCSF Chimera 中制作快速动画（可选）17

  1. 打开体积序列工具：启动 Chimera，然后依次选择 工具 → 体积数据 → 体积序列。将弹出一个新窗口 体积系列 窗口将打开。
  2. 加载地图：点击“打开”，选择对应于一个主成分的20张地图（例如，comp0）。
  3. 调整可视化参数：打开体数据查看器，设置合适的密度阈值，并为图谱分配颜色。
    注意：在本示例中， 天蓝色 被使用（图3).
  4. 预览运动：在 体积系列 将播放方向设置为“来回播放”，然后点击“播放”按钮，以连续显示从第 0 帧 → 19 帧 → 0 帧的过渡。
  5. 根据需要对其他主成分重复步骤5.2–5.4。
  6. 使用命令行输入生成电影文件：通过打开 Chimera 命令行并运行以下命令来导出电影 补充编码文件 1.
    注意：每个组分的20帧mrc序列（例如，compX_frame000-019.mrc）是Phenix 3D变分辨率 refinement 的输入文件。请将各组分文件夹（comp0-comp4）分开存放，以避免不同主成分（PCs）之间的帧混合。

通过 phenix 中的变异性优化进行模型构建

注意：只要指定了输入图谱和模型的完整路径，即可从任意目录执行 Phenix.varref。然而，为了便于组织管理，建议为每个 PC 在独立的子目录中进行精修。

  1. 将最终优化的共识模型文件复制到每个主成分（PC）对应的子目录中。
  2. 在每个子目录内，通过命令行运行 Phenix.varref，使用以下语法：
    phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
  3. 将 Resolution 设置为 4.0 Å，以匹配 3DVA 图谱的有效分辨率
  4. 将 nproc 设置为可用处理器数量（本例中为 20，可根据可用计算资源调整）
  5. 将 models_per_map 设置为 50 个模型（默认值）。
    注意：对于每张图谱，将生成 50 个模型，其约束条件根据 3DVA 数据的分辨率进行调整。系统将自动保留每张图谱中最优拟合的模型。最终输出文件包含对应于 20 张变异性图谱的 20 个优化模型。输出结果包括一个包含 20 个优化模型的 PDB 文件包，以及各个图谱文件。
  6. 在变异性优化过程中不要应用额外的图谱锐化处理。直接使用 CryoSPARC 生成的变异性图谱（在 4.0 Å 过滤）作为 phenix.varref 的输入。

7. 可视化

  1. 在 ChimeraX18 中打开 PDB 文件包，以同时加载全部 20 个优化后的模型。
  2. 使用“模型”面板选择性地显示单个帧或特定模型，以便进行比较和分析（图 4）。或者，每个优化后的模型也可在 ChimeraX 或 Chimera 中单独打开。

8. 分析前的数据准备

注意：运行上述语法将生成一个包含 20 个可变模型及各自独立图谱的 PDB 文件包。对于大多数分析，仅需两个模型——分别对应第 0 帧和第 19 帧——因为它们代表了沿所选主成分（PC）方向的两个极端构象状态。

  1. 在 ChimeraX 中打开 PDB 文件包，选择模型 1.1（第 0 帧）和模型 1.20（第 19 帧），并将每个模型另存为单独的 PDB 文件（图 4）。
  2. 编辑生成的 PDB 文件，以分离出感兴趣的残基。此步骤可手动完成，也可使用 Phenix.pdb.tools 实现。
  3. 比较两个修改后的 PDB 文件，识别主链或侧链的构象变化。
  4. 为比较两个 PDB 模型，可使用 Chimera 中的 MatchMaker 功能对修改后的结构进行叠加。
    注意：为获得可靠的比对结果，MatchMaker 通常需要至少 10–15 个重叠的残基。在本例中，仅分析了 6 个残基；然而，通过利用 ASNS 的同源二聚体特性实现了成功的叠加——尽管链 A 中仅保留了 6 个残基，但链 B 完整保留，可作为比对的参考结构。

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结果

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本节展示了由三维变异性分析（3DVA）和变异性优化流程生成的代表性结果，并提供了相应的解读指导。以人源天冬酰胺合成酶（ASNS）作为示例数据集，用于展示该方案所能实现的成功结果、常见伪影以及可进行的比较分析。由ASNS数据集生成的全套3DVA变异性图谱及相应的优化后模型均已存入Zenodo公共数据库。详细的访问信息见补充表1。

3DVA 变异性图谱与变异性动画。
3DVA 的主要输出结果是一组描述结构变异主要模式的变异性图谱1，以沿各个主成分（PC）排序的图谱序列形式呈现。针对 ASNS 数据集，分别对野生型（WT）和 R142I 变体数据集生成了对应于主成分 0（PC0）的图谱序列（补充视频 1 和 2）。这些动画直观展示了粒子群体中存在的结构域运动及协调性的结构重排。应将这些动画理解为对主要连续变异模式的表征，而非时间分辨的动态轨迹。

不同数据集之间（例如，野生型与突...

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讨论

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关键实验步骤与决策要点
本实验方案的有效实施依赖于流程中的若干关键步骤。用于最终冷冻电镜（cryo-EM）精修的颗粒堆栈（particle stack）和掩模（mask）的质量至关重要，因为三维变异性分析（3DVA）直接作用于这些输入数据，而非后处理后的密度图。主成分（PCs）数量的选择应反映数据集的大小和预期的复杂性；成分过少可能无法充分表征变异性，而过多则可能引入以噪声为主的模式。在3DVA和变异性精修中使用的分辨率参数应与数据的实际分辨率相匹配。下游分析中的选择，例如需要可视化或比较的帧，应根据感兴趣的结构特征进行判断。

故障排除与常见陷阱
多种问题可能会影响对变异性结果的解释。明显的运动可能源于密度较弱或分辨率不足，而非真实的构象变化。通过检查局部密度图质量并比较多个主成分（PC），有助于区分信号与噪声。粒子数量有限、优势取向或角度覆盖不均可能导致变异性模式定义不清。尽管可以使用标准的 Phenix 验证工具手动生成每个变异性密度图-模型对的验证统计量，但这些指标本身并不充分。仔细的...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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感谢高木（Takagi）、朱（Zhu）、沃斯（Vos）、查普塔尔（Chaptal）、阿尔卡罗（Alcaro）和理查兹（Richards）实验室的成员为本文所依据的出版物做出的贡献。作者衷心感谢印第安纳大学医学院电子显微镜设施以及美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所（NIH/NIGMS，项目编号S10 OD028723）对本研究工作的支持。额外经费由印第安纳大学医学院（Y.T.）提供，部分来自国家普通医学科学研究所（NIGMS，项目编号R01GM111695，授予Y.T.）和美国癌症协会（项目编号DBG-23-1038947-01-IBCD，授予Y.T.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CryoSPARC v4.4+Structura Biotechnologyhttps://cryosparc.com冷冻电镜数据处理软件
Phenix v1.24+Phenix Consortiumhttps://phenix-online.org变异性精修软件
UCSF Chimera生物计算、可视化与信息学资源中心，加州大学旧金山分校（UCSF）https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/分子可视化软件
UCSF ChimeraX生物计算、可视化与信息学资源中心，加州大学旧金山分校（UCSF）https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/分子可视化软件
CPPTRAJAMBER 分子动力学软件套件https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/用于 RMSF 计算的 Python 工具
Linux 工作站（内部组装的基于 GPU 的系统）
工作站机箱Supermicrohttps://www.supermicro.com工作站机箱：Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U 服务器超级机箱 
CPUIntel https://www.intel.comCPU：XEON E5-2690V3 ×2
主板Supermicrohttps://www.supermicro.com主板：Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 主板 X10DAI-O
内存Crucialhttps://www.crucial.com内存：Crucial 64GB 套件（16GB×4）DDR4 2133（PC4-2133）DR x4 ECC Registered，288 针服务器内存 CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 ×2
硬盘Western Digitalhttps://www.westerndigital.com硬盘：WD RE 4TB 企业级硬盘
RAID 控制器LSI Logichttps://www.broadcom.comRAID 控制器：LSI LOGIC MegaRAID SAS 9271-8i 套件
GPUNVIDIA https://www.nvidia.comQuadro M6000 显卡，配备 24 GB GDDR5 显存

参考文献

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