石蜡包埋小鼠胚胎组织中早期牙齿形态发生的空间转录组学

摘要

本方案描述了利用小鼠胚胎E13.5和E15.5时期颅面区域的福尔马林固定、石蜡包埋切片，通过空间转录组学技术分析差异基因表达谱的方法。

摘要

发育中的牙齿包含多种高度特化的细胞群体，这些细胞协同作用以维持牙齿的正常形态和功能。阐明这些细胞与其周围微环境之间的相互作用，对于理解牙齿正常发育背后的调控机制至关重要。这些过程中的异常可能导致先天性疾患，如牙齿缺失、牙本质发育不全以及釉质发育不全。尽管单细胞RNA测序（scRNA-seq）在揭示细胞异质性方面取得了显著进展，但它无法保留细胞在组织中的空间位置信息，从而限制了基因表达与组织结构之间的关联分析。空间转录组学技术通过将高分辨率的基因表达谱与天然组织结构的保留相结合，克服了这一局限，实现了分子特征的原位定位。in situ。本文中，我们描述了一种适用于后续空间转录组学应用的小鼠胚胎颅面组织的采集、固定及石蜡包埋的逐步操作方案。该流程详细说明了福尔马林固定、石蜡包埋组织的优化切片与处理方法，以保持RNA完整性及组织形态，满足高分辨率空间分析的要求。该方法适用于基于测序和成像的空间转录组学平台，可实现小鼠胚胎早期牙形态发生过程的可重复空间转录组分析。该策略为发育和病理状态下颅面结构的空间组织模式与功能动态提供了强有力的洞察，为连接分子机制与组织形态建立了关键的研究框架。

引言

牙齿发育依赖于早期胚胎生长过程中高度协调的形态发生序列^1,2,3,4。尽管通过遗传学和发育研究已鉴定出众多关键基因和信号通路，但我们对这些因子如何相互作用以塑造特定颅面结构的理解仍然有限。值得注意的是，尽管在将特定遗传变异与综合征性和非综合征性牙齿疾病关联方面已取得显著进展，但结构特异性形态发生的分子机制仍不完全明确^1,2,3,4。这一知识空白持续制约着针对牙齿缺失或其他牙齿异常的靶向治疗策略的发展。

单细胞mRNA测序（scRNA-seq）已实现了在健康和病变组织中发现先前未被识别的细胞类型，并可根据不同的基因表达谱鉴定出多种细胞亚型。然而，由于scRNA-seq需要将组织解离为单个细胞，导致每个细胞在组织中的原始空间位置信息丢失。因此，这些数据无法反映细胞相对于组织结构的排列方式^5,6,7。此外，细胞间相互作用的预测依赖于转录本互补性相互作用的存在，但并未考虑实际的空间信息，而空间信息对于判断此类相互作用是否在体内发生至关重要^5,6,7。

空间转录组学技术能够在保留组织切片内空间信息的同时，实现基因表达的高通量分析^8,9。空间转录组学技术可分为基于成像的^10,11,12和基于测序的^12,13两类。基于成像的空间转录组学方法利用FISH技术，在细胞或亚细胞水平上对目标基因表达进行检测和定量。相比之下，基于测序的技术以较低的空间分辨率捕获全转录组范围的基因表达。基于测序的空间转录组学可实现接近单细胞分辨率并覆盖整个转录组（约20,000个基因），支持无偏倚的探索性分析；而基于成像的空间转录组学则针对基因面板（最多约5,000个基因），能够精确开展特定信号通路和细胞间相互作用的假设驱动型分析¹⁴。

空间转录组学的技术进步现已能够实现对保存的组织结构内基因表达的分析。基于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和冷冻切片的方法为空间转录组学提供了互补的技术路径^15,16,17。FFPE 方法在组织结构保存方面具有显著优势，能够在结构复杂的组织（如发育中的牙齿和腭板）中实现基因表达的精确定位。在本研究及其他研究中，FFPE 固定与存档均获得了高度准确且可重复的空间转录组数据¹⁸。冷冻切片流程虽能较好地保持 RNA 完整性，但更易导致组织形变¹⁸。因此，本研究选用 FFPE 方法。 尽管单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）的成功主要依赖于高完整性的 RNA 保留，空间转录组学还要求高质量的组织形态，以将基因表达信号精确地定位到特定的组织学结构。

该方案最适合用于早期发育阶段的小鼠胚胎颅面组织的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，此阶段精细组织结构的保存对于空间转录组学分析至关重要。若样本过度固定、石蜡包埋方向不佳，或RNA完整性受损，则该方法的效果可能不理想，可能导致信号质量下降和空间分辨率丢失。方法成功应用的标志包括组织形态完整、切片形变最小，以及强健且具有空间分辨能力的转录组信号，并与组织学特征相一致。

方案

所有动物实验程序均经美国国立卫生研究院（NIH）下属的国立儿童健康与人类发展研究所动物护理与使用委员会（ACUC）根据动物研究方案 #21-031 批准。

1. 实验动物的准备与组织采集

1. 将健康的、具有生育能力的雄性和雌性 Mus musculus 进行定时交配。通过观察到阴道栓的存在来确认雌鼠怀孕，并将其定为胚胎发育第 (E) 0.5 天。
2. 通过吸入 CO₂ 并随后进行颈椎脱位的方法处死怀孕雌鼠。将动物仰卧位放置在无菌的吸水性手术台上，并沿预定切口部位用 70% 乙醇对腹部区域进行消毒。
3. 使用无菌手术剪在腹部正中线做切口，再用显微手术剪小心切开腹膜以暴露子宫角。用钝头镊子轻柔地将子宫链外置。沿子宫肌层松解组织，并在输卵管及子宫中线附着处切断，以分离胚胎。
4. 立即将完整胚胎转移至盛有冰上预冷的无菌 1× PBS 的 10 cm 培养皿中。
5. 小心地将每个胚胎从周围的子宫组织、羊膜和绒毛膜中分离出来，并将其转移至另一含有冰上预冷的无菌 1× PBS 的新鲜 10 cm 培养皿中。
6. 在所需发育阶段使用无菌手术刀解剖胚胎头部，并在进一步处理前用冰上预冷的 1× PBS 冲洗一次。

2. 组织的固定与处理

1. 在所需发育阶段解剖小鼠胚胎头部，并在室温下于10%中性缓冲福尔马林中固定过夜，同时置于摇床上。
2. 固定完成后，移除福尔马林，用1×PBS冲洗样本，随后转移至70%乙醇中保存。使用自动组织处理仪进行组织脱水、透明和石蜡浸润。
3. 将胚胎头部以冠状面或矢状面方向包埋于石蜡中。
4. 石蜡凝固后，从模具中取出石蜡块，放入带标签的密封容器或自封袋中，于4 °C保存直至切片。
   注意：FFPE组织块可在不损害组织完整性的前提下储存数年再进行切片。

3. 用于空间转录组学的FFPE组织处理

1. 使用70%乙醇对工作台面和器械进行消毒，随后用RNase去污染溶液处理，以最大限度减少RNA降解。
2. 准备含有去离子水的水浴锅，并将其温度维持在40 °C，根据胚胎发育阶段或组织特性需要，将温度调节在40 °C至43 °C之间。
3. 设置切片机，先用RNase去污染溶液轻轻擦拭后安装新刀片，固定刀片，并将 Clearance 角度设为10°。
   注意：必须使用新刀片进行切片，以获得精确的组织切片。改变切片机刀片角度会显著影响切片质量，进而影响组织完整性、厚度均匀性以及形态学特征的保存。
4. 修除包埋组织周围的多余石蜡，将FFPE组织块安装到切片机的冷台上。
5. 在使用前，将洁净的镊子和刷子用RNase去污染溶液进行准备和处理。
6. 将石蜡包埋块切面与切片机刀片对齐，进行约12 µm的修片切割，直至接近目标区域（例如，在冠状切面上可见磨牙内侧部分）。根据需要调整组织块和刀片的位置，以确保获得对称且方向正确的全头冠状切片。
7. 若需对组织切片进行RNA提取，可直接将10 µm切片收集至1 mL微量离心管中，并按照制造商推荐方法^19,20进行DV200质量评估。
8. 连续切取5 µm厚度的连续切片，并通过在普通载玻片上镜检测试切片，持续监测是否接近目标区域。
9. 一旦接近目标区域，使用11号手术刀片在组织区域两个适当间隔的位置轻轻划痕，但不要完全切透，以防止切片卷曲或粘连。切片完成后，用细刷的刷毛去除附着的石蜡。
10. 将组织切片漂浮于41 °C的水浴中，使其温和舒展并展平，然后再转移至载玻片上。

基于测序的空间转录组学

1. 将组织切片转移至推荐的玻片上，确保所有目标区域均位于6.5 × 6.5 mm范围内。若在同一张玻片上放置多个相邻切片，需将玻片短暂置于40 °C切片加热台上，以促进切片黏附并防止先前放置的切片脱落。待所有切片定位完成后，将玻片置于加盖的切片加热台中，在60 °C下孵育2 h，以增强组织黏附性。
   注意：超出6.5 × 6.5 mm区域的部分未进行处理。
2. 孵育结束后，进行苏木精-伊红（H&E）染色&E) 染色使用标准 H&E 染色方案，使用去离子水替代自来水，以保持 RNA 完整性。
3. 使用80%甘油封片，获取高分辨率H&E 图像，提供更高质量的参考图像以替代典型的 H&E 由切片成像与组织转移系统生成的图像。
4. 成像后，将载玻片分别浸入盛有去离子水的50 mL离心管中以去除盖玻片，并对载玻片进行处理，准备送至核心实验室进行后续操作。

5. 基于图像的空间转录组学

注意：载玻片由制造商提供²⁰，每张载玻片包含一个指定的可成像区域（带轮廓线），尺寸为 12 mm × 24 mm，可用的样品放置区域约为 235 mm²（10.45 mm × 22.45 mm）。

1. 将组织切片完全置于该指定区域内，确保切片（包括残留的石蜡）不发生重叠。当放置多个相邻切片时，需将载玻片短暂置于40 °C的切片加热台上加热，以促进粘附并防止先前固定的切片脱落。
2. 所有组织切片定位完成后，将载玻片放入加盖的切片加热台中，在40 °C下孵育过夜，以确保切片充分粘附。
3. 孵育结束后，按照制造商¹⁹提供的方案处理载玻片，并将其加载至仪器中进行RNA测序，同时需核对最新版本的方案，因为操作细节可能定期更新。
   注意：实验过程中产生的所有危险物质（如甲醛、乙醇和RNase去污染溶液）应根据机构安全政策和当地法规，使用适当的化学废液容器、生物危害废弃物处理方法以及通风橱操作规范进行处置。

结果

本方法概述了如何处理新鲜解剖的小鼠胚胎头部，以制备可用于切片的颅面组织石蜡包埋（FFPE）样本，包括发育中的牙齿组织，这些样本可轻松进行切片，同时保持RNA的完整性（图1）。该方案已成功应用于E13.5（胚胎第13.5天）、E15.5和E16.5小鼠胚胎头部，用于高分辨率成像（图2）和基于测序的空间转录组学分析（图3）中的颅面区域研究。在基于测序的空间转录组数据集中，通过分析空间聚类之间的差异表达、检测在特定聚类中富集的转录本以及考察具有空间限制性表达模式的基因，来鉴定标志基因。这种联合方法可实现将基因可靠地分配至不同的细胞类型和空间区域。候选标志基因的验证有助于确认从转录组分析中鉴定出的基因在完整组织中具有特异性、稳健性和生物学意义。

基于测序和基于成像的空间转录组学技术通过检测RNA分子促进这一过程 原位 在保持空间背景的前提下实现单细胞分辨率。在选定标记物后，需评估其表达情况，以确...

讨论

本研究提供了一种详细的实验方案，用于制备适用于高分辨率空间RNA成像平台（包括基于测序和成像的空间转录组学技术）的小鼠胚胎头部福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块。该方案的关键目标是在整个头部切片中同时保持组织形态和核酸完整性，尤其关注发育中的颅面区域。在复杂的多组织环境中（如发育中的腭部和牙齿结构），确保这种程度的保存对于准确解析空间基因表达模式至关重要。

近期研究表明，空间转录组学在解析颅面发育过程中的细胞异质性及谱系特化方面具有重要意义。例如，单细胞RNA测序与空间转录组学的整合已实现了牙齿发育全过程转录图谱的构建^14,15。这些整合数据集界定了人类胚胎牙齿中不同的上皮和间充质细胞群体，揭示了谱系承诺的分子调控机制，并为研究早期牙发生提供了基础性参考图谱。类似地，利用空间RNA测序方法对腭部间充质进行分析，揭示了硬腭成骨细胞分化过程中动态变化的转录程序，包括晚期成骨标志物的空间限制性激活¹⁶。这些发现表明，空间...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	赛默飞世尔科技	10010023	使用  在实验流程中进行洗涤步骤
50 mL 圆底离心管（Ambion），无RNA酶	赛默飞世尔科技	AM12502	用于在不同溶液中储存样品
高级轨道摇床	VWR	6683-470	用于在孵育期间振荡组织以混合固定液
70% 酒精，Fisherbrand，HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	用于清洁和消毒所有工作区域
全自动真空组织处理仪	Leica Biosystems	ASP300S	用于样品的透明、脱水、复水和石蜡浸入
盖玻片厚度1.5，25 mm × 25 mm	康宁	2850-25	用于 Visium HD 工作流程中载玻片的封片
Dako 蓝化缓冲液，即用型	安捷伦科技	CS70230-2	用于 H&E 染色
伊红-Y 与赤藓红	Fisher Scientific	22050198	用于 H&E 染色
苏木精，Mayer氏，即用型水溶液	安捷伦科技	S330930-2	用于 H&E 染色
HistoCore 水浴锅	Leica Biosystems	HIS2326	用于在40–43℃下漂浮切片 °C 以去除 FFPE 切片中的皱褶
Loupe 浏览器  9.0.0	10X Genomics, Inc.		用于分析 Visium HD 数据
低剖面一次性刀片 DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	用于切片FFPE组织块
10% 中性缓冲福尔马林	Azer Scientific	NBF-4-G	用于固定组织
RNaseZap RNase 去污染溶液	赛默飞世尔科技	AM9782	用于清洁和去除RNase
半自动旋转切片机	Leica Biosystems	RM2245	按照指南中所述方法对FFPE组织块进行切片。
带盖玻片加热板	首映	XH2004	用于在不同温度下孵育载玻片
Superfrost Plus 载玻片	Fisher Scientific	12-550-15	用于连接 Vsium HD 的切片
11号手术刀片	Integra Miltex	4-311	用于FFPE组织的评分
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	用于组织浸润和包埋
组织培养皿 100X20毫米 500/箱	Fisher Scientific	877222	用于在1x PBS中收集和解剖样本
UltraPure 甘油	赛默飞世尔科技	15514011	用于 Visium HD 载片在 CytAssist 前的盖玻片安装
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	用于 Visium HD 工作流程实验
Visium HD 空间RNA测序	10X Genomics, Inc.	1000676	用于开展空间转录组学实验
Xenium 5K 原位 RNA 定位	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	用于开展空间转录组学实验
Xenium Analyzer	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	使用Xenium和Xenium 5K进行RNA成像
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		用于分析 Xenium 数据
Xenium 原位 RNA 定位	10X Genomics, Inc.	1000672	用于开展空间转录组学实验