体外比较评估3D打印聚乳酸与聚对苯二甲酸乙二醇酯-乙二醇改性表面的金黄色葡萄球菌生物膜形成

摘要

本研究采用静态、半静态和动态方法评估聚乳酸（PLA）和聚对苯二甲酸乙二醇酯改性塑料（PETG）3D打印材料上的生物膜形成情况 体外 模型。该方法有助于更安全的医疗器械开发，并推动3D打印生物材料中的生物膜研究。

摘要

三维（3D）打印技术加速了定制化医疗器械的发展，但打印材料表面的生物膜形成仍是影响植入物安全性和性能的主要威胁。由于材料化学性质以及与打印工艺相关的表面特征可能影响细菌附着和对抗生素的耐受性，因此亟需建立标准化的体外（in vitro）评估方法，以实现对常用3D打印聚合物之间进行有意义的比较。本文采用一种多模型体外（in vitro）评估框架，从生物膜生物学的多个互补方面——包括早期黏附、成熟过程以及对抗微生物药物的耐受性——在静态和流动条件下，比较聚乳酸（PLA）与聚对苯二甲酸乙二醇酯改性材料（PETG）上的生物膜形成情况。S. aureus生物膜的建立与评估采用了定量（活菌载量和最小生物膜清除浓度[MBEC]）和定性（扫描电子显微镜）终点指标。在多种模型中，PLA和PETG均支持生物膜形成；然而，PLA通常表现出更高的早期黏附能力和更密集的生物膜结构。在静态实验中，PLA上的菌落形成单位（CFU）数值高于PETG，而万古霉素的MBEC值在两种材料之间相似。不同实验平台间观察到MBEC存在依赖于检测方法的差异，凸显了模型结构对表观抗微生物敏感性的影响。在动态流动条件下，相较于静态环境，生物膜负荷增加，但材料间的差异较小。综上所述，这些结果表明这两种聚合物均易受生物膜形成的影响，并证明了采用多模型框架评估与材料相关的生物膜行为，以及对3D打印医疗器械相关基材的抗微生物性能进行基准测试的重要价值。

引言

3D 打印技术的最新进展推动了3D打印医疗器械的广泛应用，这得益于其成本效益高、精度高、结构设计复杂、材料利用率高以及可进行患者特异性设计等优势^1,2。这些技术进步正在显著促进个性化骨科^3,4,5,6、颅颌面^7,8、牙科^1,9以及脊柱^10,11植入物的临床发展。

目前已有多种技术和材料可实现对设计参数的精确控制，从而优化表面特性并增强整体设备功能^2,12,13。植入物的表面至关重要，因其是与宿主环境相互作用的主要界面，会影响免疫反应、细菌黏附以及组织整合——这些因素对设备的长期性能至关重要^14,15。然而，这一界面同时也带来重大挑战，因为与可植入医疗器械相关的感染可能导致严重并发症，且由于病原体能够形成附着于表面的生物膜，此类感染通常难以治疗^16,17,18,19。

在此背景下， 体外 对用于制造植入式医疗器械的材料进行生物膜模型测试，是风险评估和产品开发过程中的基本步骤²⁰这些检测方法可用于研究材料对微生物黏附、生物膜形成及成熟过程的易感性，同时可评估旨在抑制微生物生长的抗菌策略或表面改性措施的有效性。

许多方法的另一个局限性 体外 生物膜检测的一个常见问题是，这些实验通常在单一的标准化基质上进行（通常为一种聚合物或通用的实验室材料），这隐含地假设了实验结果可适用于不同器械材料²¹这对于3D打印的医疗器械而言是一个问题，因为聚合物化学性质及依赖制造工艺的表面特征可能差异显著，并可直接影响细菌黏附、生物膜成熟以及对抗菌剂的耐受性²²因此，针对实际制造中所用聚合物材料评估生物膜行为，而非从单一参比基底外推，可弥补当前测试实践中的一个重要空白。

由于植入物表面是与宿主相互作用的关键界面，因此会显著影响细菌黏附和生物膜的形成，而这些过程正是许多器械相关感染及治疗失败的基础。我们假设，常用的3D打印聚合物在支持S. aureus生物膜形成的能力以及对万古霉素介导的生物膜清除的敏感性方面存在差异。因此，我们对3D打印材料模型上的生物膜形成进行了定性和定量评估。在本研究中，对3D打印材料模型上的生物膜形成进行了定性和定量评价。

方案

所有危险化学品（如戊二醛、二甲胂酸钠缓冲液、六甲基二硅氮烷 [HMDS] 和乙醇）均按照机构的环境健康与安全（EHS）政策进行操作。挥发性或有毒试剂的配制和使用均在经过认证的化学通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和耐化学腐蚀手套）；易燃溶剂远离点火源存放。化学废弃物分类后收集于正确标识的容器中（包括含砷废物专用容器用于二甲胂酸钠，以及溶剂废物容器用于 HMDS/乙醇），并通过机构的危险废物处理程序进行处置。生物危害材料（细菌培养物、污染的培养皿及一次性用品）在丢弃前根据生物安全规程（如高压灭菌或使用经批准的消毒剂）进行去污处理；任何环氧乙烷灭菌操作均依照认证设施的操作规程和必要的通风程序进行。

3D 打印模型
模型使用免费的计算机辅助设计软件进行设计，并采用配备熔融沉积成型技术的3D打印机打印，使用直径为1.75 mm的聚乳酸（PLA）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PETG）耗材（材料表）。制备样品所用的打印参数如下：喷嘴（0.4 mm）移动速度为1800 mm/min；首层打印速度为300 mm/min；喷嘴挤出温度为220 °C（PLA）和255 °C（PETG）；热床温度为60 °C；层高为0.08 mm；挤出宽度为0.48 mm；所有样品的填充密度均为100%。所有样品均无需使用支撑结构。3D模型包括圆盘、平底板、卡尔加里生物膜装置（CBD）以及改良罗宾斯装置（MRD）。圆盘设计为直径6 mm、高6 mm的圆柱体。

对于CBD，创建了一个模型（材料表）。CBD由两部分组成：一个底板，即标准的96孔微孔板（ANSI/SLAS格式），以及一个盖子（针板）：一个带有96个圆柱形针的聚合物（PLA或PETG）盖子，针的直径为2 mm，高度为5 mm。MRD采用螺纹模型固定直径和高度均为4 mm的针而制成（材料表）。打印过程完成后，将模型从构建板上小心取下，目视检查是否有任何变形，随后使用环氧乙烷进行灭菌。

静态生物膜的圆盘模型
本方法采用先前描述的6 mm × 6 mm圆柱形圆盘在聚乳酸（PLA）上诱导形成生物膜²³（图1）。

图1PLA和PETG圆片及用于这些圆片上生物膜形成的24孔板。 (A) 细菌接种及生物膜形成前的代表性3D打印PLA和PETG圆盘。B) 在生物膜诱导过程中，置于24孔板中的PLA和PETG圆片 体外 培养条件。缩写：PLA = 聚乳酸；PETG = 乙二醇改性聚对苯二甲酸乙二醇酯。 请点击此处以查看此图的放大版本。

S. aureus 在添加了15%甘油的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中于−80 °C保存；每次实验前，在血琼脂平板上培养，并于37 °C孵育24小时。挑取单个菌落，重悬于含50 mM葡萄糖的10 mL TSB中，转移至50 mL锥形管，在37 °C、120 rpm的摇床中孵育24小时。将所得菌液在200 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。菌体沉淀用10 mL无菌0.9% NaCl洗涤三次。最后一次洗涤时，将沉淀重悬于10 mL新鲜TSB中，获得浊度相当于0.5麦氏标准（约1.5 × 10⁸ CFU/mL）的细菌悬液，该浊度通过比浊法测定。随后，将该悬液在15 mL锥形管中用10 mL TSB按1:10稀释，以获得终浓度为10⁷ CFU/mL的细菌悬液。进行圆片实验时，将2 mL上述细菌悬液加入无菌24孔板的每孔中，覆盖各组圆片（PLA和PETG），孵育2小时以促进细胞黏附。然后用无菌镊子将圆片无菌转移至另一含2 mL 0.9% NaCl的无菌24孔板中，以去除浮游菌。每孔加入新鲜TSB 10 mL，并于37 °C孵育24小时。在此期间，黏附于圆片表面的细菌形成生物膜。孵育结束后，吸除培养基，用2 mL 0.9% NaCl洗涤圆片，以去除残留培养基及非黏附菌。另取一24孔板，每孔加入1 mL万古霉素溶液（梯度稀释至2–4,096 mg/L），并将圆片浸入其中，孵育24小时。同时设置不含万古霉素的对照组（0.9% NaCl）。24小时后，用2 mL 0.9% NaCl洗涤圆片。

为了定量圆盘上黏附的细菌，使用无菌镊子将每个圆盘转移至含有1 mL无菌0.9% NaCl的微量离心管中，并在超声波清洗仪中于40 kHz、37 °C条件下超声处理15分钟，以解离黏附的细胞。将微量离心管涡旋振荡60秒，以确保细胞团完全分散。取未稀释样品（10⁰）、以及用无菌0.9% NaCl稀释10⁻²和10⁻⁴的样品各100 µL，接种于TSA培养基平板上，在37 °C下培养24小时。通过计数平板上的菌落形成单位（CFU）来定量细菌生长，并以CFU/mL表示结果。

用于测定最低生物膜清除浓度的24孔平底板
在24孔板实验中，每孔加入3 mL细菌悬液（按上述方法制备），孵育2小时以确保细胞充分黏附。随后吸除细菌悬液，每孔加入3 mL无菌0.9% NaCl溶液以去除浮游细胞。接着每孔加入3 mL新鲜TSB培养基，将板置于37 °C孵育24小时。在此期间，黏附于孔壁的细胞形成生物膜。孵育结束后，吸除TSB培养基，每孔用3 mL 0.9% NaCl溶液洗涤，以去除残留培养基及未黏附细胞。随后每孔加入3 mL系列稀释的万古霉素溶液（2–4,096 mg/L）。同时设置不含万古霉素的对照组（0.9% NaCl）。

24小时后，弃去溶液，每孔用3 mL 0.9% NaCl轻轻洗涤两次。每孔加入3 mL 0.9% NaCl，用封口膜密封培养板，然后在超声水浴中于40 kHz和37 °C条件下超声处理15分钟，以解离附着的生物膜。从各孔中取100 µL样品，将未稀释样品（10⁰）以及用无菌0.9% NaCl制备的10⁻²和10⁻⁴稀释液接种于TSA培养基上，于37 °C培养24小时。通过计数CFU/mL来定量细菌生长情况。所有实验均设三个重复。最小生物膜清除浓度（MBEC）定义为与对照组相比，细菌数量减少至少3个log₁₀（图2）。

图2：已打印的24孔板。 (A) 使用 PLA 打印的 24 孔板。B) 24孔板，采用PETG打印。缩写：PLA = 聚乳酸；PETG = 聚对苯二甲酸乙二醇酯 请点击此处以查看此图的放大版本。

卡尔加里生物膜装置
CBD 由一个 96 孔微孔板和一个带有 96 个插针的盖子组成，每个插针设计为当盖子放置在板上时可精确插入一个孔中。为诱导生物膜形成，将 200 µL 细菌悬浮液加入无菌 96 孔板的每个孔中，然后将无菌插针盖子放置在板上。组装好的板在 37 °C 静置条件下孵育 24 小时，以使生物膜在插针上形成。孵育后，将带插针的盖子轻轻浸入另一个含有 200 µL 0.9% NaCl 的 96 孔板中，以去除浮游细胞。随后将带有插针的板浸入另一个含有逐步浓度（2–4,096 mg/L）万古霉素的 96 孔板中，并在 37 °C 静置条件下孵育 24 小时。

将带有插针的平板浸入含有200 µL 0.9% NaCl的96孔板中进行冲洗，然后小心地将插针压印到一个15 cm的TSA平板上，在37 °C下培养24小时。观察细菌生长情况，MBEC定义为未出现细菌生长的最低浓度。所有实验均重复三次（图3）。

图3：使用 PLA 和 PETG 打印的卡尔加里装置和 96 孔平底板。 (A) 使用 PLA 打印的卡尔加里装置。 (B) 使用 PLA 打印的 96 孔平底板。C使用PETG打印的卡尔加里装置。 (D) 用PETG打印的96孔平底板。缩写：PLA = 聚乳酸；PETG = 聚对苯二甲酸乙二醇酯 请点击此处查看此图的放大版本。

在持续流动条件下的动态系统
每个 MRD 包含五个固定在螺纹模型上的独立小柱，沿具有矩形横截面的通道线性排列。该动态系统由一个含有 1 L 待测抗生素溶液的烧瓶组成，通过连接至 MRD 的硅胶管与蠕动泵相连。组装过程在层流空气净化台内进行，以防止污染。培养基流速保持在 1 mL/min，并在整个系统中循环 24 小时。流经 MRD 的液体被排入另一个玻璃烧瓶中（不进行再循环）。

S. aureus 在MRD的 peg 上诱导形成生物膜，将 peg 浸入含3 mL TSB的24孔板中，菌液浓度为10⁷ CFU/mL。用含3 mL 0.9% NaCl溶液的24孔板轻轻浸洗peg。将peg小心旋入MRD中（n = 5）。通过泵将稀释于0.9% NaCl中的万古霉素溶液（40 mg/L）经MRD灌注24小时，灌注条件同上文所述。设不含抗生素的对照组（0.9% NaCl）。该浓度的选择依据为既往报道的静脉给予高剂量万古霉素后所达到的血清浓度。²⁴将针体用无菌镊子从MRD中无菌取出，经0.9% NaCl洗涤后置于含1 mL无菌0.9% NaCl的微量离心管中，在40 kHz、37 °C条件下于超声水浴中震荡15 min，以确保生物膜完全脱离。将微量离心管涡旋振荡60 s，并重复该步骤三次，以破坏残留的生物膜聚集体。取100 µL菌悬液接种于TSA平板，于37 °C培养24 h。细菌生长量定量后以CFU/mL表示图4).

图4： 采用PETG和PLA制作的改良型Robbins装置及动态系统照片。 （A）使用PETG或PLA打印的改良型Robbins装置。（B）动态系统的照片。缩略语：PLA = 聚乳酸；PETG = 聚对苯二甲酸乙二醇酯-共-环己烷二甲醇酯。 请点击此处查看该图的高清版本。

扫描电子显微镜
为观察生物膜的形态与结构，对圆片进行了扫描电子显微镜（SEM）检测。生物膜的诱导培养按照前述实验方案进行。使用无菌镊子小心取出圆片，加入固定液（0.68 g 蔗糖、0.42 g 咪唑二乙酸钠、0.6 mL 30% 戊二醛，加去离子水至19.4 mL）固定45分钟。随后将样品转移至缓冲液（0.68 g 蔗糖和0.42 g 咪唑二乙酸钠溶于水）中浸泡10分钟。接着，样品依次经35%、50%、70%和100%梯度乙醇溶液脱水处理，每次10分钟。之后，将样品转移至另一培养皿中，加入100%六甲基二硅氮烷覆盖10分钟。最后，使用旋转泵对圆片进行喷金镀膜，并固定于金属载台，置于扫描电子显微镜下以不同放大倍数进行观察（图5）。

图5：经或未经生物膜诱导的PLA与PETG 3D打印模型的扫描电子显微镜分析。（A）未形成生物膜的PLA扫描电子显微镜图像。（B）未形成生物膜的PETG扫描电子显微镜图像。（C）在PLA圆片上形成生物膜的细菌的扫描电子显微镜图像。（D）在PETG圆片上形成生物膜的细菌的扫描电子显微镜图像。C和D显示了生物膜的典型特征：细菌组织成三维结构、附着于表面，以及存在胞外基质。白色标尺代表10 µm。缩写：PLA = polylactic acid；PETG = Polyethylene Terephthalate Glycol。请点击此处查看该图的放大版本。

统计学分析
部分分析为描述性分析。对于定量数据，由于样本量较小，采用中位数与四分位间距进行描述，并使用Mann-Whitney检验进行统计学比较。以p值< 0.05为差异具有统计学意义。

结果

静态生物膜的圆盘模型
本实验用于测定单个样本的生物膜清除浓度（MBEC）。万古霉素的连续两倍稀释结果显示，聚乳酸（PLA）的基线生物膜形成量为 7.48 × 10⁵ CFU/mL [IQR 6.34–8.72]，聚对苯二甲酸乙二醇酯-共-环己烷二甲醇酯（PETG）为 3.60 × 10⁵ CFU/mL [IQR 3.08–5.52]。尽管两种材料的生物膜密度均处于 10⁵ 数量级，但二者之间的生物膜生成量差异具有统计学意义（p = 0.015）。在暴露于万古霉素时，两种材料的MBEC均为 512 mg/L（图6）。

讨论

本研究提出了一项全面的 i体外 评估使用四种互补实验平台在3D打印医用级聚合物（特别是PLA和PETG）上生物膜形成的性能：静态圆盘实验、24孔板模型、CBD以及基于MRD的动态流动系统。通过整合这些模型，本研究旨在表征不同打印材料在暴露于特定条件时的行为特征 S. aureus 生物膜诱导，以及测定万古霉素在不同测试条件下的最低生物膜清除浓度（MBEC）。这种多参数方法可比较不同材料对微生物黏附性和抗菌耐受性的影响——这些是决定3D打印医疗器械性能与安全性的关键因素^2,16,17,23.

由于植入物感染主要与生物膜相关，且 notoriously 难以根除^25,26...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% NaCl	Fresenius Kabi Brasil, Ceara, 巴西	17811
采用熔融沉积成型技术的3D打印机（Bambu X1-Carbon）	Bambu Lab, 深圳, 中国	PF001-P
血琼脂	NewProv, Paraná, 巴西	PA31
可下载的卡尔加里生物膜装置	无公司	见链接（无目录编号）	https://www.printables.com/model/1464751-calgary-model-biofilm
细胞培养多孔板，24孔	Greiner Bio-One, Kremsmünster Österreich, 奥地利	662160
离心机（5910 Ri）	Eppendorf, 汉堡, 德国	5943000511
无菌离心管，15 mL	Corning, 密苏里, 美国	430790
无菌离心管，50 mL	Corning, 密苏里, 美国	430291
电子移液器控制器（Easypet® 3）	Eppendorf, 汉堡, 德国	4430000018
乙醇（≥99.5%，ACS级试剂）	Sigma-Aldrich, 密苏里, 美国	459844
戊二醛	Merck, 达姆施塔特, 德国	8143931000
六甲基二硅氮烷	Merck, 达姆施塔特, 德国	440191
培养箱（502/4-C）	Fanem, São Paulo, 巴西	502007700
层流洁净工作台（BioSEG 9）	Veco, São Paulo, 巴西	1EAC3770
机械移液器（Eppendorf Reference® 2）	Eppendorf, 汉堡, 德国	4924000061
可下载的改良罗宾斯装置	无公司	见链接（无目录编号）	https://www.printables.com/model/1481700-robbins-device-modified
浊度计	Alfakit, Florianópolis, 巴西	7718
轨道摇床（INNOVA 44R）	Eppendorf, 汉堡, 德国	M1282-0314
Parafilm M	Amcor, 伊利诺伊, 美国	PM-996
蠕动泵（Minipuls® 3）	Gilson, Villiers-le-Bel, 法国	F117604
培养皿（90 x 15 mm）	Greiner Bio-One, São Paulo, 巴西	630164
移液器吸头，1–200μL	Corning, 密苏里, 美国	CLS4142
聚对苯二甲酸乙二醇酯-共-环己烷二甲醇酯（PETG）	Creality, 中国	44759
聚乳酸（PLA）Ultrafuse® PLA PRO1	BASF, Maarssen, 荷兰	PR1-7501A075
旋转泵（Q150R ES Plus）	Quorum Technologies, Lewes, 英国	13034
扫描电子显微镜（Vega3 LMU）	Tescan, Brno, 捷克共和国	见链接（无目录编号）	https://tescan.com/product-portfolio
血清移液管，10 mL	Corning, 密苏里, 美国	CLS4488
二甲胂酸钠	Sigma-Aldrich, 密苏里, 美国	C0250
金黄色葡萄球菌ATCC® 25923菌株	Laborclin, Pinhais, 巴西	660674
蔗糖	Sigma-Aldrich, 密苏里, 美国	59378
可下载的24孔平底板	无公司	见链接（无目录编号）	www.printables.com/model/104339-24-well-plates
胰蛋白酶大豆琼脂	Kasvi, 马德里, 西班牙	K25-1068
胰蛋白酶大豆肉汤	Sigma-Aldrich, 密苏里, 美国	22092
超低温冰箱（IULT 335 D）	Indrel, Paraná, 巴西	12038
超声波清洗机（Soniclean 15）	Sanders Medical, 米纳斯吉拉斯, 巴西	见链接（无目录编号）	https://sandersdobrasil.com.br/produto/lavadora-ultrassonica-soniclean-15d/
万古霉素	ABL, São Paulo, 巴西	15,56,20,041
涡旋振荡器（FLEXVORTEX）	Loccus, São Paulo, 巴西	4500