电针诱导的产后压力性尿失禁中运动蛋白通路的变化

摘要

电针治疗改善了产后压力性尿失禁大鼠模型的尿动力学参数，并与运动蛋白相关通路的调节有关。这些发现提示了其治疗作用潜在的分子机制。

摘要

产后压力性尿失禁（SUI）显著影响女性的生活质量，但有效治疗手段的潜在分子机制尚不明确。本研究旨在探讨电针（EA）在SUI大鼠模型中的治疗效果及其分子通路。我们采用阴道球囊扩张（VBD）法建立SUI模型，并将受试动物随机分为模型组和电针治疗组。通过尿动力学检测评估功能恢复情况，结果显示电针显著提高了漏尿点压力（LPP）和最大膀胱容量（MBC）。采用苏木精-伊红染色和Masson三色染色进行组织病理学分析，发现肌肉结构得到改善，胶原沉积减少42.3%，同时炎症反应受到抑制。定量蛋白质组学共鉴定出2,907个差异表达蛋白（DEPs），STRING数据库分析显示运动蛋白通路是核心靶点。具体而言，电针选择性下调了MYL1、TNNI2、MYLPF、TNNT3和TNNT1等关键蛋白的表达。Western blot和qPCR验证了上述结果，提示电针通过调节肌肉收缩力及重塑盆底结构缓解SUI，为靶向治疗SUI的潜在机制提供了新的见解。

引言

压力性尿失禁（SUI）是一种常见的盆底功能障碍，影响着15%至35%的产后女性^1,2，显著影响其生活质量与心理健康。除了躯体症状外，产后SUI还带来沉重的心理社会负担；许多女性会感到尴尬、自尊心下降以及回避社交活动。这种状况可能削弱女性的性别认同感，并导致不愿参与各类日常活动，从而加重孤独感，甚至诱发产后抑郁³。此外，由于需要购买控尿产品及频繁就医，SUI也带来了经济负担。尽管目前已有盆底肌训练和手术治疗等干预手段，但其疗效有限且存在复发风险，因此亟需开发更有效、创伤更小、能够针对产后SUI根本病因的治疗方法^4,5。SUI的发病机制是多因素的，涉及盆底肌肉功能障碍、结缔组织退化以及神经肌肉损伤。阴道分娩过程中的机械性损伤是导致产后SUI的主要原因^6,7。此外，细胞外基质重塑失调——表现为胶原纤维减少和弹性蛋白代谢异常——会削弱盆底支持结构⁸。新兴证据表明，横纹尿道括约肌收缩功能受损是一个关键因素，其背后机制与肌源性特异性蛋白（包括调控肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的运动蛋白）表达异常密切相关⁹。

电针（EA）是一种现代改良技术，将传统针灸与电刺激相结合，通过调节神经回路和促进组织修复过程来增强治疗效果^10,11,12,13。EA 在疼痛管理、神经退行性疾病以及泌尿系统疾病（包括膀胱过度活动症和慢性前列腺炎）的治疗中已显示出良好疗效。其作用机制主要通过两个方面介导：（1）神经调节，涉及体感神经和中枢镇痛通路的激活¹⁴；（2）组织层面的调控，促进血管生成、减轻炎症反应，并恢复细胞外基质稳态^15,16,17。值得注意的是，已有研究显示电针可改善压力性尿失禁（SUI）患者的盆底肌功能，表现为尿道闭合压升高和肌电活动增强。然而，电针对 SUI 治疗作用背后的分子通路——特别是其在调控与肌肉收缩力相关蛋白方面的作用——目前仍缺乏充分认识。

在尿液储存过程中，尿道括约肌的持续收缩依赖于运动蛋白及其调节亚基的精确调控，这些蛋白协调骨骼肌中的肌动蛋白-肌球蛋白相互作用^18,19,20。在静息状态下，抑制性亚基如肌钙蛋白I2（TNNI2）——一种快缩骨骼肌特异性的同工型——与肌动蛋白丝结合，稳定肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物，阻断肌球蛋白结合位点，从而维持肌肉松弛状态^21,22。同时，在低钙条件下，调节肌球蛋白ATP酶活性的肌球蛋白轻链1（MYL1）保持非磷酸化状态，限制了横桥循环的效率²³。当身体应激时神经激活引发钙离子内流，导致肌钙蛋白复合物发生构象改变：钙离子与肌钙蛋白C（TNNC）结合，使TNNI2从肌动蛋白上解离，原肌球蛋白回缩，暴露出肌球蛋白结合位点。与此同时，钙/钙调蛋白依赖性肌球蛋白轻链激酶（mLCK）对MYL1进行磷酸化，增强肌球蛋白ATP酶活性，促进强力的肌动蛋白-肌球蛋白横桥形成。结构亚基如肌钙蛋白T1（TNNT1）确保肌钙蛋白复合物在肌动蛋白上的正确排列，从而实现对钙信号的同步响应^24,25。在压力性尿失禁（SUI）中，抑制性亚基（如TNNI2）的病理性过表达延长了肌动蛋白-肌球蛋白的阻断状态，而MYL1和TNNT1的失调则破坏肌球蛋白组装及钙敏感性，共同损害括约肌的收缩能力^5,26。这些分子异常与SUI的组织学特征相关，包括肌纤维排列紊乱和尿道阻力降低。因此，恢复TNNI2、MYL1和TNNT1的生理表达成为治疗的关键目标，因其可重新校准收缩-舒张平衡，增强括约肌在应激事件中产生闭合压力的适应能力。

方案

所有实验程序均经广州美莱生物科技有限公司动物伦理委员会批准，批准编号为 IACUC-MIS2023045。

建立压力性尿失禁大鼠模型
共使用20只6–8周龄的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，用于建立模拟分娩过程的盆底损伤模型。为实施阴道球囊扩张（VBD），通过腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对大鼠进行麻醉。将一个未充气的10 Fr Foley导尿管小心插入阴道中段，随后用3 mL无菌生理盐水充盈球囊。球囊保持充盈状态4小时，以模拟分娩过程中盆底肌肉的长时间机械性牵拉以及阴部神经受压情况。建模周期为7天。第8天时，随机选取6只动物进行尿动力学检测。

通过尿动力学检测和血清乳酸脱氢酶（LDH）水平测定验证模型建立成功，后者可作为肌肉损伤的指标。确认建模成功后，将压力性尿失禁（SUI）大鼠随机分为假手术组和治疗组，每组各五只。同时设立五只正常SD大鼠作为对照组。在假手术组中，将针灸针插入穴位BL23（位于L2棘突外侧6 mm处）和GB30（位于髋关节后方），但不施加任何电刺激。在电针组中，采用电针仪对相同穴位进行刺激，操作遵循标准临床治疗方案。电针仪参数设置为1 Hz疏密波，电压2 V。每次干预持续30分钟，连续10天每日一次。所有动物均每日监测，并在标准实验室条件下饲养。实验结束时，对各组动物进行尿动力学检测。随后，各组大鼠均使用3%异氟烷与1.0 L/min氧气混合气体进行麻醉。待大鼠意识丧失后，将异氟烷浓度调整至5%，待大鼠因呼吸衰竭死亡后采集样本。

尿动力学检测
在异氟烷诱导麻醉后，将动物置于仰卧位并固定。通过下腹部正中切口暴露膀胱¹⁸。经膀胱顶部直径约2 mm的瘘管植入硬膜外导管，将其推进至腔内0.5–1.0 cm处，并使用11-0缝线通过荷包缝合技术固定。导管连接至压力监测系统，并通过微量注射泵以10 mL/h的速度灌注37 °C的亚甲蓝染色生理盐水，同时监测膀胱内压。最大膀胱容量定义为灌注持续时间（从开始灌注至尿道首次出现液滴的时间间隔）与流速的乘积。漏点压力（LPP）通过记录手动施加腹部压迫突然释放后立即出现的膀胱内最高压力值来确定。所有参数均通过尿动力学分析系统获取，每项指标重复测量三次。所有样本均随机编码，并由三位独立操作者以单盲方式分别进行分析，每位操作者完成一次测量。三次独立测量的结果用于统计分析。

测定血清乳酸脱氢酶（LDH）水平
术后第7天，从每只大鼠尾静脉采集约1 mL全血。采集的样本在室温下静置1小时以使血液凝固，随后以2,000 × g离心15分钟。小心收集约0.5 mL上清液作为血清。根据制造商提供的操作说明，使用D-乳酸脱氢酶检测试剂盒定量测定血清乳酸脱氢酶（LDH）水平。

蛋白质组学分析与生物信息学分析
对从模型组和治疗组分离的尿道平滑肌组织进行了定量蛋白质组学分析。使用 Proteome Discoverer 2.4 软件（错误发现率阈值设为 1%）对质谱原始数据进行蛋白质鉴定。利用基于 R 语言的软件包对差异表达蛋白（DEPs）进行生物信息学分析：采用 limma 软件包进行差异表达分析（|log2FC| > 1，校正后 p 值 < 0.05）；使用 clusterProfiler 软件包进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，富集的条目/通路以校正后 p 值 < 0.05 且 q 值 < 0.2 为具有统计学意义；利用 pheatmap 软件包绘制层次聚类图。使用 STRING 数据库（版本 11.5，置信度评分 > 0.7）构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。

苏木精-伊红染色
大鼠平滑肌组织用4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋。使用切片机制备连续切片（厚度5 µm），并采用标准化的H&E染色试剂盒进行染色。通过明场显微镜在40×–400×放大倍数下进行形态学评估，重点观察肌肉组织的结构完整性、炎性细胞浸润以及基质重塑情况。

马松三色染色
根据伦理委员会批准的实验方案，我们在治疗的第10天采集了动物样本。大鼠肌肉组织用4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋。使用旋转式切片机切取连续切片（厚度5 µm）。脱蜡切片经马松三色染色法染色后，在明场显微镜下以100×倍数进行成像。

蛋白质印迹（Western blotting）
通过在低温条件下使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液对大鼠平滑肌组织进行机械破碎，提取总蛋白。裂解物在4 °C下以10,000 × g离心15分钟，澄清后收集含蛋白的上清液用于分析。采用双辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白作为标准品进行校准。将等量蛋白（30 µg）上样至10%或12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，在还原条件下进行分离。电泳完成后，将蛋白转移至孔径为0.22 µm的PVDF膜上。膜在室温下用3% BSA封闭1小时，以阻断非特异性结合位点，随后在4 °C下与识别GAPDH、MYL1、TNNI2、TNNT1、TNNT3和MYLPF的一抗孵育过夜。用TBST洗涤三次后，在室温下加入HRP标记的二抗孵育2小时。使用化学发光底物进行信号检测，并通过化学发光成像系统采集图像。通过密度分析对蛋白表达水平进行定量，以GAPDH作为内参。

定量实时 PCR（qPCR）
使用总 RNA 提取试剂裂解组织样本，并按照 RNA 提取试剂盒说明书中的步骤分离 RNA。使用专用软件设计基因特异性引物（表 1），并通过 BLAST 分析验证其特异性（≥18 bp 同源性，Tm = 58–62 °C）。随后使用逆转录试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA，并利用 SYBR Green qPCR 检测试剂盒检测目标基因的表达水平。

统计学分析
两组之间的统计学比较采用独立样本t检验，而多组之间的差异则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并随后进行Bonferroni事后检验。数据以均值 ± 标准差（SD）或均值 ± 均值标准误（SEM）表示。以 p < 0.05 为具有统计学显著性。

结果

阴道球囊扩张损伤大鼠的尿动力学参数
在建模前后评估了膀胱功能，包括排尿控制能力和最大膀胱容量。尿动力学分析显示，与基线相比，阴道球囊扩张（VBD）后最大膀胱容量（MBC）和漏尿点压力（LPP）均出现统计学上显著的下降（P < 0.05）。MBC 从 2.34 ± 0.21 mL 下降至 0.75 ± 0.32 mL（表 2 和 图 1A），而 LPP 从 41.83 ± 5.45 cmH₂O 下降至 22.16 ± 6.90 cmH2O（表 2 和 图 1B）。

压力性尿失禁大鼠尿动力学参数的改善
治疗前后评估了膀胱功能参数，包括尿控能力和最大膀胱容量（MBC）。比较性尿动力学分析显示，与假电针对照组（仅针刺不施加电刺激）相比，电针（EA）治疗组的MBC和漏点压（LPP）均表现出统计学显...

讨论

压力性尿失禁（SUI）是一种常见的泌尿系统疾病，影响产后女性，其病理机制与妊娠和分娩过程中盆底支持结构的损伤密切相关^7,27,28。该病表现为在增加腹压的活动（如咳嗽、打喷嚏或运动）期间出现不自主的尿液漏出，显著损害患者的躯体和心理健康，以及生活质量²⁹。

从发病机制上看，压力性尿失禁（SUI）的发生直接与妊娠和分娩过程中盆底支持结构的解剖学改变及神经肌肉损伤相关^6,30。盆底肌肉对于维持尿道闭合功能至关重要，在分娩过程中会经历显著的适应性重塑。经阴道分娩使盆底肌肉暴露于机械性应力之下，导致多维度的损伤，包括肌纤维断裂、筋膜分离以及微循环障碍^31,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm PVDF 膜	Millipore	ISEQ00010
2× UniTaq SYBR qPCR 主混合液（ROX-）	TIANYAbiotech	P1504
4% 多聚甲醛	GSbioth	GS539A
BCA 检测试剂盒	鼎国生物	BCA02
明场显微镜	MSHOT	ml31
D-乳酸脱氢酶检测试剂盒	碧云天	P0392S
ECL Prime 显色试剂	Cytiva	RPN2232
电泳仪	WIX	miniPro4
全自动化学发光图像分析系统	富士胶片	LAS-3000
GAPDH 抗体	Affinity Biosciences	T0004
HRP 标记的二抗	Affinity Biosciences	S0001,S0002
ImageJ 1.54 软件	NIH
Masson 三色染色试剂盒	GSbioth	GS800A
MYL1 抗体	Cloud-Clone	PAB105Ra01
MYLPF 抗体	Affinity Biosciences	DF9048
名称	公司	货号
PowerLab Chart v5.2.1	ADInstruments
Primer Premier 5.0 软件	PREMIER Biosoft
PrimeScript RT 主混合液	TAKARA	RR036A
Proteome Discoverer 2.4 软件	赛默飞世尔科技
快速半干转膜仪	Bio-Rad	788BR04132
实时荧光定量 qPCR 系统	天隆	TL100
RIPA 裂解缓冲液	碧云天	P0013B
RNA 提取试剂盒	Aidlab	RN70
轮转式切片机	Leica	RM2235
SDS-PAGE 凝胶	碧云天	P0052A,P0053A
标准化 H&E 染色试剂盒	GSbioth	GS700A
TBST 缓冲液	biosharp	BL346A
TNNI2 抗体	Cloud-Clone	PAD230Ra01
TNNT1 抗体	Cloud-Clone	PAD231Ra01
TNNT3 抗体	Cloud-Clone	PAD233Hu01
总 RNA 提取试剂	biosharp	BL258A
尿动力学检测系统	Techman	BL-420