采用不同设门策略进行流式细胞术精子DNA分析结果的比较

摘要

多边形门控（PGG）和十字形门控（CFG）是用于检测精子DNA完整性的流式细胞术方法。PGG可测定DNA片段化指数（DFI）和高DNA染色指数（HDS）。CFG则报告重度DFI、轻度DFI和总体DFI。本研究旨在比较这两种方法的结果及其相关性。

摘要

精子DNA完整性是确保成功受精、胚胎发育及妊娠持续的关键因素 妊娠。采用流式细胞术在DNA变性及吖啶橙染色后进行精子染色质结构分析（SCSA），被公认为评估精子DNA完整性的金标准方法。文献中已报道两种基于流式细胞术评估精子DNA碎片指数（DFI）的设门策略：多边形设门（PGG）与十字形设门（CFG）。本研究旨在比较PGG与CFG两种方法检测结果之间的相关性， 分析其与常规精液分析参数的相关性。采用统计学方法（包括Bland-Altman图和回归分析）对两种方法独立获得的数据进行比较。通过完全随机抽样方法，选取本院生殖中心接受生育力评估的121例男性门诊患者。分别采用PGG和CFG方法通过流式细胞术检测精子DNA碎片指数（DFI）及相关指标。结果显示，两种方法所得DFI值具有良好的一致性。PGG方法测得的DFIp与CFG方法测得的DFIm、DFIs和DFIc之间的相关系数分别为0.6497、0.9404和0.9667（均 p < 0.01）。高DNA染色指数（HDS）与DFI呈轻微负相关。r = -0.3042, p < 0.05）。前向运动精子百分比 与DFIp、DFIs和DFIc呈负相关（r = -0.3824、-0.3794、-0.3574，均 p < 0.05）。HDS 与精液体积、精子浓度、总精子数或前向运动精子比例（PR，%）之间均未观察到显著相关性。这些结果表明，DNA碎片指数（DFI）与男性生育力的关系更为密切，提示CFG方法， 该参数可能更适用于临床评估精子DNA损伤。

引言

精子DNA完整性是指精子细胞核中DNA分子结构的完整性和功能稳定性。具体表现为染色质构象正常、碱基序列完整且无断裂或氧化损伤，并具备将遗传信息准确传递给子代的能力。在精子发生过程中，当氧化应激水平升高¹、染色质重塑异常²或精子受到环境毒素影响³时，精子DNA的完整性会受到损害，导致碱基错配、丢失、修饰、DNA片段插入或交联，以及单链和双链断裂等。此外，受损的精子DNA可损害男性生育力，对辅助生殖技术（ART）的妊娠结局产生不利影响⁴，并增加复发性流产的风险⁵。2021年，欧洲 泌尿外科学会 (EAU)建议将DFI检测纳入男性生育力评估体系⁶。

目前，精子DNA完整性的评估主要通过检测精子DNA碎片化指数（DFI）来进行。利用流式细胞术进行的精子染色质结构分析（SCSA）是评估DFI的主要方法⁷。文献中已报道了两种用于精子DFI检测的流式细胞术设门方法。一种是多边形设门法（PGG），可同时报告两个关键指标，如精子DFI和高DNA染色性精子比例（HDS）⁸。PGG是一种经典的SCSA方法，具有较小的检测变异系数和更优的重复性⁹。然而，该方法无法区分DNA损伤的严重程度。另一种是十字形设门法（CFG），可报告精子DNA严重损伤标志物（DFIs）、精子DNA轻度损伤标志物（DFIm）以及十字形设门法的总DFI（DFIc）。DFIc等于DFIs与DFIm之和。与当前评估精子DNA完整性的其他技术相比，CFG方法能够反映精子DNA损伤的严重程度¹⁰。

为了确定哪种方法更适合评估精子质量，本研究同时采用PGG法和CFG法检测精子DNA碎片指数（DFI）及相关参数，并比较了这两种方法的结果与常规精液分析参数之间的相关性。据我们所知，这是首次分析PGG与CFG两种方法检测结果之间相关性的研究。

方案

本研究经南京医科大学附属淮安第一人民医院医学伦理委员会批准（批准号：KY-2024-181-01）。已获得提供样本患者的知情同意。工作流程的总体示意图见图1。所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。

流式细胞仪CFG设置
经过酸处理后，DNA受损精子的核染色质会呈现单链DNA，而DNA未受损精子的核染色质则保持完整的双链结构。荧光染料吖啶橙（AO）与单链DNA结合后，在488 nm激光激发下发射红色荧光；当其与双链DNA结合时，在488 nm激光激发下发射绿色荧光。根据流式细胞仪捕获的红色和绿色荧光信号数量，计算红色荧光占红色与绿色荧光总和的比例，该比值即代表精子DNA碎片指数（DFI）。

CFG 设置依据 Yang 等人提供的概述进行操作¹⁰。流式细胞仪的配置应以经 AO 染色的正常精子所测得的最低绿色荧光和最高红色荧光作为边界参考（图 2）。以下是 CFG 中各象限细胞特征的说明：
象限 Q1 代表正常精子。观察显示，精子 DNA 完整，AO 结合量最少，因而呈现绿色荧光。
位于象限 Q2 的精子具有部分断裂的 DNA，在荧光显微镜下呈橙色。此类 DNA 可能具有可修复性，因此被归类为轻度 DNA 片段化（DFIm）¹⁰。
象限 Q3 定义为已进行减法处理的非特异性荧光区域。
位于象限 Q4 的精子具有断裂的 DNA，在荧光显微镜下呈红色，表明存在重度 DNA 片段化（DFIs）。

据认为，位于Q2和Q4象限的精子均含有断裂的DNA，其总和定义为DFIc。

流式细胞仪PGG设置
用于流式细胞术分析的多边形门（polygonal gate）根据Evenson等人的方法建立⁸。如图3所示，各门所对应的细胞特征如下：
P3表示DNA变性细胞所占的百分比。
P4代表高DNA染色性（HDS）精子，这类精子缺乏正常的组蛋白向鱼精蛋白的转换。
位于P3和P4门之外的主要细胞群体为正常精子，表现出较低的红色荧光，主要发射绿色荧光。

精液样本的采集与分析
全部121份精液样本均来自就诊于南京医科大学附属淮安第一医院生殖中心的男性。精液样本在禁欲2-7天后通过手淫方式采集。常规精液分析严格按照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》的要求进行^11,12。精子浓度和活动力分析采用计算机辅助精子分析系统（CASA）完成。 每份样本均分析两次，仅当两次结果差异处于95%置信区间内时，报告其平均值；否则需重新采样并分析。

DFI 分析
根据精液样本计算所需样本体积，使流式细胞术试剂盒中的试剂 A 最终精子浓度为 2–3 × 10⁶/mL。计算方法：假设原始精液标本中的精子浓度为 M × 10⁶/mL，则所需精液体积（µL）= 150/M。将计算所得的精液体积加入流式细胞仪检测管中，再加入 50 µL 试剂 A，轻轻混匀。随后加入 100 µL 试剂 B，轻轻混匀，并在室温下孵育 30 秒。立即加入 300 µL 试剂 C，轻轻混匀。使用流式细胞仪检测 CFG 和 PGG 信号，并至少分析 5000 个精子细胞。

统计学分析
使用 GraphPad Prism 6.0 软件对数据进行统计学分析。通过计算均值与差值，绘制 Bland-Altman 图以评估 PGG 与 CFG 之间的一致性程度。将两种方法的差值对其平均值作图。此外，采用 Pearson 法分析 PGG 与 CFG 之间的相关性。设定 p 值小于 0.05 为具有统计学意义。

结果

在121名研究参与者中（平均年龄：32.5 ± 4.9 岁；年龄范围：26–44 岁），28人被诊断为弱精症，4人被诊断为少精症。基线人口学特征和精液分析参数详见表1。

如图4所示，Bland-Altman图显示，PGG和CFG方法获得的精子DNA碎片指数（DFI）结果具有极好的一致性（r = 0.9667，p = 0.0000）。仅有两个样本的差异大于+10%，三个样本的差异小于-10%，所占比例分别为1.7%和2.5%。

表2显示，PGG法测得的DFIp与CFG法测得的三个参数（DFIm、DFIs和DFIc）之间均呈显著正相关。相关系数分别为0.6497、0.9404和0.9667，所有p值均小于0.05。PGG法检测的HDS结果与CFG法检测的DFIs和DFIc呈显著负相关，相关系数分别为-0.3042和-0.2120，所有p值均小于0.05。研究未发现HDS与DFIm之间存在相关性（p值大于0...

讨论

世界卫生组织（WHO）《人类精液检查与处理实验室手册》第6版¹²推荐了四种评估精子DNA完整性的方法：末端脱氧核苷酸转移酶（dUTP）缺口末端标记法（TUNEL）、单细胞凝胶电泳（Comet）试验、精子染色质结构分析（SCSA）以及精子染色质扩散（SCD）试验。其中，由于SCSA采用流式细胞术进行分析，具有高通量、高效率和客观性强等优势，并能同时报告DNA碎片指数（DFI）和高DNA染色质散射（HDS）等参数，因此已被全球众多男科实验室广泛采用⁷。根据一项全球性调查⁷，全球近四分之一（24.1%）的生殖临床医生选择SCSA作为评估精子DNA完整性的方法。

SCSA 实验流程中最关键的步骤是建立适当的流式细胞术设门。传统的 PGG 方法可检测精子 DNA 链的断裂片段（DFI）以及 DNA 染色异常增强（HDS）的精子，后者以组蛋白和鱼精蛋白正常置换的缺失为特征¹³。然而，该方法无法区分精子 D...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
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流式细胞仪	深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司	Cyto E6
流式细胞术检测试剂盒	深圳博锐德生物科技有限公司
Makler精子计数板	Sefi Medical Instruments
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