方法文章

一种简化且稳健的原代人类子宫内膜上皮细胞分离与长期扩增方案

DOI：

10.3791/70429

⸱

2026年4月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The International Education College of Zhejiang Chinese Medical University, 2The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, 3Department of Breast Surgery, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine), 4Quzhou TCM Hospital at the Junction of Four Provinces Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University, 5Bozhou District Hospital of Traditional Chinese Medicine, 6The Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Shihezi University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人子宫内膜上皮细胞（HEECs）的原代培养在技术上具有挑战性。本方案结合使用混合酶消化法与ROCK抑制剂（Y-27632），可在维持上皮细胞特性的同时提高细胞存活率和扩增能力，为子宫内膜研究及再生医学应用提供了一个可靠的实验平台。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

子宫内膜疾病（包括他莫昔芬相关性子宫内膜增生）的研究因缺乏可靠的模型而受到限制 体外 上皮模型。传统分离人子宫内膜上皮细胞（HEECs）的方法通常效率低下、技术要求高且难以规模化。本文描述了一种简化的无饲养层培养方案，结合混合酶消化、红细胞裂解以及持续使用ROCK抑制剂（Y-27632），可高效分离并扩增原代HEECs。Y-27632的添加对于减轻解离诱导的细胞凋亡和增强早期细胞贴附至关重要。该方法支持连续传代，在至少3次传代中维持上皮细胞特性，细胞形态可在10次以上传代中保持稳定。通过Western blot和免疫荧光鉴定，证实细胞高表达角蛋白18（Cytokeratin 18）和E-钙黏蛋白（E-cadherin），在选择性培养条件下，波形蛋白（vimentin）阳性间质污染细胞逐步减少。该方法克服了关键技术局限，为子宫内膜研究中的机制探索、疾病建模、药物筛选及再生医学应用提供了可靠且可扩展的上皮细胞来源。该标准化操作流程可替代复杂的共培养系统，有助于更广泛地获取高质量的原代细胞模型。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

可靠的体外模型对于推进子宫内膜疾病的研究至关重要，尤其是与他莫昔芬（TAM）相关的疾病1。尽管TAM被广泛用作乳腺癌的内分泌治疗药物，但其在子宫内膜中具有部分雌激素激动活性，显著增加了子宫内膜增生、息肉的发生率，并在某些情况下导致恶性转化2。目前对他莫昔芬相关子宫内膜病变的临床管理主要依赖孕激素治疗或手术干预，而这两种方法均存在明显局限性。孕激素治疗常伴随突破性出血和体重增加等不良反应，而手术干预可能造成不可逆的子宫内膜损伤并影响生育能力3。这些局限性凸显了建立稳健的上皮细胞模型的必要性，以支持机制研究并促进更优治疗策略的开发。然而，该领域的进展主要受限于获取高纯度、可扩增的人子宫内膜上皮细胞（HEECs）的技术难题。

该领域的奠基性工作由 Arnold 等人（2001 年）报道，他们通过胶原酶消化和连续筛网过滤分离出间质细胞和上皮细胞群体，经免疫染色验证，纯度超过 98%4。尽管该方法取得了成功，但其依赖于单一酶消化，需要较长的处理时间，并依赖逐步过滤去除间质细胞和红细胞污染物，导致实验流程繁琐且难以标准化4。随后，Yokomizo 等人（2002 年）利用子宫切除标本建立了原代 HEEC 培养系统，采用与间质饲养细胞的三维共培养方式5。尽管基于饲养细胞的微环境在一定程度上支持了上皮细胞的生长，但该系统传代能力有限，通常不超过五次传代，限制了其在需要大规模、稳定扩增上皮细胞的应用中的实用性5。

为了克服这些局限性，我们建立了一种简化且高度可重复的HEEC分离与长期培养方案。基于先前研究发现ROCK抑制剂Y-27632可显著提高人角质形成细胞、牙龈上皮细胞和乳腺上皮细胞原代培养的效率，本研究将相同原理应用于子宫内膜组织6,7,8。该方法包含三个关键步骤：采用混合酶消化以促进组织高效解离，增加红细胞裂解步骤以减少早期污染并促进上皮细胞贴壁，以及持续添加Y-27632以抑制细胞凋亡、支持细胞贴附并增强增殖能力。采用该策略，HEEC可在多次传代过程中持续扩增，同时维持上皮细胞形态以及CK18和E-钙黏蛋白的高表达水平9,10。值得注意的是，连续传代至少3代未观察到明显的表型漂移，表明该培养体系具有良好的稳定性与可扩展性。

该方法直接解决了原代 HEEC 培养中长期存在的技术难题，包括组织用量要求高、操作流程复杂、可重复性低以及扩增潜力有限等问题。通过在传代过程中维持上皮细胞的身份特征和功能特性，该实验方案为子宫内膜再生、病理生理学研究、高通量药物筛选以及细胞-生物材料相互作用的研究提供了可靠的平台。通过将组织处理与连续扩增相结合，这一标准化操作流程解决了生殖生物学领域长期存在的瓶颈问题，并为组织工程、再生医学和个体化治疗的未来发展提供了支持。

本方案需要新鲜的组织样本，最好在采集后24小时内进行处理。细胞得率和生长特性可能因组织来源不同而有所差异，例如子宫内膜息肉与正常子宫内膜之间。常见的失败原因包括组织消化不完全、红细胞污染过多或Y-27632补充不足。尽管该体系支持多代次扩增，但长期培养过程中可能需要进一步优化以维持表型稳定性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新鲜的子宫内膜组织样本取自浙江中医药大学附属第一医院患者手术切除的子宫息肉标本。所有操作均遵循浙江中医药大学附属第一医院医学伦理委员会批准的指南进行（方案编号：2025-KLS-569-01；批准日期：2025年9月14日）。原代人源样本的操作在II级生物安全柜中进行，并穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和眼部防护装置。所有酶类试剂的处理均遵守机构安全规定及《材料安全数据表》（MSDS）指南。

1. 组织获取

  1. 从成年女性手术标本中采集新鲜的子宫内膜组织。将组织转移至含有10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌管中，PBS中添加3%青霉素/链霉素（P/S）。
    注意： 所有组织应在手术采集后24小时内完成处理。

2. 组织预处理

  1. 将组织在洗涤液（表1）中振荡，连续洗涤两次，每次2分钟，以去除黏液和血凝块。
  2. 用5 mL 75%乙醇短暂冲洗组织5秒，以消毒表面。
  3. 立即将组织转移至20 mL洗涤液中，洗涤两次，每次5分钟，以去除残留的乙醇。
    注意：由于乙醇易燃，操作时应远离明火，并根据机构化学品安全指南处理含乙醇的废弃物。

3. 组织消化与细胞收获

  1. 组织切碎
    1. 用两把无菌刀片切碎子宫内膜组织，直至组织碎片（约 2 mm3）可通过 1 mL 移液器吸头吸入（约 10 分钟）。
    2. 将切碎的组织转移至 50 mL 离心管中。
  2. 酶消化
    1. 向含有组织碎片的离心管中加入 10 mL 消化液（表 1）。
    2. 将离心管置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟，每 15 分钟轻轻振荡一次，以促进消化。
    3. 继续孵育，直至组织碎片明显解离，且溶液因释放的细胞而呈现浑浊状态。
  3. 终止消化
    1. 加入 10 mL 中和液以终止酶消化反应。
    2. 使用设定为 800 µL 的 P1000 移液器反复吹打约 15 次，充分混匀。
  4. 过滤与离心
    1. 将消化后的悬液通过 100 µm 孔径滤网过滤。
    2. 在 25 °C 下以 156 × g 离心 5 分钟。
  5. 红细胞（RBC）裂解
    1. 小心吸除上清液，避免扰动沉淀物。
    2. 将细胞沉淀重悬于 2 mL 预冷的红细胞裂解缓冲液中。
    3. 在冰上（约 4 °C）孵育 3–5 分钟，并轻轻振荡。
  6. 终止裂解
    1. 加入 ≥10 mL 的 PBS 或完全培养基以终止裂解反应。
    2. 在 25 °C 下以 156 × g 离心 5 分钟。

4. 原代培养的启动

  1. 洗涤与离心
    1. 小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
    2. 用 20 mL 中和溶液重悬沉淀。
    3. 通过移液吹打约 15 次进行混匀。
    4. 在 25 °C 下以 156 × g 离心 5 分钟。
  2. 重悬与接种
    1. 吸除上清液。
    2. 用 1 mL 移液器缓慢吹打 8–10 次，将细胞沉淀轻柔重悬于 10 mL 含 10 µM Y-27632 的初始培养基中。
    3. 将细胞悬液接种至 100 mm 培养皿中。
      ​注意：为获得最佳初始接种密度，应根据预估细胞产量选择培养容器。若预期产量为 >1 × 106 个细胞，使用 100 mm 培养皿；产量较低时则使用 60 mm 培养皿。相应调整培养基体积（例如，100 mm 培养皿加 10 mL；60 mm 培养皿加 4 mL）。
  3. 培养条件
    1. 将培养皿置于含 5% CO2 的湿润环境中，37 °C 培养。
    2. 每 3 天更换一次不含 Y-27632 的新鲜上皮细胞培养基。
      注意： 观察细胞贴壁情况和形态变化；一旦细胞开始增殖，应每 2 天 更换一次培养基。

5. 细胞传代

  1. 胰蛋白酶消化前准备
    1. 当细胞培养物达到 80%–90% 汇合度时，从培养箱中取出 100 mm 培养皿。
    2. 弃去用过的培养基。
    3. 用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。
    4. 小心吸除并移去残留的 PBS。
  2. 胰蛋白酶消化
    1. 向培养皿中加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液。
    2. 轻轻晃动培养皿，确保胰蛋白酶均匀覆盖细胞层。
    3. 在 37 °C 下孵育 7 分钟。
    4. 在显微镜下（40 倍物镜）观察细胞，确认细胞已脱离。
  3. 中和与收集
    1. 加入 8 mL 中和溶液以终止胰蛋白酶消化作用。
    2. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。
    3. 用移液器上下吹打约 15 次，获得单细胞悬液。
    4. 在 25 °C 下以 156 × g 离心 5 分钟。
  4. 重悬与再接种
    1. 吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
    2. 用 1 mL 移液器上下吹打约 10 次，将细胞沉淀轻柔地重悬于 10 mL 上皮细胞培养基中。
    3. 将 1 × 106 个细胞接种至新的 100 mm 培养皿中，培养基于 10 mL 上皮细胞培养基中。
    4. 调整接种密度，以促进次日形成孤立且分布良好的单个细胞或小细胞簇，避免过度生长。
  5. 传代后培养维护
    1. 在标准培养条件下（37 °C，5% CO2）孵育。
    2. 定期观察培养情况，每 2 天更换一次上皮细胞培养基。
      注：通常在第一次或第二次传代后，当获得健康、贴壁的单层细胞且汇合度 ≥80% 时，细胞即可用于后续实验。
      注意：所有接触过原代人源细胞的材料均被视为潜在生物危害物。在丢弃或进一步处理前，须使用 10% 次氯酸钠溶液进行消毒，符合机构生物安全指南要求。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过形态学、增殖能力和分子水平评估，证实了原代 HEEC 培养体系的成功建立，如图1所示。本方案结合混合酶消化、红细胞裂解和ROCK抑制剂，实现了从人子宫内膜组织中高效分离并稳定扩增上皮细胞。

形态学观察表明，Y-27632 在早期培养过程中具有关键作用。在最初 48 小时内使用 10 µM Y-27632 培养的 HEECs 能迅速贴壁，并于第 3 天形成具有典型铺路石样结构的紧密上皮细胞岛（图 2）。这些克隆在第 5 天至第 7 天持续扩展，最终形成融合的上皮细胞层。相比之下，未添加 Y-27632 的培养体系中细胞贴壁效果差、增殖缓慢，在整个观察期间未能形成有序的上皮细胞簇。该形态学差异得到了动力学增殖实验的支持（图 3），Y-27632 处理组细胞从第 3 天到第 9 天的光密度值显著更高，其中在早期培养建立阶段效应最为明显。

为了验证扩增细...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

建立可靠的 体外 人源子宫内膜上皮细胞（HEECs）模型对于研究子宫内膜生物学与病理学至关重要11尽管已开发出多种 HEEC 分离方法，但大多数方法仍受限于技术复杂、效率低下以及扩增潜力有限4,5许多实验方案还依赖饲养层，这会引入变异性并限制可扩展性12本研究通过提出一种简化的、可重复的方案，解决了长期存在的技术难题，实现了原代人子宫内膜上皮细胞（HEECs）的高效分离与稳定扩增。该方法的成功关键在于三个核心步骤的有序整合：采用混合酶消化法实现有效的组织解离，通过特异性红细胞裂解步骤提高初始纯度，随后在添加ROCK抑制剂Y-27632的培养基中进行培养。

该工作流程的效果在代表性结果中显而易见。添加Y-27632显著改善了细胞早期贴附和克隆形成能力（图2），经处理的培养物迅速形成界限清晰的上皮细胞岛，并呈现典型的铺路石样形态。相比之下，未添加Y-2763...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明，本文发表不存在任何利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由衢州科技计划项目（编号：2024ZD046）、贵州省科技合作基金ZK（2025）一般项目023、兵团科技计划项目（编号：2024ZD059；编号：2026YD026）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dispase SolarbioCAS:42613-33-2用于 HEECs 的分离
胶原酶 I 型MerckSKU:SCR103用于 HEECs 的分离
100 µm 孔径滤网Solarbio431752用于 HEECs 的过滤
兔抗 CK18 抗体abcamab133263用于免疫荧光染色检测 HEECs 的分化标志物
兔抗 CDH1 抗体abcamab40772用于免疫荧光染色检测 HEECs 的分化标志物
兔抗 VIM 抗体abcamab16700用于免疫荧光染色检测 HEECs 的分化标志物
4% 多聚甲醛solarbioP0099用于免疫荧光染色检测 HEECs 的分化标志物
CO2 培养箱Thermo Scientific42820906用于细胞培养
离心机Eppendorf5404HN133048细胞离心
100 mm 细胞培养皿Corning430167用于细胞培养
50 ml 离心管Corning430829用于细胞离心
1.5 ml 微量离心管NEST081722CK01用于细胞消化
细胞筛Solarbio431752细胞过滤
磷酸盐缓冲液Tecono20201033洗涤液
DMEMGibco8122622中和培养基组分
青霉素/链霉素Thermo Scientific15140-122抗生素
胎牛血清Gibco2556132P中和培养基组分
0.05% 胰蛋白酶BasalmediaK431010用于 HEECs  的解离
Y-27632SolarbioIY0040ROCK 抑制剂
红细胞裂解缓冲液SolarbioR1010裂解红细胞
1% Triton X-100 Thermo ScientificHFH10细胞膜通透化
驴抗兔 IgG 抗体Thermo ScientificA32790TR二抗
DAPIThermo Scientific62248DNA 染色
1 × PBSTSolarbioP1031洗涤缓冲液
原代 HEECs 专用培养基iCelliCell-f004-002h用于 HEECs 培养
倒置共聚焦显微镜Zeiss LSM880用于获取免疫荧光图像；配备 40x 物镜
MRC-5 细胞系iCelliCell-h146 人子宫内膜腺癌细胞系；经 STR 鉴定
Ishikawa 细胞系iCelliCell-h113 人子宫内膜腺癌细胞系；经 STR 鉴定

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gompel, A. Progesterone, progestins and the endometrium in perimenopause and in menopausal hormone therapy. Climacteric. 21 (4), 321-325 (2018).
  2. Prat, A., et al. Clinical implications of the intrinsic molecular subtypes of breast cancer. Breast. 24 (Suppl 2), S26-S35 (2015).
  3. Chen, J., Cao, D. Fertility-sparing re-treatment for endometrial cancer and atypical endometrial hyperplasia patients with progestin-resistance: A retrospective analysis of 61 cases. World J Surg Oncol. 22 (1), 169(2024).
  4. Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppälä, M., Lessey, B. A. Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: A new co-culture model. Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).
  5. Yokomizo, R., et al. Endometrial regeneration with endometrial epithelium: Homologous orchestration with endometrial stroma as a feeder. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 130(2021).
  6. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  7. Xie, Z., et al. Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using Y-27632. J Vis Exp. (177), e62978(2021).
  8. Qian, L., et al. Isolation and culture of primary human mammary epithelial cells. J Vis Exp. (207), e66638(2024).
  9. Moll, R., et al. Cytokeratins of normal epithelia and some neoplasms of the female genital tract. Lab Invest. 49 (5), 599-610 (1983).
  10. Shimoyama, Y., et al. Cadherin cell-adhesion molecules in human epithelial tissues and carcinomas. Cancer Res. 49 (8), 2128-2133 (1989).
  11. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: Evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
  12. Riaz, M. A., et al. Long-term maintenance of viable human endometrial epithelial cells to analyze estrogen and progestin effects. Cells. 13 (10), 811(2024).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zhu, Y., et al. Therapeutic effect of Y-27632 on tumorigenesis and cisplatin-induced peripheral sensory loss through rhoa-nf-κb. Mol Cancer Res. 17 (9), 1910-1919 (2019).
  15. Brosens, I., Brosens, J. J., Benagiano, G. The eutopic endometrium in endometriosis: Are the changes of clinical significance. Reprod Biomed Online. 24 (5), 496-502 (2012).
  16. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: Comparison of ficoll gradient centrifugation and red blood cell lysis buffer treatment purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  17. Tam, W. L., Weinberg, R. A. The epigenetics of epithelial-mesenchymal plasticity in cancer. Nat Med. 19 (11), 1438-1449 (2013).
  18. Loh, C. Y., et al. The e-cadherin and n-cadherin switch in epithelial-to-mesenchymal transition: Signaling, therapeutic implications, and challenges. Cells. 8 (10), 1118(2019).
  19. Rubio, S., Cazares, O., Macias, H., Hinck, L. Generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization. J Vis Exp. (157), e60742(2020).
  20. Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Eng Part C Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
  21. Li, X., et al. Prolonged treatment with Y-27632 promotes the senescence of primary human dermal fibroblasts by increasing the expression of IGFBP-5 and transforming them into a caf-like phenotype. Aging. 12 (16), 16621-16646 (2020).
  22. Hu, R., Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R. Molecular mechanisms of tamoxifen-associated endometrial cancer (review). Oncol Lett. 9 (4), 1495-1501 (2015).
  23. Wu, X., et al. Conditional reprogramming: Next generation cell culture. Acta Pharm Sin B. 10 (8), 1360-1381 (2020).
  24. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 19 (5), 568-577 (2017).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

ROCK

相关文章