从2型登革病毒感染的哺乳动物细胞中分离和表征富含外泌体的细胞外囊泡

摘要

本文介绍了从2型登革病毒（Dengue virus type 2）感染的细胞培养上清液中分离富含外泌体的细胞外囊泡的方法，并在特定实验条件下，对囊泡的完整性与粒径分布进行表征，同时通过空斑试验评估其中是否存在可检测到的感染性病毒。

摘要

外泌体富集的细胞外囊泡（EVs）是由多种细胞类型释放到血浆、尿液、唾液、细胞培养基及其他体液等细胞外液体中的囊泡，其直径范围为30 nm至150 nm。它们参与多种细胞过程，包括在感染期间的细胞间通讯和免疫调节。基于这些作用，外泌体富集的EVs已被用于研究多种病毒的致病机制。目前使用常规纯化技术从病毒感染的细胞上清液中分离外泌体富集的EVs仍具挑战性，这主要是由于某些病毒与外泌体富集的EVs在大小上存在重叠。本文旨在从2型登革病毒感染的细胞培养上清液中纯化外泌体富集的EVs。本研究采用商用外泌体分离试剂盒分离外泌体富集的EVs。在本方案所测试的条件下，通过噬斑实验未检测到所分离EVs中存在具有感染性的病毒。通过四跨膜蛋白的蛋白质印迹分析、纳米颗粒追踪分析以及透射电子显微镜对EVs粒径进行表征确认。结果表明，所获得的外泌体富集EVs结构完整，粒径处于正常的外泌体范围（30–150 nm）内。总体而言，本方案提供了一种经济有效的方法，用于从病毒感染的细胞培养上清液中纯化外泌体富集的EVs，可用于后续功能分析实验。

引言

外泌体富集的细胞外囊泡（EVs）是由体内所有细胞释放的纳米级囊泡，属于起源于内吞作用的细胞外囊泡（EVs）亚型。外泌体富集的EVs最初在网织红细胞培养基中被发现¹。在过去几十年中，已从多种体液中纯化出此类囊泡，包括血液、尿液、唾液、母乳、精液以及羊水^2,3,4,5。其直径范围为30 nm至150 nm⁶。它们通过多泡体（MVBs）与细胞质膜融合而释放到细胞外空间。在感染与免疫应答背景下，外泌体富集的EVs已被证实可诱导哺乳动物细胞产生特异性反应，此类反应包括细胞因子的释放或感染易感性的改变^7,8,9。

外泌体富集型细胞外囊泡（EVs）的内容物受多种因素影响，其中最重要的是产生这些囊泡的细胞类型及其状态^10,11。此外，其内容物也决定了它们对 naïve 受体细胞所产生的效应。目前有多种方法可用于从生物体液中分离外泌体富集型EVs，常见方法包括差速超速离心法、沉淀法、免疫亲和捕获法、尺寸排阻色谱法、磁珠分离法以及基于微流控的分离技术。

差速超速离心法被认为是最常用的分离技术之一^12,13,14。超速离心纯化方法成本较高，且需要较高的技术熟练度。此外，由于多次超速离心步骤，该方法还会导致细胞外囊泡（EVs）的显著损失。最后，由于病毒颗粒与EVs具有相似的表型特征，所获得的外泌体富集型EVs中仍可能含有具有活性的病毒颗粒。这使得从病毒感染细胞的上清液中纯化外泌体富集型EVs变得具有挑战性。因此，建立一种优化的实验方案，以有效将登革病毒（DENV）在外泌体富集型EV溶液中的含量降低至无法检测的水平，显得尤为重要，因为病毒与外泌体在大小和密度上相似^15,16。

与其他常用技术相比，本方案具有多项优势，包括缩短纯化时间、依赖价格低廉且广泛可及的实验设备，以及能够分离出富含外泌体的细胞外囊泡（EVs），且未检测到活病毒污染。此外，尽管密度梯度离心法和磁珠分离法等方法在提高得率和纯度方面具有一定优势，但这些方法均需初始的超速离心步骤。本文旨在介绍一种在所测试条件下，通过空斑实验未检测到传染性病毒的情况下，从感染性上清液中分离富含外泌体的细胞外囊泡的方法。

方案

1. 外泌体耗竭培养基的制备

1. 在II级生物安全柜（BSC）内，将0.1 µm滤器连接至其接收底座上。
2. 在无菌条件下，将热灭活的胎牛血清（FBS）倒入滤器中，并将其连接至生物安全柜内的真空泵。
3. 重复步骤1.2，对滤过液再进行两次过滤。
4. 配制完全培养基，其中包含三重过滤的FBS 10%、青霉素/链霉素1%和L-谷氨酰胺1%。
   注意：采用三重过滤方法可避免使用超速离心机等仪器。

2. 登革病毒对哺乳动物细胞的感染

1. 在组织培养孵育箱中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下，在 T75 cm² 培养瓶中过夜培养 Vero 细胞。
2. 次日，检查细胞融合度是否达到 70% 至 80%，然后用 5 mL 完全培养基加入 DENV-2 病毒，以 0.1 的感染复数（MOI）感染细胞，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时。
3. 2 小时后，弃去上清液，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养瓶 3 次。
4. 向培养瓶中加入 50 mL 完全培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育 4 天（直至即将出现细胞病变效应前）。

3. 基于试剂盒的外泌体纯化

1. 将培养瓶中的细胞培养基转移至50 mL锥形管中，在室温下以200 × g 离心15分钟。
2. 将上清液转移至新的锥形管中，加入125 µL EV沉淀试剂，随后加入600 µL树脂。涡旋振荡10秒，并在生物安全柜内室温静置10分钟。
3. 再次涡旋振荡10秒，在室温下以约450 × g 离心2分钟。转移至生物安全柜中，弃去上清液，并向沉淀中加入600 µL重悬缓冲液。
4. 涡旋振荡10秒，在室温下孵育15分钟。
5. 再次涡旋振荡10秒，在室温下以约25 × g 离心2分钟。
6. 将上清液转移至滤膜离心柱中，在室温下以约4,500 × g 离心1分钟。收集穿过滤膜的流出液（含外泌体富集的细胞外囊泡），并于-80 °C保存直至使用。
7. 通过空斑形成实验确认外泌体富集的细胞外囊泡中无活病毒¹⁷。
8. 采用透射电子显微镜检测外泌体富集的细胞外囊泡的形态大小，并通过纳米颗粒追踪分析检测其粒径分布与浓度¹⁸。

4. 通过蛋白质印迹法对富含外泌体的细胞外囊泡进行表征

1. 使用BCA等方法测定外泌体富集的细胞外囊泡（EV）的蛋白浓度。
2. 将外泌体富集的EV溶液与RIPA裂解液等体积混合，并加入4倍体积的LDS上样缓冲液（4:1）。
3. 使用4-12% Bis-Tris凝胶对外泌体富集的EV蛋白进行分离。
4. 将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。
5. 在室温下，用含5%脱脂奶粉的1×TBS-Tween缓冲液封闭1小时。
6. 用含5%脱脂奶粉的溶液将一抗稀释至1:1,1000，于4 °C孵育过夜，检测CD63和CD9等外泌体相关蛋白。
7. 移除一抗，在摇床上用1×TBS-Tween缓冲液洗涤5次，每次5分钟。
8. 将二抗（抗兔IgG-HRP）用脱脂奶粉溶液稀释至1:5,000，在室温下孵育膜1小时。
9. 移除二抗，在摇床上用1×TBS-Tween缓冲液洗涤5次，每次5分钟。
10. 使用ECL显色试剂显影，并通过化学发光成像系统检测蛋白信号。

5. 通过透射电子显微镜表征外泌体富集的细胞外囊泡

1. 将5 µL外泌体样品加入带有甲酸盐和碳涂层的200目铜网上，室温下自然晾干。
2. 用1%醋酸铀酰水溶液染色60秒，然后空气干燥。
3. 在80 kV条件下使用透射电子显微镜（TEM）采集图像¹⁸。

结果

我们按照本方案所述方法，采用蚀斑实验分析分离得到的外泌体富集型细胞外囊泡（EV），以检测混合物中是否存在具有活性的登革病毒2型（DENV-2）颗粒。如图1所示，在测试条件下未检测到蚀斑，而阳性对照组则出现明显蚀斑。这些结果表明，具有感染性的病毒含量低于蚀斑实验的检测阈值。该蚀斑实验进行了三次独立的生物学重复，每次设两个技术重复。采用BCA法测定分离获得的外泌体富集型EV的蛋白浓度，结果显示其蛋白浓度范围为989 µg/mL至1,300 µg/mL（Table 1）。此外，对外泌体富集型EV进行的蛋白质印迹（Western blot）分析显示，存在CD63和CD9四跨膜蛋白，这些是常见的外泌体标志物（图2）。同时，采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定外泌体富集型EV的粒径和浓度，结果显示其直径分布在80–110 nm范围内（图3）。最后，通过透射电子显微镜对外泌体富...

讨论

传染病研究的最新进展表明，由病毒感染的幼稚细胞释放的富含外泌体的细胞外囊泡（EV）在调节宿主免疫反应中发挥关键作用^7,8,9。这些富含外泌体的EV可通过促进适当的抗病毒反应来增强免疫防御，或相反地，通过抑制宿主防御机制来促进病毒逃避免疫攻击。

为了阐明这些相反的作用，必须分离出不含污染性病毒颗粒的完整外泌体富集型细胞外囊泡（EV）。目前有多种方法用于外泌体富集型EV的纯化^12,13,14；然而，这些方法存在显著局限性，包括设备成本高、处理时间长、技术复杂、样品损失严重，以及难以将病毒与外泌体富集型EV有效分离¹³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗兔IgG-HRP标记抗体	Cell Signaling	7074S	二抗
CD63	Cell Signaling	52090S	一抗
CD9	Cell Signaling	13174S	一抗
细胞培养基外泌体纯化试剂盒	Norgen	60600	外泌体纯化试剂盒
登革病毒2型	ATCC	VR-1584	病毒
DMEM	Fisher scientific	11-995-073	培养基
EMEM	ATCC	30-2003	培养基
FEI Talos F200X 透射电子显微镜	Thermofisher Scientific
胎牛血清	Neuromics	FBS002	培养基添加剂
纳米颗粒追踪分析仪	Particle Metrix
Vero细胞	ATCC	CCL-81	哺乳动物细胞系