艾美球虫寄生虫中随机转基因整合与表达的验证

摘要

本文介绍了一种用于验证外源基因在转基因Eimeria寄生虫中整合与表达的标准化方法。该方法通过整合基因组和蛋白质水平的分析，确认外源基因的稳定插入及其表达。这一技术路线有助于推动用于科研和疫苗开发的转基因Eimeria株系的构建。

摘要

验证转基因Eimeria寄生虫对于确认外源基因在基因组中的稳定整合与表达至关重要。本方案描述了一套完整的操作流程，用于验证Eimeria tenella中外源基因的插入及其蛋白表达。该流程首先从孢子化卵囊中提取基因组DNA，随后通过PCR扩增初步验证目标片段的存在。为进一步确认基因组整合情况，进行全基因组重测序以鉴定插入位点，并评估外源构建体在寄生虫基因组中的稳定性。接着，通过裂解纯化的子孢子制备蛋白样品，并进行Western blot检测，以分析目标重组蛋白的表达。此外，利用感染的宿主细胞进行间接免疫荧光分析（IFA），以观察目标蛋白的细胞内定位。上述多种检测方法共同构建了一个可靠且可重复的验证体系，用于确认转基因Eimeria品系的建立。该工作流程可有效验证基因组整合与蛋白表达，从而为Eimeria寄生虫的遗传操作、功能基因组学研究及疫苗开发等后续应用提供支持。

引言

由球虫引起的球虫病， 艾美球虫属 物种，是家禽中最具经济重要性的寄生虫病之一，可导致体重增长减缓、饲料转化率下降，每年造成的全球经济损失估计达数十亿美元^1,2,3基因操作 艾美球虫 寄生虫已成为基础研究和疫苗开发的有力工具^4,5,6稳定转染可实现外源基因（如荧光报告基因或保护性抗原）的整合与表达，从而实现实时观察寄生虫发育过程及对疫苗候选分子的靶向评估^7,8,9.

Duan 等人先前发表的一项研究提供了转染子转染和体内扩增转基因 Eimeria 的标准化方案，建立了一种高效生成和富集重组寄生虫品系的方法¹⁰。然而，目前尚无统一的工作流程用于确认转基因在基因组中的稳定整合及其功能表达。此类验证对于确保用于后续生物学研究或疫苗应用的转基因品系的真实性、稳定性和可重复性至关重要。

本文介绍了一种完整的、逐步操作的实验方案，以表达传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2抗原的转基因Eimeria tenella品系（Et-VP2）为模型，验证外源基因在Eimeria tenella中的整合与表达¹¹。将携带VP2基因及mCherry报告基因的表达质粒p5′AMic2linkerVP2m3′A转染至野生型E. tenella子孢子（Et-WT）中，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出红色荧光卵囊，并在无球虫鸡体内连续传代。该实验流程涵盖了基因组DNA提取、基于PCR的初步整合分析、全基因组重测序以确定插入位点、Western blot验证蛋白表达，以及间接免疫荧光检测（IFA）观察重组蛋白在细胞内的定位。上述方法共同构成了一个可重复且全面的体系，用于确认转基因Eimeria品系的真实性，从而保障其在功能基因组学研究与疫苗开发中的可靠应用。

方案

所有涉及鸡的动物实验均由中国农业大学实验动物管理和使用委员会批准（批准编号：CAU20160628-2）。所有饲养和实验操作均遵循中国农业大学实验动物管理和使用委员会的指南，并符合《涉及动物的生物医学研究国际指导原则》。本研究使用了7日龄雄性无特定病原体（SPF）白来航鸡。实验期间，禽类在标准饲养条件下饲养，自由采食和饮水。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 从孢子化 Eimeria spp. 卵囊中提取基因组 DNA

1. 将1 mL卵囊悬液（≥1 × 10⁷/mL）转移至1.5 mL微量离心管中。加入与卵囊沉淀等体积的1 mm玻璃珠。使用组织匀浆器在60 Hz条件下剧烈振荡研磨5分钟，直至卵囊壁完全破裂并释放内容物。
2. 将混合液（不含玻璃珠）收集至新离心管中，在12,000 x g条件下离心1分钟。弃去上清液，加入500 µL CTAB缓冲液和40 µL蛋白酶K，于60 °C孵育30分钟。
3. 加入500 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），涡旋振荡10秒，然后在12,000 x g条件下离心5分钟。将上层水相转移至新管中。
   注意：应严密封闭并妥善丢弃含有有机相的离心管，以防止环境污染。（可选）若蛋白质污染仍较高，可额外重复步骤1.3一次或两次。
4. 加入500 µL氯仿:异戊醇（24:1），涡旋振荡10秒，然后在12,000 x g条件下离心5分钟。将水相转移至新管，加入等体积异丙醇。反复倒置混匀，直至出现DNA沉淀。
   注意： 在−20 °C下沉淀≥1小时或过夜可提高得率。
5. 在12,000 x g条件下离心10分钟以收集DNA沉淀。用70%乙醇洗涤沉淀，在12,000 x g条件下再次离心5分钟，弃去上清液。用真空泵小心吸除残留液体，并在室温或37 °C下将沉淀空气干燥。
6. 将干燥的DNA沉淀溶解于含RNase的ddH₂O或TE缓冲液中。在37 °C孵育≥1小时，或在4 °C过夜，以去除残留RNA。将纯化后的DNA储存于−20 °C。
   注意：如需长期保存，未溶解的DNA沉淀可直接储存于−20 °C或−80 °C。在进行下游应用前，应通过琼脂糖凝胶电泳评估DNA的完整性和浓度。

2. 通过PCR验证寄生虫基因组中Et-VP2载体的存在

1. 设计引物对（表1），以验证 Et-VP2 构建体的基因组整合。
   注意：引物序列使用 Primer-BLAST 设计，典型参数为引物长度 18–24 bp，退火温度约 55–60 ℃，并尽量减少二级结构的形成。每对引物的特异性进一步通过比对 Eimeria tenella 基因组进行验证，以避免非特异性扩增。
2. 配制 50 µL 反应体系，包含 25 µL 2× Taq Master Mix、21 µL ddH₂O、正向和反向引物各 1 µL，以及 2 µL DNA 模板。
3. 采用以下热循环条件进行扩增：95 °C 预变性 5 min；30 个循环（95 °C 变性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min）；最后在 72 °C 延伸 10 min。
   注意：热循环前确保所有试剂充分混匀。使用新鲜制备的 DNA 模板以获得最佳扩增效率。

3. 转基因寄生虫品系（Et-VP2）的重测序

1. 样品提交与文库构建
   1. 向商业测序服务提供商提交 1 mL 卵囊悬浮液（浓度 ≥1 × 10⁷/mL），用于下一代重测序分析。
   2. 在对基因组 DNA 进行质量评估后，通过超声波机械打断的方式对 DNA 进行片段化。纯化片段化后的 DNA，进行末端修复，在 3′ 端添加腺苷酸（A），并连接测序接头。
   3. 利用琼脂糖凝胶电泳筛选目标大小的 DNA 片段，并通过 PCR 扩增构建测序文库。
   4. 对构建完成的文库进行质量检测。在 Illumina NovaSeq 平台上进行双端测序，读长为 150 bp，测序深度维持在 100× 以确保数据准确性，生成至少 6 GB 的原始数据，且质量值不低于 Q20 >90%。
      ​注意：所有试剂和 DNA 样品操作均需采用无菌技术，防止污染。在进入数据分析前，需确认测序参数满足所需的测序深度和质量指标。
2. 数据分析
   1. 使用 Fastp 软件（v0.23.2）对原始测序数据进行过滤，过滤标准如下¹²：
      1. 去除接头序列。
      2. 设定低质量阈值为 Q20，若 reads 中低质量碱基占比超过总长度的 30%，则予以剔除。
      3. 去除长度短于 50 bp 的 reads。
   2. 使用 Bowtie2 软件（v2.4.5）将质控后的 reads 比对至 E. tenella 参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1）¹³。下一代测序数据的随机性通过测序覆盖深度和均一性进行评估。
   3. 确保测序 reads 能比对至转基因载体序列。去除未比对至 T-DNA 区域的 reads，获得嵌合 reads，其中一端比对至 T-DNA，另一端比对至 E. tenella 参考基因组。
   4. 基于嵌合 reads 的序列，使用 ToxoDB（版本 64）进行比对，以确定潜在 T-DNA 插入位点的具体位置。利用 Mosdepth 软件（v0.3.3）¹⁴ 分析载体与 Eimeria 基因组之间的同源区域（即 5′ 和 3′ 调控区）的测序深度。
   5. 鉴定转基因质粒在 E. tenella 基因组中的潜在整合位点，并使用步骤 2.1 中描述的反应体系通过 PCR 进行验证。
      注意： 在整个分析过程中，应始终使用一致的软件版本和参数设置，以确保数据的准确性和可重复性。

4. 转基因蛋白的Western印迹分析 艾美球虫属 蛋白质

1. 在1.5 mL离心管中收集含有至少5 × 10⁶个子孢子的PBS悬浮液，于2500 x g 离心5分钟。将沉淀重悬于100 µL RIPA裂解缓冲液中，冰上孵育1小时。加入20 µL 6×蛋白上样缓冲液，于100 °C加热10分钟。
2. 使用1.5 mm玻璃板制备SDS-PAGE凝胶。根据目标蛋白的分子量调整丙烯酰胺浓度。在聚合过程中，用蒸馏水覆盖分离胶以确保表面平整，再添加浓缩胶。
3. 将裂解液于10,000 x g 离心5分钟，取40 µL上清液加入每个样品孔。另设一孔加入10 µL蛋白Marker，其余空孔均加入40 µL 1×上样缓冲液作为对照。
4. 在1×电泳缓冲液中，先以70 V电泳20分钟，再以120 V电泳60–90分钟，直至染料前沿迁移至凝胶底部。
5. 根据目标蛋白的预期大小切下凝胶。将PVDF膜在甲醇中预活化1分钟，按以下顺序组装转膜“三明治”结构：海绵、滤纸、凝胶（阴极侧）、PVDF膜、滤纸、海绵。去除所有气泡，于转膜缓冲液中以70 V转膜3小时。
6. 用PBST洗涤膜三次，每次5分钟，随后用5%脱脂奶粉室温封闭1小时或4 °C过夜。再用PBST洗涤两次，去除残留封闭液。
7. 将膜与抗体缓冲液稀释的一抗孵育：小鼠多克隆抗Flag抗体（1:2000）和小鼠单克隆抗GAPDH抗体（1:2000），室温轻摇孵育1小时或4 °C过夜。回收抗体溶液，用PBST洗涤膜五次，每次5分钟。
8. 将膜与HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1:2000）室温孵育1小时。用PBST洗涤膜五次，每次5分钟。
9. 将ECL底物A液与B液等体积混合，均匀滴加至膜表面，使用化学发光成像系统检测蛋白信号。
   注意：除非另有说明，所有涉及蛋白样品的操作均需在冰上进行。操作甲醇和ECL底物时应在通风橱内佩戴手套和护目镜。

5. 转基因细胞内间接免疫荧光测定（IFA） 艾美球虫

1. 使用层析柱纯化子孢子
   1. 将层析柱连接至蠕动泵，并调节流速至50–60 Hz。用蒸馏水和甘氨酸溶液洗涤层析柱。
   2. 在持续加入甘氨酸溶液的同时，向层析柱中加入DE-52纤维素悬浮液，直至纤维素柱床高度达到约1 cm。
   3. 将通过Percoll方法初步纯化的子孢子上样至层析柱中。使用甘氨酸溶液维持流速在30–40 Hz，并用50 mL离心管收集穿流液。
   4. 通过将液滴置于玻片上进行显微镜观察来监测洗脱液。当检测不到子孢子时，停止泵运行。将收集的组分在2,500 x g 条件下离心5 min，弃去上清液，并将沉淀重悬于PBS中。
      ​注意：所有操作均需在无菌条件下进行，以防止微生物污染。甘氨酸和Percoll废弃物应按照机构生物安全规定进行处理。
2. 子孢子感染HFF细胞
   1. 将1 × 10⁶个子孢子接种至含有HFF细胞单层的24孔板中。加入青霉素-链霉素至终浓度为1×（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），轻轻混匀，于37 °C孵育4–6 h以允许入侵。移除培养基，用1 mL PBS洗涤一次，弃去上清液。
   2. 使用无菌镊子小心地从孔中取出玻璃盖玻片，并转移至新的24孔板中。用1 mL 4%多聚甲醛固定样品30 min，用1 mL PBS洗涤一次，弃去上清液。
   3. 用1 mL 0.25% Triton X-100对细胞进行透化处理30 min。用1 mL PBS洗涤一次，弃去上清液。
   4. 用1 mL 3% BSA封闭样品30 min。用1 mL PBS洗涤一次，弃去上清液。
   5. 将小鼠单克隆抗-Flag抗体（1:200稀释）溶于3% BSA中。将稀释后的抗体液滴加至封口膜上，将盖玻片（细胞面朝下）倒置覆盖于液滴上。在37 °C湿盒中孵育1 h。用1 mL PBS洗涤三次，每次5 min。
   6. 将FITC标记的山羊抗小鼠IgG（1:200稀释）和Hoechst 33258（1:100稀释）溶于3% BSA中。将染色混合液滴加至封口膜上，将盖玻片倒置于液滴上。在37 °C湿盒中孵育1 h，然后用1 mL PBS洗涤五次，每次5 min。
   7. 在玻片上滴加5 µL抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片（细胞面朝下）倒置于液滴上，避免产生气泡，并封固边缘。将封片后的玻片置于4 °C湿盒中保存，直至成像。
      注意：操作多聚甲醛和Triton X-100时应在化学通风橱内进行，并佩戴手套和眼部防护装备。本实验所用试剂配方详见表2。

结果

基因组PCR分析证实了转基因寄生虫中存在目标片段，而在野生型对照中未检测到相应条带（图1A）。全基因组重测序进一步表明，线性化质粒已稳定整合到寄生虫基因组中，并通过跨越连接区域的PCR扩增验证了预测的整合位点（图1B）。

通过蛋白质印迹法验证了蛋白表达，结果显示转基因菌株中出现一条与融合蛋白预期分子量相符的明显条带。在野生型对照中未观察到信号（图2）。

间接免疫荧光实验进一步显示，在表达外源基因的子孢子中存在细胞内信号，证实了该基因的表达及其定位，而对照组则未见阳性信号（图3）。

这些结果表明，目标构建体存在于寄生虫基因组中，并且在转基因的 E. tenella 细胞水平上，所编码的蛋白能够稳定表达。

讨论

本方案建立了一套全面的工作流程，用于验证外源基因在转基因E. tenella中的基因组整合、蛋白表达及细胞内定位。该方法不依赖单一检测手段，而是结合基因组和蛋白水平的证据，确保外源基因的插入既在结构上得到确认，又实现功能性表达。

本方案中有多个关键步骤会显著影响转基因株系验证的成功与否。如果这些步骤未经过仔细优化，可能会出现技术问题。从纯化的寄生虫材料中提取高质量的基因组DNA，对于可靠的PCR扩增及后续测序分析至关重要。若卵囊裂解不充分或混有宿主细胞成分，可能降低DNA质量，导致DNA得率低以及PCR扩增微弱或结果不一致。可通过延长均质化时间或提高珠击破碎强度来缓解这些问题。整合位点的准确鉴定还需要足够的测序深度以及与参考基因组的可靠比对。在蛋白质水平上，Western blot检测的灵敏度取决于高效的蛋白质提取以及用于靶标识别的抗体特异性。当目标蛋白表达水平较低或提取效率有限时，可能出现较弱的信号。通常可通过增加寄生虫裂解液的上样量或优化裂解条件来提高信号强度。此外，适当的固定、通透及抗体孵育条件对于获得清晰的免疫荧光染色和准确的亚细胞定位至关重要。IFA实验...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗荧光淬灭封片剂	MCE	HYK1042	防止光漂白的荧光封片剂
BSA（3%）	Beyotime	ST023	用于免疫荧光的封闭缓冲液和抗体稀释缓冲液；室温封闭30分钟
氯仿：异戊醇（24:1）	Sigma	C0549	基因组DNA提取过程中去除残留酚的试剂
无球虫鸡	Boehringer-Ingelheim	无特定病原体	用于转基因品系的体内传代与扩增；已获伦理委员会批准（批准号：CAU20160628-2）
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）	默克股份公司	H5882	基因组DNA提取缓冲液组分；配方：3 g CTAB + 12.27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0.5 mol/L EDTA，用ddH₂O定容至150 mL2O
DE-52 纤维素	Solarbio	C8350	用于子孢子纯化的离子交换层析介质；依次用 NaOH、HCl 和蒸馏水处理，然后用甘氨酸溶液平衡
ECL 底物（溶液 A + 溶液 B）	thermofisher	32106	化学发光检测试剂；使用前等体积混合溶液A和溶液B
FITC标记的山羊抗小鼠IgG	Sigma	AP124F	用于免疫荧光分析的荧光二抗，稀释比例 1:200
玻璃珠	Sigma	Z250473-1PAK
甘氨酸溶液	Sigma	67419	色谱柱平衡与洗脱缓冲液；配方：0.75 g 甘氨酸 + 7.9 g NaCl 溶于 500 mL 蒸馏水中，pH 调至 7.4–7.6，经高压灭菌
Hoechst 33258	Sigma	94403	核染色试剂，稀释比例1:100；用于IFA定位
HRP标记的山羊抗小鼠IgG	Sigma	12-349	用于Western blot的二抗，稀释比例为1:2000
Illumina NovaSeq 测序平台	Personalbio生物科技有限公司（中国上海）		下一代测序平台；双端测序（150 bp 读长），测序深度 100×，生成 ≥6 GB 原始数据（Q20）>90%)
低速离心机	北京时代贝力离心机	DT5-2
小鼠单克隆抗Flag抗体	Sigma	F1804	一抗，稀释比例1:200；用于Flag标签融合蛋白的免疫荧光检测
小鼠单克隆抗GAPDH抗体	Sigma	G8795	一抗，稀释比例1:2000；用作Western blotting的上样对照
脱脂牛奶（5%）	Beyotime	P0216	用于 Western 印迹的封闭缓冲液；室温封闭 1 小时或 4 ℃过夜°C 过夜
4% 多聚甲醛	默克股份公司	30525	细胞固定液；室温固定30分钟
PBS	Solarbio	P1010
青霉素-链霉素（100×)	Yeasen	60162ES76	细胞培养用抗生素；抑制微生物污染
Percoll（密度梯度储备液）	GE Healthcare	17-0891-09
苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)	默克股份公司	77617	基因组DNA提取过程中用于去除蛋白质的试剂
蛋白上样缓冲液（6×）×)	Beyotime	P0015F	蛋白质电泳上样缓冲液；配方：100 mM Tris（pH 6.8），4% SDS，2 mM EDTA，2% 甘油，6 M 尿素；与50混合 μL 2 M DTT 和 50 μ使用前加入终浓度为5%的溴酚蓝
蛋白酶K	默克集团	39450-01-6	200 mg 溶于 10 mL ddH₂O2O，用于基因组DNA提取过程中蛋白质的消化
PVDF 膜	thermofisher	88518	蛋白转印膜；使用前用甲醇活化1分钟
RIPA裂解缓冲液	Yeasen	20101	用于子孢子蛋白提取的裂解缓冲液
RNase A	默克股份公司	9001-99-4	25 mg 溶于 2.5 mL 0.01 mol/L NaAc，100 ℃ 加热°在10–15分钟内于C条件下反应，用1 mol/L Tris-HCl调节pH至7.4；用于从DNA样本中去除RNA
SDS-PAGE 凝胶试剂（丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tris、SDS、APS、TEMED）	生物	101	用于SDS-PAGE凝胶制备的试剂；丙烯酰胺浓度根据目标蛋白的分子量进行调整
水合牛磺脱氧胆酸钠	Sigma	T0875
溶液
Taq 混合液 (2×)	Vazyme	P112-01/02/03	含Taq聚合酶、dNTPs等的PCR扩增预混液
Triton X-100（0.25%）	默克股份公司	9036	细胞通透化溶液；室温孵育30分钟
胰蛋白酶	Solarbio	T8150
涡旋混合器	北京北泰智联科技有限公司	HQ-60-II
水浴恒温器	Grant Instruments（剑桥）	GD120, GM0815010