骨关节炎患者髌下脂肪垫来源的小细胞外囊泡的分离与表征

摘要

摘要 本方案提供了一种标准化的操作流程，用于从骨关节炎患者髌下脂肪垫组织中分离和表征小型细胞外囊泡（sEVs）。

摘要

细胞外囊泡（EVs），尤其是定义为直径小于200 nm的小细胞外囊泡（sEVs），是细胞间通讯的重要介质，几乎由所有细胞类型释放至多种生物体液中。髌下脂肪垫（IPFP）与膝骨关节炎（OA）的发生和发展密切相关。然而，目前仍缺乏从IPFP组织外植体直接分离sEVs的标准化方法。本文介绍了一种可重复的实验方案，用于从OA患者获取的IPFP组织中分离和表征sEVs。收集IPFP组织培养的条件培养基后，首先通过低速离心去除细胞和碎片，随后采用超速离心富集符合sEV尺寸范围的囊泡。根据细胞外囊泡研究最低信息标准（MISEV2023）的建议，利用涵盖不同功能类别的代表性蛋白标志物对所得囊泡进行表征：CD63作为膜相关四跨膜蛋白，ALIX和TSG101作为参与ESCRT（运输所需内体分选复合物）介导生成过程的胞质蛋白，Calnexin作为内质网驻留蛋白用于监测潜在的非囊泡污染。该流程可获得特征明确的sEV制备物，适用于骨关节炎研究中的功能实验或蛋白质组学分析等下游应用。

引言

小细胞外囊泡（sEVs）是一类异质性的小细胞外囊泡亚型，根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）在细胞外囊泡研究最低信息标准（MISEV2023）指南中提出的操作性分类，被定义为直径通常小于200 nm的囊泡¹。几乎所有类型的细胞均可向生物体液中释放sEVs，因其在生理和病理条件下作为细胞间通讯的重要介质而受到越来越多的关注^2,3。

小细胞外囊泡（sEVs）的膜富含多种功能蛋白。其中，CD63等四跨膜蛋白家族成员与囊泡膜的组织和融合相关⁴。此外，参与运输所需内体分选复合物（ESCRT）的胞质蛋白，如ALIX和TSG101，在sEV的生物合成与分泌过程中起关键作用。因此，这些蛋白可作为可靠标志物，用于确认所分离囊泡的内体来源^5,6。

髌下脂肪垫（IPFP）已被认为是一种活跃的关节相关组织，与骨关节炎（OA）的起始和进展密切相关^7,8。在炎症和退行性条件下，推测来源于IPFP的sEVs携带炎症介质和致病信号，从而促进滑膜炎症和软骨降解⁹。因此，对OA患者IPFP组织释放的sEVs进行表征，可能为疾病相关的细胞间通讯网络提供关键见解。

鉴于小细胞外囊泡（sEVs）作为分子介质和潜在治疗剂的研究兴趣日益增加，建立一种高得率、高纯度且可重复的分离方法至关重要。尽管差速超速离心法仍是应用最广泛的纯化策略之一¹⁰，但针对细胞培养上清液或生物液体优化的方案可能无法直接适用于IPFP等实体脂肪来源组织。高脂含量、致密的细胞外基质以及可变的酶消化条件均可能影响囊泡的回收率和纯度。

组织外植体培养是一种生理相关性较高的方法，可在最大程度保留天然细胞结构和细胞间相互作用的同时，减少过度的酶消化破坏，从而能够在接近天然的条件下收集释放的sEVs。然而，目前尚缺乏专门针对IPFP外植体培养中sEV分离的标准化操作流程。

本文介绍了一种通过差速超速离心法从骨关节炎患者髌下脂肪垫外植体培养物中分离和表征小型细胞外囊泡的逐步实验方案，为后续的功能研究和转化研究提供了可重复的方法学框架。

方案

本研究使用骨关节炎患者的IPFP组织已获得河北医科大学第一医院伦理委员会批准（批准文号：[2024] 018）。样本收集在批准的有效期内进行，并在获取组织前取得所有参与者的书面知情同意。

1. 培养基与溶液的制备

1. 通过混合445 mL基础DMEM/F12培养基、50 mL无外泌体胎牛血清（10%）和5 mL青霉素/链霉素/两性霉素B（终浓度分别为100 U/mL、100 µg/mL和0.25 µg/mL），配制500 mL无外泌体完全DMEM/F12培养基。使用0.22 µm滤器过滤除菌。
2. 将950 mL蒸馏水（dH₂O）与50 mL 20x电泳缓冲液（Tris/MOPS/SDS）混合，配制Western blot电泳缓冲液。
3. 将800 mL dH₂O与100 mL 10x转移缓冲液和100 mL无水乙醇混合，配制Western blot转膜缓冲液。
   注：该快速转膜缓冲液专为室温下高电流湿转（400 mA）优化设计。由于产热较低，转膜时间少于45分钟时无需使用冰浴，且已证实可在10–250 kDa蛋白范围内保持高转膜效率。
   警告：无水乙醇易燃。应在通风良好的区域操作，并远离热源。
4. 将50 mL 20x TBS（含200 mM Tris和3 M NaCl，pH 7.5–7.6）、2 mL Tween-20与950 mL dH₂O混合，配制洗涤缓冲液。
5. 将发光增强液与过氧化物缓冲液等体积混合，配制化学发光工作液（每平方厘米膜约需0.1 mL工作液）。
   ​警告：化学发光底物可能引起刺激。操作时应佩戴手套和护目设备。化学废液应按照所在机构的本地规定进行处置。

2. IPFP 组织的制备及条件培养基的收集

1. 将新鲜获取的IPFP组织（约10 g）置于离心管中，每轮用50 mL预冷的PBS轻轻手动振荡洗涤，共洗涤三次，以彻底去除残留血液。
2. 使用无菌剪刀或手术刀将IPFP组织切成约2 mm × 2 mm × 2 mm大小的组织块。
3. 将IPFP组织块转移至T175培养瓶中，加入50 mL去外泌体的DMEM/F12完全培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育48 h，并轻轻振荡。
4. 将DMEM/F12完全培养基（即条件培养基）收集至50 mL离心管中，置于冰上，通过70 µm滤网过滤，以去除组织碎片。

3. 使用差速超速离心法分离sEVs

注意：所有以下步骤均需在 4 °C 或冰上进行。

1. 初步低速离心以去除组织碎片
   1. 将条件培养基在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。小心收集上清液，并转移至新的 50 mL 离心管中。
   2. 将上清液在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 10 分钟。收集上清液并转移至新管中，注意不要扰动沉淀。
2. 中间离心与过滤。
   1. 将上清液在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 30 分钟。
   2. 收集上清液，并通过 0.22 µm 真空滤器过滤，以去除较大的囊泡和污染物。
3. 第一次超速离心：sEV 沉淀。
   1. 将过滤后的上清液转移至 40 mL 聚碳酸酯离心管中。
   2. 使用固定角转子（k 因子 = 70），在 4 °C 下以 110,000 x g 超速离心 70 分钟。使用移液器小心吸除上清液。
   3. 用 10 mL 预冷的无菌 PBS 重悬沉淀。将重悬液通过 0.22 µm 注射器滤器过滤，以确保去除 任何残留的聚集体。
4. 第二次超速离心：sEV 纯化
   1. 再次使用固定角转子（k 因子 = 70），在 4 °C 下以 110,000 x g 对悬液进行 70 分钟超速离心。
   2. 小心弃去上清液，保留管底的 sEV 沉淀。将最终的 sEV 沉淀重悬于 200 µL 无菌 PBS 中。
   3. 将 sEV 悬液分装为 20 µL 每份，以避免反复冻融造成的损伤。将分装样品于 -80 °C 保存以长期使用。

4. 通过蛋白质印迹分析对sEV进行表征

1. 准备sEV蛋白样品。
   1. 将sEV沉淀（来自步骤3.5.2）与80–120 µL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液混合。
      注意：建议RIPA缓冲液体积与预估蛋白质量的比例约为每0.5–1.0 µg蛋白使用1 µL RIPA缓冲液。建议最终蛋白浓度至少达到1.0 µg/µL，以确保在Western blot分析中实现有效的电泳分离和高质量的信号检测。
      警告：RIPA缓冲液含有去垢剂和刺激性物质。请使用个人防护装备。
   2. 短暂涡旋混合，并将样品置于冰上孵育15–30分钟，同时轻轻摇动。
      注意： 此步骤中充分混匀对实现完全的膜破裂和最佳蛋白释放至关重要。涡旋不充分可能导致裂解不完全，并造成重复样本间蛋白浓度不一致。
   3. 在12,000–14,000 x g 条件下离心裂解物10–15分钟，小心收集上清液。
   4. 使用高灵敏度的双辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定sEV裂解物的总蛋白浓度。
      注意：由于高灵敏度BCA法的检测范围较低（0.5–20 µg/mL），能够准确量化从纯化的sEV制备物中通常获得的低蛋白浓度，因此推荐用于细胞外囊泡样品，优于标准BCA法。请按照试剂盒说明书进行操作。
2. Western Blot分析。
   1. 将蛋白样品与5 x SDS-PAGE上样缓冲液混合。
      注意：检测CD63时，应使用非还原型5x上样缓冲液（不含β-巯基乙醇），并在70 °C孵育10分钟。这些条件有助于保留构象表位，并防止该四跨膜蛋白发生热诱导聚集。对于其他标志物，包括ALIX（ALG-2相互作用蛋白X）、TSG101（肿瘤易感基因101）和Calnexin，应使用含10% β-巯基乙醇的还原型5x上样缓冲液，并在95 °C加热5分钟，以确保蛋白完全变性。
   2. 将制备好的样品（通常为20–40 µg总蛋白）上样至预制梯度胶（4%–12%）中。
   3. 根据制造商建议，将蛋白分子量标记物加入指定加样孔中。
   4. 在电泳缓冲液中以恒定电压100 V进行电泳。
   5. 继续电泳1–1.5小时，或直至上样染料迁移至凝胶底部。
      注意：电泳时间可能因电泳系统和凝胶浓度不同而有所差异。
   6. 使用湿转系统，在400 mA条件下将蛋白从凝胶转移至PVDF膜，持续30分钟。
      注意：转移时间可能因所用转膜缓冲液品牌不同而有所变化。
   7. 将膜置于含0.2% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBS-T）中，用无蛋白封闭缓冲液在室温下轻轻振荡封闭30分钟。该封闭缓冲液不含血清蛋白、生物素或磷酸化蛋白，以最大限度减少非特异性结合和背景干扰。
   8. 将膜与特异性一抗在无血清抗体稀释缓冲液（含基于蛋白的稳定剂和抗体保护添加剂）中稀释后，在4 °C轻轻振荡孵育过夜（12–16小时）。
   9. 在洗涤缓冲液（含0.2% Tween-20的TBST）中，于摇床上轻轻振荡洗涤膜。
   10. 在室温下，将膜与相应的二抗轻轻振荡孵育1小时。
   11. 再次在洗涤缓冲液中，于摇床上轻轻振荡洗涤膜。
   12. 使用化学发光底物显影蛋白条带。
       ​警告：化学发光底物可能对皮肤和眼睛造成刺激。请佩戴合适的手套和护目镜。根据机构危险废物处理指南处置底物。

5. 通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）对sEV进行表征

1. 根据制造商的说明打开纳米颗粒追踪分析仪和注射泵模块，并在测量前让系统平衡至少30分钟。
2. 将EV样品在冰上轻轻解冻，并用无菌、无颗粒的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释样品，使颗粒浓度达到推荐测量范围内的最佳值（约1 × 10⁸ 至 1 × 10⁹ 颗粒/mL）。
3. 将1 mL稀释后的样品装入无菌注射器中，并缓慢注入测量室，确保不引入气泡。
4. 调节相机亮度和焦距，以清晰观察到呈现布朗运动的单个颗粒。
5. 在恒定流动条件下，使用注射泵对每个样品记录三段时长为60秒的视频，以确保颗粒分布一致。
6. 使用NTA软件分析所记录的视频，检测阈值设为12，模糊尺寸设为自动，最大跳跃距离设为自动。
7. 利用软件的自动分析功能生成颗粒尺寸分布和浓度曲线。
8. 导出原始数据、颗粒尺寸分布图及浓度测量结果，用于进一步的统计分析。
9. 用无菌无颗粒水彻底清洗测量室，随后用70%乙醇冲洗，再用无菌无颗粒水冲洗一次，以防止样品间的交叉污染。

6. 通过透射电子显微镜（TEM）对小细胞外囊泡（sEVs）进行表征

1. 使用碳膜覆盖的200目铜网。如有条件，可使用辉光放电仪对铜网进行30秒的辉光放电处理。
2. 将10 µL sEV悬液（用无菌过滤的PBS重悬）滴加至铜网上，在室温下孵育2–5分钟。
3. 用滤纸轻轻接触铜网边缘，去除多余液体。
4. 将载样面依次置于三滴超纯水上，对铜网进行洗涤。
5. 向铜网上滴加10 µL 2%磷钨酸溶液（pH 7.0），在室温下孵育1–2分钟。
   注意：磷钨酸为腐蚀性酸性试剂，可能对皮肤、眼睛和呼吸道造成刺激。操作时应佩戴适当个人防护装备（包括手套和护目用具），并遵循机构安全规程进行操作。染色废液及污染材料应按照批准的危险化学品废弃物处理程序进行处置。
6. 用滤纸吸去多余染液，将铜网在室温下静置至少10分钟，使其完全自然干燥。
7. 使用透射电子显微镜在80 kV加速电压下观察铜网样品。
8. 在适当放大倍数下采集代表性图像，以评估囊泡形态。

结果

通过多模式表征证实了从小块人髌下脂肪垫（IPFP）组织中成功分离出小细胞外囊泡（sEVs）。

透射电子显微镜（TEM）显示，分离的囊泡呈现出典型的杯状形态，并具有清晰定义的脂质双层膜结构，符合小细胞外囊泡（sEVs）的结构特征（图1）¹¹。

图1： 小细胞外囊泡（sEVs）的透射电子显微镜（TEM）图像。 典型的透射电镜图...

讨论

本方案提供了一种可重复且实用的工作流程，用于通过组织块培养结合差速超速离心法从人髌下脂肪垫（IPFP）组织中分离小细胞外囊泡（sEVs）。通过多种互补的表征方法对分离的囊泡进行了验证，包括透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）以及对已确立的细胞外囊泡标志物的蛋白质印迹检测¹。TEM确认了具有典型形态的膜包被囊泡的存在，NTA显示其粒径分布符合sEV群体特征，蛋白质印迹分析证实了CD63、Alix和TSG101的存在，同时未检测到Calnexin，表明细胞内细胞器污染极少。这些结果共同证明了本方案在从IPFP组织中分离结构完整且分子特征明确的小细胞外囊泡方面的有效性与可靠性。

本方案的一个关键方法学特征是采用组织外植体培养而非酶消化法来收集细胞外囊泡（EV）。酶解离方法（如胶原酶消化）可能破坏细胞膜，并诱导EV相关表面蛋白发生人工蛋白水解切割，从而可能改变囊泡组成并引入非囊泡污染物¹³。相比之下，外植体培养可保持组织完整性，使活细胞在生理相关条件下分泌囊泡，所获得的EV群体更...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40 mL PET 离心管	himac（Eppendorf Himac Technologies）	5720411148	聚对苯二甲酸乙二醇酯，26 × 90 毫米
70 µm细胞筛	北京兰杰科技术	560049	用于组织碎片清除
抗Alix抗体	上海阿比源生物科技	CY7215	sEV阳性标志物
抗钙联蛋白抗体	上海阿比源生物科技	CY5839	阴性标志物（ER污染）
抗 CD63 抗体	Affinity Biosciences	DF2305	四跨膜蛋白标志物
抗TSG101抗体	上海阿比奥韦生物科技	CY5985	sEV阳性标志物
BCA 蛋白检测试剂盒	上海雅美生物科技	ZJ102	用于蛋白质定量
细胞培养瓶（T175）	NEST Biotechnology	560229	用于IPFP外植体培养
离心管（50 mL）	BIOFIL	560041	用于初始低速步骤
无外泌体胎牛血清	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	用于组织培养
HRP 标记的山羊抗兔 IgG	上海阿比源生物科技	AB0101	用于WB的二抗
即用型蛋白上样缓冲液（变性，还原，5×）×)	上海雅美生物科技	LT101	用于蛋白质变性
Micro BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23235	用于蛋白质定量
Millex-GP 滤器单元（0.22 µm） µm)	北京兰杰科技术	560360	无菌，用于囊泡过滤
纳米颗粒追踪分析仪	马尔文帕纳科	NanoSight NS300	用于大小和浓度分析
Omni-Flash 无冰快速转移缓冲液	上海雅美生物科技	PS201S	用于蛋白质印迹转膜
磷钨酸（2%）	Sigma-Aldrich	P4006	用于透射电镜负染色
蛋白上样缓冲液（变性，非还原，5×）×)	上海雅美生物科技	LT103	用于蛋白质变性
无蛋白快速封闭缓冲液（5×)	上海雅美生物科技	PS108	封闭膜
RIPA裂解缓冲液	北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司	R0010	用于sEV蛋白提取
TBS(20×)	北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司	T1080	用于配制洗涤缓冲液
透射电子显微镜	日立	HT7800	用于形态学表征
Tris/MOPS/SDS 电泳缓冲液	上海雅美生物科技	PS120	用于蛋白质分离
Tween-20	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	T8220	用于配制洗涤缓冲液
超速离心机	himac（Eppendorf Himac Technologies）	CP100NX	高速分离系统
超灵敏化学发光检测试剂盒	上海雅美生物科技	SQ201	用于蛋白质条带的可视化
通用抗体稀释缓冲液	上海雅美生物科技	PS119L	一抗/二抗