利用本土新热带稀树草原植物绿色合成镁纳米颗粒用于可扩展的纳米植物化妆品制剂

摘要

本研究描述了一种利用原产于南美热带稀树草原的Stryphnodendron adstringens植物提取物绿色合成镁纳米颗粒的实验方案，并进一步将其掺入化妆品精华液配方中进行评价。

摘要

本研究描述了一种利用新热带稀树草原特有植物Stryphnodendron adstringens的乙醇提取物进行镁基纳米颗粒绿色合成的实验方案，并将其应用于纳米植物化妆品制剂中的方法。该流程包括植物材料的采集与制备，随后进行乙醇提取，其中植物化学成分作为镁离子的还原剂和稳定剂发挥作用。在控制条件下，使用氯化镁和植物提取物合成纳米颗粒，实现无需有毒还原剂的环境友好型制备过程。采用动态光散射和原子力显微镜对纳米颗粒的性质进行表征，以评估其粒径分布、形貌及胶体行为。该方案进一步阐述了将所合成的纳米颗粒整合至化妆品精华液配方中的步骤。通过监测感官特性、pH值和黏度，在受控储存条件下评估制剂的稳定性。本方法为制备植物介导的镁基纳米颗粒及其在化妆品配方中的应用提供了一种可重复且可持续的技术路径。

引言

塞拉多植物地理区是南美洲面积最大的新热带稀树草原群落，也是全球生物多样性最丰富的热带稀树草原区域。该生态系统拥有数千种植物，富含类黄酮、多酚、萜类和酚酸等次生代谢产物，其中许多成分已被证实具有抗氧化、抗炎和光保护活性，受到化妆品和制药行业的广泛关注^1,2,3,4。这些植物化学物质被广泛用作功能性化妆品配方中的高价值活性成分。除了生物活性外，许多多酚和类黄酮分子中含有的羟基和羰基官能团使其能够在溶液中充当金属离子的天然还原剂和稳定剂^5,6。这一化学特性在绿色纳米技术中正被日益用于金属纳米颗粒的合成，为开发源自新热带生物多样性的可持续化妆品配方提供了极具前景 yet 尚未充分探索的机遇^2,3,4,5,6。

传统上，纳米颗粒（NPs）的制备主要采用自上而下的方法，即通过激光烧蚀或溅射等物理手段将块体材料分解为纳米级颗粒；以及自下而上的方法，即通过化学或生物途径由较小单元构建纳米颗粒⁷。尽管化学和物理方法具有较好的效果，但通常依赖有毒试剂、高能耗以及复杂的设备。这促使了绿色化学方法的兴起，该方法强调在纳米材料制备过程中实现可持续性、环境友好性和安全性⁶。

在此框架下，纳米颗粒的绿色合成已受到广泛关注。植物次生代谢产物能够同时充当还原剂、稳定剂和封端剂，从而高效合成金属及金属氧化物纳米颗粒；而传统方法则存在需要专用设备、极端条件并产生有毒废物等局限性，因此有必要开发一种在温和条件下进行、可规模化且不产生有害副产物的绿色合成方案^6,7,8,9。在通过该策略探索的金属氧化物纳米颗粒中，镁纳米颗粒（MgNPs）相较于银纳米颗粒（AgNPs）和氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）具有显著优势，因为MgNPs无生物累积倾向，在人体细胞中表现出较低的细胞毒性，并被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为对人体应用普遍安全的物质^10,11。此外，利用塞拉多（Cerrado）地区植物提取物合成的MgNPs有望将镁本身的抗氧化和抗菌特性与提取物中存在的生物活性植物化学成分相结合，从而提升其在化妆品功能方面的应用价值，优于传统方法合成的纳米颗粒¹⁰。

在化妆品行业中，纳米技术的应用通过增强活性成分的递送性、稳定性和功效，彻底改变了产品开发¹¹。纳米颗粒（NPs）能够更深入地渗透皮肤，实现可控释放，并保护敏感化合物免于降解，因此在针对皮肤老化、色素沉着、痤疮和防晒的配方中具有极高价值¹⁰。 尽管已有上述明确优势，但利用新热带稀树草原本土植物作为还原剂进行氧化镁纳米颗粒（MgNPs）的绿色合成，用于化妆品领域，仍基本处于未开发状态，且缺乏方法学上的标准化，这与亚洲、非洲和欧洲植物的相关研究广泛报道形成鲜明对比^11,12,13,14。现有大多数研究对将纳米颗粒整合至功能性化妆品配方中，以及其在受控储存条件下的稳定性关注有限^11,14,15。本实验方案通过整合一套单一且可重复的方法，填补了这一方法学空白，涵盖来自新热带植物区系的MgNPs的绿色合成、将其引入纳米植物源化妆品面部精华液，以及对其理化性质和功能稳定性的全面评估。

本实验方案的总体目标是描述一种标准化、可重复且可放大的绿色合成方法，利用原产于南美洲塞拉多热带草原的植物Stryphnodendron adstringens作为还原剂和稳定剂，制备氧化镁纳米颗粒（MgNPs），并将其应用于具有生物活性的面部精华配方中，从而充分利用该植物固有的生物活性特性。采用S. adstringens提取物合成的MgNPs用于人体外用制剂是一种新型纳米制剂，目前已被巴西专利申请（BR 10 2025 015416 1）所保护。该实验设计代表了一种可持续且生物相容性的纳米颗粒制备方法，避免了传统纳米颗粒合成中常用的有毒还原剂，同时有利于将具有潜在生物活性的植物化学成分整合到纳米体系中。本方案特别适用于寻求环境友好型纳米颗粒制备方法的研究人员，可用于化妆品、药物或生物医学领域，尤其是在可获得富含黄酮类和多酚类化合物的植物提取物的情况下。由于这些化合物可作为天然的还原剂和稳定剂，本方案可便捷地推广至其他具有相似植物化学成分谱的植物物种，从而可根据不同生物地理区域的本地植物资源可用性，应用于各地的本土植物群。

方案

1. 植物材料

1. 选择与记录
   1. 选择生长在自然环境中代表性区域的健康S. adstringens植株，用于采集树皮。记录采样地点、采集日期、使用GPS设备获取的地理坐标以及采集时的当地环境条件。
   2. 利用新热带稀树草原物种的专业分类学文献进行植物学鉴定。通过咨询合格的分类学家确认鉴定结果¹⁷。
   3. 采集并分离具有代表性的植物材料，用于标本馆存档，包括营养和繁殖结构（例如叶片、花朵、果实和小枝）。
      注意：用于实验操作的树皮应与用于标本馆存档的植物材料分别采集。采用标准标本馆技术对植物材料进行压制和干燥，制作凭证标本，并将其保存于公认的标本馆中，以确保可追溯性。
2. 树皮采集
   1. 在S. adstringens树木的BBCH（Biologische Bundesanstalt, Bundessortenamt, and Chemische Industrie）生长阶段31–39期间，从树干上采集树皮，该阶段对应于前期物候学研究中描述的营养生长期^16,17。
      注意：将采集的材料储存在避光袋中，以防止次生代谢物降解。
3. 水分测定
   1. 使用分析天平称量树皮样品。将样品分为三个重复组，并记录初始重量。
   2. 将树皮样品置于105 °C的烘箱中，干燥至恒重。
      注意：当连续两次称量结果差异不超过1 mg时，即达到恒重，表明水分已完全去除。
   3. 从烘箱中取出样品，冷却至室温后称量并记录最终重量。使用以下公式计算含水量和干物质含量：
      
      干物质 (%) = 100 - 含水量 (%)
      其中：
      W1 = 空容器重量
      W2 = 干燥前容器加样品重量
      W3 = 干燥后容器加样品重量

2. 提取物制备

注意：所有涉及危险材料的操作均按照国际公认的化学安全指南进行¹⁸。

1. 用流动水冲洗 freshly collected 的树皮，以去除土壤、灰尘和表面杂质。
2. 将树皮样品置于 36 °C 的烘箱中干燥 72 h，然后使用刀式研磨机将干燥的树皮研磨成细粉。
3. 称取 200 g 树皮粉末并转移至锥形瓶中，加入 1000 mL 98% 乙醇。
   注意：乙醇高度易燃，操作时应远离火源，并在通风良好的环境中进行。
4. 密封锥形瓶，在室温下避光放置 72 h，每隔 24 h 摇动混合物一次。
5. 使用漏斗先通过金属筛网过滤提取液，再用棉花过滤，以去除残留杂质。

3. 抗氧化活性的评估

1. 用甲醇配制100 mM的DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）溶液。
   注意：甲醇具有毒性且高度易燃。应在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备。 DPPH具有刺激性，吸入或摄入可能有害。避免直接接触和吸入。
   备注：为避免光照，实验应在低光照条件下进行；操作甲醇和DPPH时务必戴手套。
2. 用甲醇将乙醇提取的S. adstringens树皮提取物稀释至体积分数为0.1%至5%的系列浓度。同时配制相同浓度的维生素C溶液作为阳性对照。
3. 向96孔板的每个孔中加入100 µL DPPH溶液。
4. 向每孔中加入50 µL提取物溶液或维生素C溶液。
   备注：以DPPH + 甲醇作为空白对照，甲醇单独作为空白调零。所有测定均需设四个复孔。
5. 将96孔板在室温、避光条件下孵育30分钟。
6. 使用分光光度计在515 nm波长处测定吸光度。
7. 使用以下公式计算自由基清除活性：
   
   其中：
   ABS control = DPPH + 甲醇的吸光度
   ABS sample = DPPH + 提取物的吸光度

4. 细胞活力分析

1. 在添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养正常人真皮成纤维细胞（NHDF）。将细胞维持在37 °C、5% CO₂条件下。
2. 将细胞以每孔3 × 10⁴个细胞的密度接种至96孔板中，孵育24小时。
3. 更换培养基，每孔加入100 µL新鲜培养基，并添加50 µL提取液。继续孵育24小时。
4. 移除培养基，每孔加入10 µL MTT溶液。孵育4小时，使甲臜形成。
   注意： MTT试剂具有毒性，操作时应佩戴手套并使用适当的防护设备。避免接触皮肤和眼睛。
5. 每孔加入60 µL溶解液（异丙醇中的盐酸），以溶解结晶。
   注意： 盐酸具有腐蚀性，可导致严重灼伤。操作时应使用适当的防护设备，并在通风橱中进行。异丙醇易燃，应在通风良好区域远离点火源操作。
6. 使用分光光度计在540 nm处测定吸光度。
   备注： 细胞活力检测包括处理组和未处理对照组，每种条件均设置四个复孔进行分析。
7. 按以下公式计算细胞活力：
   细胞活力 (%) = (样品提取物吸光度 / 细胞对照吸光度) × 100
   其中：
   细胞对照吸光度 = 仅含细胞和培养基的未处理对照孔的吸光度。
   样品提取物吸光度 = 经植物提取物处理的细胞孔的吸光度。

5. 镁纳米颗粒的绿色合成

1. 向无菌反应管中加入 9890 µL 蒸馏水。
2. 加入 100 µL 植物提取物。
3. 加入 10 µL 1 M MgCl₂，以获得终浓度为 10 mM。
   注意：氯化镁可能引起刺激。操作时应使用适当的防护设备，避免接触眼睛和皮肤。
   备注：基础反应体系包含 1% (v/v) 提取物 + 10 mM MgCl₂，总体积为 10 mL。为优化纳米颗粒形成，可在保持总体积和 MgCl₂ 终浓度不变的前提下调整提取物浓度。
4. 充分混匀，使溶液均一。
5. 在 75 °C 下孵育 18 小时。
   注意：高温可能导致烫伤。处理加热样品时应使用适当的防护设备。
   备注：颜色变化可能表明纳米颗粒的形成。
6. 在表征前让混合物冷却至室温。

6. 纳米颗粒表征

1. 动态光散射（DLS）
   1. 将约 750 µL 的纳米颗粒悬浮液转移至测量池中。
   2. 将测量池放入仪器中，并在 25 °C 下进行测量。
   3. 使用适当的检测模式采集颗粒尺寸数据。
   4. 每个样品重复测量三次，每次测量包含五次子运行。
2. 原子力显微镜（AFM）
   1. 将 10 µL 纳米颗粒悬浮液滴加到新解理的云母表面。
   2. 将样品置于干燥器中干燥 2 小时。
   3. 用 20 µL 过滤的去离子水轻轻冲洗云母片三次。将样品重新放入干燥器中，在室温下再干燥 2 小时。
      注意：冲洗可去除过量盐分，提高成像质量。
   4. 根据仪器制造商的说明完成原子力显微镜的设置和激光对准。以 500 × 500 nm 的扫描范围采集纳米颗粒的表面图像。
      注意：原子力显微镜用于定性评估表面粗糙度，并观察从S. adstringens合成的 MgNPs 的形态特征，从而获得高分辨率的三维表面图像。

7. 纳米植物化妆品的配方制备

1. 加热阶段
   1. 分别称取29.7 g纯化水、0.50 g羟乙基纤维素（HEC）和3 g甘油至不同的容器中。
   2. 将水置于磁力搅拌器上，加热至70–75 °C，并轻轻搅拌。
   3. 在搅拌的同时，将HEC逐渐加入加热的水中，以避免结块。
      注：水合过程可能需要15–30分钟。
   4. 加入甘油，搅拌至均匀。
2. 降温阶段
   1. 在不同的烧杯中，分别称取30 g纯化水、3 g烟酰胺、33.3 g由S. adstringens合成的MgNPs、0.3 g低分子量透明质酸以及0.2 g苯甲醇和脱氢乙酸，用于制备降温阶段组分。
   2. 在室温下将烟酰胺完全溶解于水中。
   3. 加入透明质酸，搅拌至均匀。
   4. 加入S. adstringens MgNPs，并轻轻搅拌。
   5. 加入防腐剂并混合均匀。
3. 混合
   1. 将加热阶段的组分冷却至约40 °C。
   2. 在搅拌的同时，将降温阶段的组分缓慢加入加热阶段的组分中。
   3. 测定配方的pH值。对于含有烟酰胺的精华液配方，目标pH值应为5.0–6.5。
      注：烟酰胺在中性至微酸性pH条件下稳定。如有必要，可使用少量柠檬酸或氢氧化钠调节pH值。

8. 化妆品稳定性评估

1. 初步稳定性（12天）
   1. 将化妆品精华液制备四份重复样品，置于密封容器中。
   2. 对样品进行六次连续的冻融循环。每次将样品在50 °C下储存24小时，随后在−5 °C下储存24小时，每48小时完成一个完整循环。
   3. 每次循环后，通过目视检查配方的外观、颜色、气味及是否出现分相现象，记录其感官特性。
   4. 使用已校准的数字pH计在室温下测定四份样品的pH值。按照仪器制造商的操作说明，使用旋转黏度计测定黏度。
      注意：变化幅度≤10%属于可接受范围。超出此阈值的变化可能表明配方不稳定，需进一步研究。若配方通过初步试验，则进行加速稳定性试验。
2. 加速稳定性（90天）
   1. 制备八份化妆品配方样品。其中四份样品储存在50 °C，另四份储存在4 °C。
   2. 在第0、1、7、15、30、60和90天进行评估。
   3. 通过目视检查配方的外观、颜色、气味及是否出现分相现象，评估并记录其感官特性。
   4. 使用已校准的数字pH计在室温下测定样品的pH值。按照仪器制造商的操作说明，使用旋转黏度计测定黏度。
      注意：稳定性评估依据巴西卫生监管局（ANVISA）制定的指南¹⁹进行。在美国，稳定性测试遵循美国食品药品监督管理局（FDA）的建议²⁰。在欧盟，稳定性评估符合法规（EC）No 1223/2009²¹的要求，该法规规定必须包含化妆品产品安全报告（CPSR）。该法规附件I要求提供书面的稳定性数据，以支持化妆品配方的安全性和保质期，测试通常依据协调指南ISO/TR 18811:2018²²进行，"化妆品稳定性测试指南”。

结果

植物树皮的干燥过程对于保存其生物活性成分，并确保其在食品、制药和化妆品工业中的应用至关重要。相反，干燥不当可能导致过度变暗、香气丧失、微生物污染以及生物活性成分降解，从而影响原料树皮的质量。表1总结了用于区分干燥适当与干燥不当植物材料的标准。

综上所述，这些因素强调了充分干燥不仅是一种保存技术，更是维持富含酚类化合物植物的功能性和工业价值的关键因素，尤其是那些具有潜在化妆品应用价值的植物。适当的干燥可将水分含量降低至安全水平，防止微生物生长，并保持酚类化合物、单宁和黄酮类物质的完整性，而这些成分与抗氧化能力直接相关^23,24,25。对植物提取物抗氧化活性的评估有助于确定其生物学潜力及可能的工业应用。理想的提取物应呈现剂量依赖性反应以及较低的IC₅₀值，表明其在低浓度下即具有效果（图1A）。相反，某些提取物...

讨论

本文所述方案介绍了一种利用S. adstringens提取物绿色合成MgNPs并将其整合至纳米植物化妆品精华液配方中的可重复工作流程。多个步骤对于确保结果的可靠性至关重要。首先，植物材料的采集与记录必须进行严格标准化，包括准确记录地理坐标、环境条件及物候期，因为植物生理状态和次生代谢产物含量的差异会直接影响提取物的组成，从而影响纳米颗粒的还原效率与稳定性^16,17。

水分含量是一个基本参数，因为植物材料中水分过多会促进化合物的化学和微生物降解，影响所获得提取物的标准化和稳定性²³。因此，在加工过程中监测水分含量对于确保实验可重复性至关重要，因为植物材料的水分含量通常在60%至80%之间。此外，干燥条件需要严格控制，因为过高的温度可能导致热敏性次生代谢产物（尤其是挥发性成分）降解，从而影响提取物的组成及其生物活性^24,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Sigma-Aldrich	M0812	细胞检测
苯甲醇 &和二乙酰乙酸	Sigma-Aldrich	1,09,626	防腐剂
离心管（15 mL / 50 mL）	Falcon（康宁）	430766	样品处理
柠檬酸	Sigma-Aldrich	C0759	pH 调节
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	3110	CO2 用于细胞培养的培养箱
棉质滤材	本地供应商	LH R/260	过滤
干燥器	默克	BAF424002141	干燥
DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）	Sigma-Aldrich	D9132	抗氧化能力测定
干燥箱	NovaÉtica	400/5NDR	用于植物材料干燥的烘箱
简易烤箱	SolidSteel	SSE-85L	用于化妆品稳定性测试的烘箱
1000 mL 锥形瓶	VIDROLABOR	76200B01000	提取
乙醇（98%）	当代化学动力学	P.10.0051.015.36	提取溶剂
胎牛血清（FBS）	Gibco（Thermo Fisher）	ES-009-C	补充剂
冷冻机	Gelopar	GTPC-575	用于稳定性检测的冷冻机
甘油	植物学酒馆	TBV084.003904.086	保湿剂
透明质酸（低分子量）	植物学酒馆	J201220136	水合剂
盐酸（HCl）	Sigma-Aldrich	1,00,317	MTT溶解
羟乙基纤维素（HEC）	植物学酒馆	AH230641697	增稠剂
异丙醇	Sigma-Aldrich	100995	MTT溶解
刀式研磨仪	7LAB	920Willye 4×4片刀片	研磨叶片、根、种子和块茎
氯化镁（MgCl2)	Sigma-Aldrich	1,01,872	纳米颗粒合成
磁力搅拌器–加热板	IKA	5030000	混合
甲醇	Sigma-Aldrich	900641	DPPH 测定
云母片	赛默飞世尔科技	NC9655733	原子力显微镜样品制备
酶标仪	赛默飞世尔科技	Multiskan GO 1510-03581	酶标仪
MTT试剂	Sigma-Aldrich	CT01-5	细胞活力检测
NHDF 细胞	BCRJ	0089	人真皮成纤维细胞
烟酰胺	植物学酒馆	211847	活性成分
烘箱	赛默飞世尔科技	PR305225M	干燥
青霉素–链霉素	Gibco (Thermo Fisher)	15140122	抗生素
pH计	Digimed	DM-220	用于稳定性检测中pH值的监测
移液器和吸头	Eppendorf	30078551	液体处理
纯化水/蒸馏水	默克（Milli-Q）	ZIX7010T0C	常规使用
冰箱	Metalfrio	VB40W	用于稳定性试验的冰箱
旋转粘度计	诺沃测试	VISC-5SA	用于稳定性检测中黏度的测定
RPMI-1640 培养基	Gibco（Thermo Fisher）	11875093	细胞培养
比例尺	BEL 工程公司	HPBG-2285	称量材料用天平
扫描探针显微镜	SHIMADZU	SPM-9700HT	原子力显微镜，扫描探针显微镜
氢氧化钠（NaOH）	当代化学动力学	P.10.0594.024.00	pH 调节
分光光度计	ThermoFisher Scientific	A51119700C	吸光度
维生素C（抗坏血酸）	Sigma-Aldrich	PHR1008	阳性对照
Zetasizer Pro	马尔文帕纳科	Zetasizer Pro	动态光散射与泽塔粒径分析