通过基于荧光素酶的活性检测法评估镉对人类结直肠类器官毒性的标准化方案

摘要

本方案旨在建立人结直肠类器官，并评估基于荧光素酶的ATP生物发光法检测镉诱导毒性的可行性。通过定量分析类器官活力随剂量和时间的变化，评价该方法的可行性与灵敏度。

摘要

镉（Cd）被归类为1类致癌物，是全球严重的环境问题之一。本研究旨在建立一种人源结肠直肠类器官模型，并评估基于荧光素酶的ATP生物发光法检测结肠直肠类器官（COs）对镉暴露毒性反应的可行性与灵敏度。从人结肠直肠组织中分离干细胞，并在三维基底膜 基质中培养以生成类器官。类器官分别暴露于不同浓度梯度的镉溶液中，并设置不同的暴露时间。以等体积比加入发光型活力检测试剂，在室温下轻轻摇动以促进细胞裂解和试剂渗透，随后孵育以使生物发光反应进行。使用多功能微孔板检测仪在发光模式下记录发光信号。通过剂量-反应曲线拟合计算半数抑制浓度（IC50），并评估类器官活力或相对活力的变化。研究成功从人结肠直肠组织中分离出原代干细胞，并用于生成类器官。镉暴露导致类器官代谢活性呈剂量依赖性和时间依赖性下降；剂量-反应分析获得了类器官的存活曲线及IC50值。本研究为人源结肠直肠类器官在环境重金属毒理学研究中的应用提供了方法学指导和实践依据。

引言

镉是一种天然存在的重金属，被归类为1类致癌物，已成为全球性的环境问题¹。人类接触镉主要通过吸入和饮食摄入。尽管长期低剂量暴露与多种不良健康后果相关，但显著减少其使用和向环境释放仍然具有挑战性^2,3。传统的二维培养在平坦基质上生长，缺乏组织结构、细胞极性和肿瘤微环境，因此在模拟体内异质性以及对镉暴露的真实毒理学反应方面能力有限⁴。此类系统无法充分模拟细胞间相互作用、基质依赖性生长或药物耐药性发展的生物学过程⁵。源自患者组织的三维类器官系统相比传统二维细胞系提供了更具生理相关性的研究平台⁶。类器官保留了原始组织的基因组特征、组织学结构和功能状态，从而能够更准确地模拟肿瘤生长、演化过程以及对镉毒性的敏感性，在疾病建模和毒理学研究中具有明显优势⁷。结肠类器官（COs）具有复杂的三维结构、细胞异质性，以及内在的自我更新和自组织能力^8,9。将COs移植到受体小鼠体内可促进肠道干细胞的自我更新，并调节宿主免疫微环境，产生保护性效应⁴。2009年，Sato 等人首次证明单个Lgr5⁺成年肠道干细胞可自发地自组织并分化，形成包含所有肠道细胞谱系的隐窝-绒毛样结构¹⁰。

肠道上皮在镉（Cd）经口摄入后构成抵御其毒性的第一道防线。事实上，镉的口服生物利用度通常低于5%。镉诱导的肠道毒性表现为细胞间连接结构的破坏、旁细胞通透性增加以及炎症反应的激活。此外，镉会干扰肠道免疫功能，并改变肠道微生物群的组成与稳态¹¹。根据暴露剂量和持续时间的不同，镉可导致细胞周期调控紊乱，在某些情况下促进致癌表型，而在其他情况下则诱导细胞凋亡。镉可间接促进活性氧（ROS）的产生，引发氧化应激和氧化还原失衡。受体、激酶、磷酸酶、蛋白酶、黏附分子以及转录因子的功能可能通过氧化还原信号通路被调控。镉还可干扰多种细胞类型的信号级联反应，改变ERK1/2、JNK（c-Jun氨基末端激酶）和p38 MAPK（p38丝裂原活化蛋白激酶）的活化状态¹²。通过激活MAPK级联中的ERK1/2，镉可促进细胞增殖与存活，抑制程序性细胞死亡，并导致异常的过度增殖¹³。镉可直接或间接调控关键效应蛋白的表达与活性。例如，它下调肿瘤抑制因子p53，同时上调Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白，最终破坏细胞凋亡过程及细胞周期稳态¹⁴。

在用于评估镉（Cd）细胞毒性的类器官（CO）模型中，三磷酸腺苷（ATP）含量测定被广泛用于评估类器官的活力。ATP作为能量代谢的核心分子，能够直接反映类器官整体的代谢状态和存活情况。在类器官暴露于镉后，镉主要引起线粒体功能障碍，加剧氧化应激，并破坏类器官的能量稳态。这些事件共同导致ATP生成受损，最终降低类器官的活力。因此，ATP水平的变化可作为镉诱导细胞毒性的可靠功能性指标。传统的细胞毒性检测方法包括比色法MTT/CCK-8检测、活/死细胞染色以及基于流式细胞术的分析。与这些方法相比，基于ATP的检测在三维类器官系统中具有明显优势。由于类器官结构复杂且空间异质性显著，传统的染色和成像方法常受限于组织穿透不足和定量准确性降低。相比之下，ATP检测依赖于荧光素酶介导的生物发光反应，能够在不破坏类器官结构的前提下实现直接定量。ATP检测具有高灵敏度和宽动态范围，可检测从早期代谢抑制到类器官死亡的连续生物学反应，从而有助于在不同镉浓度下进行精确的剂量-反应分析。ATP水平能够全面反映类器官的整体功能状态，优于依赖形态学评估或单一分子标志物的方法。因此，该检测特别适用于高通量毒性筛选，具有更高的稳定性和可重复性。

利用ATP生物发光评估类器官对Cd暴露敏感性的核心原理在于，萤火虫荧光素酶在ATP、Mg²⁺和O₂存在条件下催化D-荧光素的氧化反应，生成氧化荧光素并释放光子。所发射光的强度在特定线性范围内与样品中可测得的ATP含量成正比。因此，发光强度可作为细胞代谢活性或存活能力的间接定量替代指标。类器官嵌于细胞外基质中，具有多层三维结构。为适应这一特点，ATP检测试剂包含经过优化的裂解缓冲液组成及操作流程。这些优化措施可增强对类器官内部细胞的破坏，促进ATP释放，并稳定生物发光信号¹⁵。需要强调的是，ATP生物发光反映的是代谢活性，而非精确的细胞数量。例如，线粒体抑制剂可在短时间内显著降低细胞内ATP水平，而细胞仍保持存活状态；相反，某些早期形式的细胞死亡可能暂时维持相对较高的ATP水平。

尽管结肠直肠类器官模型在镉（Cd）毒性评估中表现出更高的生理相关性，但仍存在若干实际局限性。与传统的二维（2D）细胞系相比，类器官培养更耗时且成本更高。此外，其依赖动物来源的基质会导致批次间的变异性，限制了其在大规模、高通量毒性筛选中的应用。虽然这些模型非常适合评估重金属对肠上皮的直接毒理学效应，但在评估系统性毒性或复杂的毒代动力学过程方面，尚无法完全替代体内模型。

本研究采用人结直肠组织作为源材料，用于分离结直肠干细胞并在体外建立类器官（COs）。将类器官暴露于不同浓度的镉（Cd）中，并设置不同的暴露时间。随后，使用多功能酶标仪在发光检测模式下测定发光信号。通过特定酶标仪的配套操作软件计算并可视化细胞活力或半数抑制浓度（IC50）值。

方案

本实验经苏州卫生职业技术学院伦理委员会批准（批准号：SWYXLL202516），并依照医学伦理标准进行。本研究所有受试者均签署了书面知情同意书。

1. 人结直肠组织的分离及类器官的建立

1. 组织样本的运输与保存
   1. 实验前，将基底膜基质在 4 °C 条件下缓慢解冻，并将所需培养基平衡至室温。
   2. 临床获取的人结直肠组织应立即放入预冷的组织保存液（2–8 °C）中。
      注意：确保运输过程中组织完全浸没于保存液中，并尽快将样本转移至实验室。
2. 在生物安全柜中，将组织置于 6 cm 培养皿中进行评估。使用手术刀和镊子小心去除可见的脂肪组织和肌层，保留上皮成分。
3. 将组织转移至含有 3 mL 磷酸盐缓冲盐水（PBS）并添加 300 µL 抗生素的 6 cm 培养皿中，将组织切成 2 mm × 5 mm 的碎片。
4. 将组织碎片转移至 50 mL 离心管中。
5. 向离心管中加入 10 mL 预冷的 PBS 和 200 µL 0.5 M EDTA（终浓度约 10 mM）。
6. 将离心管置于摇床上，在室温下以 0.072 g 轻柔振荡 15 分钟。
7. 用镊子将组织转移回培养皿，并在显微镜下观察。当隐窝结构变得可见或开始脱落时，进入下一步。
   注意：EDTA 处理后，若在显微镜下可见隐窝结构，通常表明消化程度已足够进行隐窝分离，此时隐窝开始从松散的上皮组织碎片中脱落。完整的隐窝通常保持清晰的腺状或管状形态，并具有明显的中央管腔；而过度消化则会产生大量解离的单个细胞和坏死碎片。
8. 当大量完整隐窝可见、组织碎片呈现疏松透明状态时，终止消化，此时轻柔吹打即可有效释放隐窝。
   注意：EDTA 孵育时间过长会破坏隐窝完整性，增加细胞碎片积累，并降低肠干细胞活力，从而减少后续类器官形成效率。
9. 加入 15 mL 含抗生素的 PBS 以终止 EDTA 消化作用，轻轻混匀。
10. 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 3 分钟。
11. 弃去上清液。
12. 加入 1 mL 完全培养基，将沉淀重悬后转移至 1.5 mL 微量离心管中。
13. 以 300 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。
14. 在 1.5 mL 微量离心管中加入 500 µL 基底膜基质，充分混匀。
15. 混合过程中尽量减少室温暴露，并将基底膜基质置于冰上，以防提前凝固。
16. 将 25 µL 混合液逐滴加入 24 孔板的每个孔中，形成液滴。
17. 将 24 孔板倒置，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 20 分钟。
18. 向每孔加入 600 µL CO 培养基。
19. 从商业来源获取结直肠类器官培养基和解离试剂，并严格按照生产商说明书使用。
20. 配制完全细胞培养基时，在 500 mL DMEM 基础培养基中加入 50 mL 胎牛血清（FBS）和 5 mL 青霉素-链霉素，通过轻柔颠倒充分混匀。

2. Cd处理下COs的敏感性检测

1. 在96孔板中接种和培养类器官
   1. 弃去每孔中的培养基，加入500 µL类器官解离液。轻轻吹打以分散基底膜基质。
   2. 将处理后的板放入37 °C、5% CO₂培养箱中进行消化，初始消化时间为10分钟。
   3. 将24孔板中每孔的消化液收集至15 mL离心管中，并加入10 mL完全细胞培养基。
   4. 以300 × g离心3分钟收集类器官，弃去上清液。
   5. 加入1 mL完全细胞培养基，通过吹打充分混匀，将悬液转移至1.5 mL微量离心管中。
   6. 以300 × g离心3分钟，然后弃去上清液。
   7. 加入100 µL基底膜基质，通过吹打充分混匀。
   8. 在显微镜下解离类器官并估算单细胞数量，随后每孔接种约3,000–5,000个单细胞。
   9. 保持所有实验组之间相对一致的接种密度，以确保类器官生长和实验结果的可重复性。
   10. 根据类器官解离后显微镜评估结果以及文献报道中常用的类器官培养条件，调整接种范围。
   11. 向96孔板每孔中心加入6 µL混合液。共使用30个孔，设三个技术重复。
   12. 将板倒置，在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育15分钟。
   13. 向96孔板每孔加入100 µL类器官培养基。
   14. 在接种后第7天开始镉处理。
       注：此7天培养期可使单细胞充分发育为结构完整的类器官。
2. 镉浓度稀释
   1. 将3.67 mg氯化镉粉末溶于2 mL无菌超纯水中，配制终体积为2 mL的10 mM储备液。
   2. 将2 mL 10 mM镉溶液通过0.22 µm滤器过滤灭菌。
   3. 将灭菌后的镉溶液分装至1.5 mL离心管中，避光保存于4 °C。
   4. 实验全程穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、防护手套和护目镜。
   5. 所有相关操作均应在化学通风橱内进行，以最大限度降低暴露风险。
   6. 将所有含镉废弃物（包括添加镉的培养基、移液枪头、离心管和培养皿）分类并作为危险化学品废物管理。
   7. 将这些材料丢弃至指定的重金属液体或固体废物收集容器中。
   8. 所有废弃物的处置必须严格遵守机构指南和当地环境法规。
   9. 切勿将镉废弃物作为普通实验室垃圾处理或倒入下水道。
   10. 将24孔板的盖子标记为4、3、2、1和0。
       注：对类器官施加的镉终浓度分别为40 µM、20 µM、10 µM、5 µM和0 µM。镉储备液的稀释计算采用标准公式： 
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. 为配制4 mL工作浓度为20 µM的溶液，将8 µL 10 mM储备液加入3992 µL完全培养基中。充分混匀以确保分布均匀。
   1. 向标记为4的孔中加入1.4 mL培养基，向其余各孔分别加入700 µL培养基。
   2. 从标记为4的孔中移除5.6 µL培养基，并加入5.6 µL镉溶液。充分混匀。
   3. 将标记为“4”的孔中的700 µL溶液转移至标记为“3”的孔中，并充分混匀。
   4. 依次将溶液从高编号孔向低编号孔转移并混匀（从“3”到“2”、从“2”到“1”、从“1”到“0”），每步均需充分混匀。
      注：标记为0的孔中不进行任何操作。
   5. 从培养箱中取出96孔板，弃去原有培养基。
   6. 将96孔板的盖子从左到右标记为40 µM、20 µM、10 µM、5 µM和0 µM。
   7. 向对应标记的每孔中加入100 µL含镉培养基。
   8. 将板放回培养箱中。

3. 加入发光型活力检测试剂

1. 从 −20 °C 冰箱中取出发光型活力检测试剂，室温下解冻。按 1:1 的体积比加入发光型活力检测试剂。
2. 向一次性试剂储液槽中加入 2.5 mL 发光型活力检测试剂。
3. 向一次性试剂储液槽中加入 2.5 mL 结直肠类器官培养基，通过移液充分混匀。
4. 使用废液抽吸系统将 96 孔板各孔中的类器官培养基移除。避免抽吸过程中将基底膜基质从孔中吸出。
5. 将一次性试剂储液槽中的 200 µL 溶液转移至含有结直肠类器官（COs）的 96 孔板各孔中，通过剧烈移液充分混匀。移液过程中避免产生气泡。
6. 将 96 孔板在室温下避光孵育 25 分钟。

4. 发光法活力检测试剂测量

1. 打开特定酶标仪的操作软件（补充图 1A）。
2. 点击“立即读取”（补充图 1B）。
3. 点击“新建”（补充图 1B）。
4. 点击“读取”（补充图 1C）。
5. 选择“发光检测”（补充图 1D）。
6. 选择“发光光纤”（补充图 1D）。
7. 点击“确定”（补充图 1D）。
8. 选择“整板读取”（补充图 1E）。
9. 点击“清除全部”（补充图 1F）。
10. 选择目标 96 孔板上对应的孔位，共 15 个孔（补充图 1G）。
11. 点击“确定”（补充图 1G）。
12. 将 96 孔板放入仪器中（补充图 1H）。
13. 选择“使用盖子”（补充图 1I）。
14. 点击“确定”以开始测量（补充图 1I）。
15. 测量完成后，点击“导出”以将数据导出至 Excel（补充图 1J）。

5. 数据处理与分析

1. 打开具备非线性回归分析功能的统计数据分析软件。（补充图 2A）。
2. 选择 XY 数据表（补充图 2A）。
3. 将 X 轴设置为数值型（补充图 2A）。
4. 将 Y 轴设置为在并列的子列中输入重复值，并输入 3 次重复数据（补充图 2A）。
5. 输入数据（补充图 2B）。
6. 点击分析（补充图 2C）。
7. 点击 XY 分析（补充图 2D）。
8. 点击非线性回归（曲线拟合）（补充图 2D）。
9. 点击确定以运行分析（补充图 2D）。
10. 选择剂量–反应–抑制模型（补充图 2E）。
11. 选择 log(抑制剂) 与标准化反应值的关系 – 可变斜率模型（补充图 2E）。
12. 点击确定以执行分析（补充图 2E）。
13. 点击文件（补充图 2F）。
14. 点击导出（补充图 2F）。
15. 点击确定（补充图 2G）。

结果

人结肠类器官的建立
我们成功地从组织样本中分离出结直肠隐窝结构，在低倍和高倍显微镜下均清晰观察到典型的隐窝形态。在体外培养过程中，分离的隐窝逐渐扩张，并表现出有序的形态成熟过程（图1A、B）。培养至第3天和第6天时，已形成结构完整的结直肠类器官，主要呈现球形或早期出芽样结构（图1C、D）。

类器官对镉暴露的敏感性
将类器官接种至96孔板中，继续培养5天，随后用浓度为0、5、10、20和40 µM的镉进行处理。暴露72小时后，采用基于ATP的发光检测法测定相对发光单位（RLU），并对数据进行分析和可视化。结果显示，随着镉浓度的增加，类器官的存活能力显著呈剂量依赖性下降（图2A）。暴露于10 µM、20 µM和40 µM镉的类器官表现出明显的RLU值降低（

讨论

本研究建立了一种利用类器官（COs）进行镉暴露及ATP活力检测的标准化实验流程，用于评估镉对类器官存活能力的影响。该流程重点优化了类器官的解离及96孔板接种步骤，以提高实验的可重复性以及后续ATP检测结果的稳定性。尽管当前实验方案主要聚焦于建立用于镉毒性评估的三维结直肠癌类器官模型，但大量研究表明，传统二维细胞培养与三维类器官模型在药物反应、细胞间相互作用、组织结构及毒理学特征方面存在显著差异。与二维单层培养相比，类器官能更真实地模拟体内组织的空间结构、细胞异质性及 肿瘤的体内类似微环境，具有更高的生理相关性。由于缺乏复杂的细胞间及细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用，二维培养在重金属暴露下的反应可能无法准确反映真实的体内毒理学过程¹⁶相反，本研究建立的类器官（CO）模型能够有效模拟肿瘤组织的三维生长动态，为评估镉诱导的毒性提供了高度符合生理相关性的平台。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 μm 细胞筛	BIOLOGIX	15-1100
15 mL 离心管	BIOFIL	CFT011150
1 mL 移液器吸头	浙江百迪生物科技有限公司	H808633
200 μL 移液器吸头	浙江百迪生物科技有限公司	H808214
24 孔板	Corning Incorporated	3524
50 mL 离心管	CLUXCELL	321050
96 孔板	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	特定微孔板读板仪的操作软件。
氯化镉，10 g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D 发光细胞活力检测试剂盒	Vazyme	DD1102-01/02/03	以 1:1 体积比使用的发光型活力检测试剂。
人结肠类器官培养试剂盒 Plus（扩增）	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基	thermo fisher	6125552
镊子	Beyotime	FS019
冰盒	Beyotime	FBX078
低温高速离心机	安徽中科中佳科学仪器有限公司	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	基底膜基质
类器官解离溶液	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	类器官解离溶液
青霉素-链霉素	Beyotime	C0222
磷酸盐缓冲液（1×PBS）	杭州富德生物技术有限公司	FD7032
移液器	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		特定微孔板读板仪的操作软件。
剪刀	Beyotime	FS001
组织消化溶液	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S