源自自组装间充质干细胞聚集体的细胞外囊泡的分离及其治疗应用

摘要

本方案详细介绍了从自组装干细胞聚集体中高效分离大细胞外囊泡（LEVs）及其在下颌骨再生治疗中的应用。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是细胞间通讯的重要媒介，也是再生医学中极具前景的无细胞治疗剂。在EV的不同亚群中，大细胞外囊泡（LEVs）因其富含促再生内容物，特别适用于组织修复。然而，目前仍缺乏标准化且可重复的方法来制备功能性的牙源性干细胞来源LEVs，以用于后续的表征分析和治疗评估。本研究利用根尖乳头干细胞（SCAPs）卓越的成骨潜能，建立了一种在低黏附条件下进行三维培养的模型，以诱导SCAPs自组装形成细胞聚集体。该模型模拟了生理性间充质细胞凝聚过程，显著增强了细胞间的相互作用，并促进LEVs的分泌。文中提供了关键的培养参数和操作注意事项，以提高聚集体的一致性并最大化LEVs产量，同时维持细胞活力。本文介绍了一种标准化的高效制备功能性SCAPs来源LEVs的实验方案，涵盖三维聚集体的生成、通过差速离心法分离LEVs、基于纳米颗粒追踪分析（NTA）的粒径分布与浓度检测，以及利用热交联水凝胶实现LEVs递送以修复下颌骨缺损。该方法简化了LEVs的制备流程，便于开展后续机制研究及颅颌面再生领域的临床前评估。这一优化的工作流程可确保生物活性LEVs的可重复制备，获得稳定产量并富集促成骨内容物，有助于基础研究的推进，并加快EV介导的颅颌面重建技术向临床转化的步伐。在代表性应用中，负载LEVs的水凝胶可在缺损部位形成局部储存库，并在植入过程中提供便捷的操作性。总体而言，该方法提供了一个可扩展的平台用于制备SCAPs来源LEVs，同时强调了标准化报告和转化研究设计中的关键考量因素，支持该技术在颅颌面EV研究实验室中的广泛采用。

引言

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的膜结合纳米颗粒，通过转运蛋白质、miRNA和脂质等生物活性物质介导细胞间通讯^1,2,3。在EV亚群中，大细胞外囊泡（LEVs）因其直接从细胞膜释放并天然富集促再生分子，特别适用于组织修复与再生需求^4,5。在再生医学领域，来源于间充质干细胞（MSCs）的EVs正日益被视为一种可行的无细胞治疗替代方案，可替代整体细胞治疗^6,7,8。它们能够重现亲本MSCs的旁分泌再生效应，同时避免直接细胞移植所存在的局限性，如植入效率低、免疫原性及批次间差异等问题^7,8,9,10。在多种MSC来源中，牙根尖乳头干细胞（SCAPs）表现出更强的成骨和成牙本质分化潜能^11,12,13，使得SCAP来源的EVs在口腔颌面部骨组织及牙体组织修复中具有突出的应用前景⁸。

值得注意的是，细胞外囊泡（EVs）的生物发生及其功能受到细胞微环境的深刻影响^14,15。传统的二维（2D）单层培养体系与天然组织环境存在显著差异^16,17，常导致所获得的EVs再生能力受损¹⁸。相比之下，三维（3D）自组装的间充质干细胞（MSC）聚集体能够模拟生理性间充质细胞凝聚的关键特征；这一发育阶段以高细胞密度、密切的细胞–细胞接触以及丰富的细胞外基质（ECM）为特点，ECM不仅提供结构支持，还传递生化和力学信号，调控细胞黏附、迁移及命运决定^19,20,21。这种仿生的3D微环境不仅能增强细胞间通讯和旁分泌信号传导^22,23，还可促进分泌出产量更高、生物活性分子组成更优的EVs^24,25,26。因此，利用3D自组装MSC聚集体已成为获取具有强效功能EVs用于再生医学应用的一种极具前景的策略¹⁸。

尽管源自聚集体的细胞外囊泡（EV）具有明显优势，但目前仍缺乏从三维（3D）系统中分离和表征这些囊泡的标准化方案。现有的EV分离方法（如差速离心法）已较为成熟，可为EV的大规模生产提供可扩展的框架²⁷。同样，间充质干细胞（MSC）聚集体的制备方法已有报道，通常依赖维生素C诱导二维培养细胞发生卷曲和聚集²⁸。然而，这些由维生素C诱导形成的聚集体内部的细胞外基质（ECM）结构可能仍不同于天然间充质组织中空间有序、类似凝聚的微环境。相比之下，在低黏附条件下不依赖支架的自组装方式可促进形成致密的球形聚集体，更接近间充质凝聚的关键特征^19,29。目前，尚缺乏一套系统且可重复的流程，用于从此类低黏附诱导的3D SCAP聚集体中分离和应用EV。从实际应用角度看，传统二维SCAP培养产生的LEVs通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测得的产量通常约为~10¹¹ 粒子/mL，而3D低黏附聚集体预计可使LEVs产量提高数倍，同时保持下游应用所需的可重复性。为填补这一空白，本文详细描述了一种综合性方案，该方案充分利用SCAP固有的成骨/成牙潜能，并通过3D低黏附聚集体优化MSC的微环境。本方案可稳定地产出高质量的LEVs，为推进颅面医学中的无细胞再生治疗提供一种标准化工具。

方案

所有动物实验均经第四军医大学动物护理与使用委员会批准，并遵循ARRIVE指南进行。人源样本的采集和使用均经第四军医大学伦理委员会批准（批准编号：IRB-REV-2022187）。在样本采集前，已从所有供体获得书面知情同意；对于未成年或无法自行提供同意的供体，已从其法定监护人处获得书面知情同意。所有试剂均经过无菌过滤，细胞培养操作均在生物安全柜中进行以维持无菌状态（参见材料表）。所有人源材料（牙齿、组织、原代细胞、条件培养基及EV制备物）均应视为具有潜在感染性。涉及人源样本的所有操作均须在经认证的生物安全柜中进行，并穿戴适当个人防护装备（PPE），包括实验服、手套和眼部防护装置。在生物安全与废物处理方面，应遵循机构规定的BSL-2级指南：所有人源材料及被污染的一次性物品均按BSL-2级生物危害废物处理；使用机构批准的消毒剂在操作后对表面和设备进行去污。液体生物危害废物应收集于贴有标签的容器中，并在处置前采用批准的方法进行灭活。锐器应立即丢弃至经批准的锐器容器中（禁止回套）。动物组织/尸体以及麻醉剂/化学残留物应作为受监管的生物危害/化学废物，依照相关法规通过机构服务进行处置。

1. 人SCAPs的分离与培养

注意：P/S 是一种生物活性抗生素混合物，可能引起皮肤/眼睛刺激或过敏反应。开启时应在 BSL-2 生物安全柜中操作；佩戴手套和眼部防护装备；避免产生气溶胶；并按照机构的化学废弃物处理指南处置废弃物。I 型胶原酶（溶液）是一种生物活性酶，可能引起皮肤/眼睛刺激或过敏反应。应在 BSL-2 生物安全柜中操作；佩戴手套和眼部防护装备；移液过程中避免溅洒和气溶胶产生；并根据机构规程及时清除泄漏物。I 型胶原酶在储存和使用期间应避光保存（见 的 材料表).

1. 从健康供体（16–21岁）处收集牙根尖孔未发育完全的第三磨牙，并用含1%青霉素/链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲液（PBS）彻底冲洗（参见材料表）。
2. 使用无菌眼科镊子和剪刀从牙根尖处分离牙乳头组织，然后将其剪碎成小片段（<1 mm³）。
3. 将所有组织片段转移至15 mL离心管中，加入2 mg/mL I型胶原酶，在37 °C下消化1小时，每15分钟轻轻振荡一次。
4. 加入等体积的完全α-最低必需培养基（α-MEM）终止消化（参见材料表）。
   注意：I型胶原酶的消化时间并非固定，需根据组织消化情况调整。应密切观察，当组织呈现半腐蚀状态时即加入培养基终止消化。过度消化可能影响细胞活力。
5. 将细胞悬液在4 °C下以100 × g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于2 mL完全α-MEM中。
6. 将消化后的组织悬液接种至10 cm培养皿中，并加入8 mL完全α-MEM，使每皿终体积为10 mL。
7. 将SCAPs在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。
   注意：需持续观察培养情况，细胞通常在3–7天内从组织片段中迁移出来，并以放射状附着于培养皿表面。若组织活力较差或5天内未见细胞迁移，可更换为添加20%血清的完全α-MEM。
8. 细胞传代时，当细胞融合度达到80–90%时，用5 mL PBS洗涤一次以去除残留培养基。随后在37 °C下用2 mL 0.25%胰蛋白酶-1 mM EDTA孵育2分钟（参见材料表）。
   注意：胰蛋白酶–EDTA具有刺激性，可能损伤皮肤和眼睛。操作时应佩戴手套和护目镜，避免飞溅和气溶胶产生；若发生接触，应立即用大量清水冲洗。含胰蛋白酶的液体废弃物应按照机构规定进行处理。
9. 在显微镜下观察到细胞变圆且细胞间连接断裂时，轻柔吹打使细胞从培养皿上脱离，避免造成过度结构损伤。加入4 mL完全α-MEM以中和胰蛋白酶活性。
10. 通过轻柔反复吹打将细胞收集至新的15 mL离心管中。在100 × g下离心5分钟后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于完全α-MEM中。将重悬细胞接种至新的培养皿或孔板中，每两天更换一次培养基。
    注意：用于聚集体培养的SCAPs应控制在第5代以内。随着传代次数增加，细胞干性及聚集能力会下降^30,31，可能导致聚集体形成效率和功能表现降低。

2. SCAP 聚集体的自组装

1. 通过胰酶消化收集第3至第5代SCAPs，以100 × g 离心5分钟，然后重悬于补充有10% 去除外泌体的胎牛血清（FBS）和1% 青霉素-链霉素（P/S）的α-MEM培养基中（见材料表）。
   注意：通过在4 °C下以150,000 × g 超速离心FBS过夜，去除其中的外泌体及其他杂质，从而制备去除外泌体的FBS³²。
2. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种至超低吸附24孔板中。将每孔培养基体积调整为500 μL，以维持细胞的悬浮状态。
3. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下培养72小时，并每48小时更换一次培养基。
4. 每日在倒置光学显微镜下观察细胞聚集体的形成情况。当聚集体直径达到200–400 μm，并呈现致密、边缘光滑的结构时，收集外泌体。
   注意：将一个生产“批次”定义为从同一代次、同一天接种并在相同培养条件下于单一收集窗口（72小时）内收集的SCAP聚集体条件培养基混合液中分离得到的LEVs。每个批次应独立进行离心处理。接种后48小时更换培养基，并补充等体积的新鲜培养基。对于LEVs的生产，分别在接种后48小时和72小时收集条件培养基，将收集到的培养基（0–48小时和48–72小时两个时间段）混合为一个批次。将混合后的条件培养基保存于4 °C，并尽快用于LEVs的分离处理。

3. 从SCAP聚集体中分离和表征EVs

1. 差速离心法分离大型LEVs
   1. 将含有SCAP聚集体的培养基收集至15 mL离心管中。
   2. 在4 °C条件下以800 × g离心10分钟，去除完整的聚集体和较大的细胞碎片。
   3. 将上清液转移至新的15 mL离心管中，在4 °C条件下以2,500 × g离心15分钟，以去除残留的血小板和较小的细胞碎片。
   4. 小心地将上清液转移至无菌的1.5 mL锥形管中，在4 °C条件下以16,800 × g离心30分钟，沉淀LEVs。
      注：使用1.5 mL锥形管可提高LEVs的得率。
   5. 弃去上清液，将沉淀用1 mL无菌PBS重悬，并使用固定角转子（与标准台式离心机兼容）在4 °C条件下以16,800 × g再次离心30分钟，以沉淀LEVs。
   6. 将减速/刹车设置为"慢速"或"低档"（通常为刹车等级1或2），以防止在最终减速阶段重新悬浮LEVs沉淀。
   7. 弃去上清液，将最终的LEVs沉淀重悬于50 μL无菌PBS中。立即使用（24小时内）或在4 °C保存。避免冷冻以减少生物活性的损失。
      注：建议准备约80孔聚集体以获得足够量的LEVs用于典型的下游实验。推荐对LEVs样本进行即时表征或治疗应用，而非长期储存。如需较长时间储存，应将LEVs悬液分装（例如每管5–10 μL），以避免反复的温度波动和冻融循环。将分装样品在干冰上速冻，并于−80 °C短期延长保存（例如最多1–3个月）。在冰上解冻一次后立即使用。需注意冷冻可能降低生物活性，并可能改变颗粒回收率/粒径分布；因此，尽可能使用新鲜制备的LEVs进行功能研究。储存后进行质量控制时，应使用NTA重新测定颗粒浓度和粒径分布，仅当数值仍处于预设的可接受范围内时方可继续使用。 此外，在本方案中，采用NTA颗粒浓度作为主要定量方法，以避免基于蛋白的检测方法（如BCA法）可能导致的囊泡损失，从而最大化下游应用的产量。
2. NTA测定颗粒大小与浓度
   注：使用市售的纳米颗粒追踪分析仪（见材料表）进行NTA，以评估粒径分布和颗粒浓度。
   1. 取1 μL LEVs悬液（来自第3.1节第6步），加入无菌1.5 mL锥形管中，用1,499 μL无菌PBS稀释并充分混匀。
   2. 启动配套软件，用10 mL超纯水填充样品池。确认背景颗粒计数<每帧10个，以确保系统清洁（见材料表）。
   3. 使用预先配制的标准溶液校准仪器。将软件参数设置为：灵敏度70，快门70，最小面积5，最小亮度20。执行"自动对齐"以确保激光聚焦。调整标准品稀释度，使软件显示的颗粒计数在50–400之间（理想约为200），然后运行校准程序。
      注：通过将1 μL校准微球重悬于1 mL蒸馏水中制备原液；再取100 μL原液加入25 mL蒸馏水中（1:250,000稀释）制成工作液，4 °C保存最多1周。
   4. 分析前用5 mL蒸馏水冲洗样品池。
   5. 用1 mL蒸馏水冲洗通道，并确认检测界面上的颗粒计数<10。
   6. 使用无菌1 mL注射器以0.5 mL/s的恒定速度注入1 mL稀释后的LEVs样品。
      注意：手动控制注射器以保持稳定的注入速度。
   7. 进行颗粒分析并生成报告。在软件中创建新测量任务，选择“粒径/浓度”模式。设置采集参数为：3次记录，每次60秒，温度25 °C，检测参数与第3步相同（灵敏度70，快门70，最小面积5，最小亮度20）。
   8. 开始采集，并确认屏幕上每帧颗粒数保持在50–400之间（理想约为200）；若超出此范围，应停止并调整样品稀释度，然后重复第6步。采集完成后运行分析，获得平均粒径、众数粒径、D10/D50/D90及颗粒浓度（颗粒/mL）。导出结果及粒径分布图，格式为.csv和.pdf（或等效报告格式），并保存测量文件以备记录。

4. LEVs 在下颌骨再生中的治疗应用

1. LEV负载水凝胶的制备
   1. 制备Pluronic F-127储备液（20% w/v）。将Pluronic F-127粉末加入无菌PBS中，终浓度为20%（w/v），在4 °C下搅拌过夜，直至完全溶解并形成均一溶液（参见材料表）。在整个制备过程中将溶液保持在4 °C，以防止提前发生凝胶化。
      注意：20%（w/v）Pluronic F-127在4 °C时呈液态，在约20–25 °C（取决于试管或室温）时发生热致凝胶化；在37 °C时形成稳定凝胶。
   2. 在低温条件下加载LEV。将离心管、移液器吸头和水凝胶预冷至4 °C。通过轻柔吹打和短暂低速涡旋，将50 µg LEV（相当于来自两块24孔板细胞聚集体的LEV）与1 mL 20% Pluronic F-127混合，以确保均匀分布。混合物在植入前需保持在冰上或4 °C环境中。
   3. 操作/使用指导（确保可重复性）。在冰上快速完成LEV的加载及注射器/吸头的装填。若混合物温度升至约20–25 °C以上，黏度将增加并可能开始凝胶化；此时应将其放回4 °C，直至材料重新恢复流动性后再使用。植入缺损部位后，使其在体内温度（37 °C）下原位发生凝胶化。
2. 小鼠下颌骨缺损模型的建立
   1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对8周龄C57Bl/6小鼠（雄性或雌性）进行麻醉（参见材料表）。
      注意：戊巴比妥钠是一种强效镇静/麻醉剂，若意外注射、摄入或吸入，对人体具有毒性。配制和给药时应采用安全的锐器操作规范（不得回套针帽；立即丢弃至锐器盒），佩戴手套和眼部防护装备，避免皮肤接触，并按照机构对管制药品的储存和记录要求进行管理。通过检查角膜反射消失以及足垫夹捏时无肢体回缩反应，确认小鼠已充分麻醉。涂抹保护性眼膏以防止角膜干燥。
   2. 剃除左侧下颌区域的毛发，并交替使用10%聚维酮碘和75%乙醇进行消毒。
      注意：75%乙醇高度易燃，应远离点火源使用，并确保通风良好。聚维酮碘可能引起皮肤/眼部刺激或过敏反应；操作时应佩戴手套，避免接触眼睛和黏膜，及时清理溢出物。
   3. 沿下颌边缘做一条长约1 cm的纵向切口，钝性分离软组织以暴露下颌角。
   4. 使用牙科钻头在持续生理盐水冲洗条件下制备直径为2 mm的圆形骨缺损（参见材料表）。
      注意：密切监测术中出血情况，使用小棉球控制出血以维持清晰的手术视野，并降低感染风险。避免钻头接触周围软组织，以防缠绕。
3. LEV负载水凝胶的植入
   1. 将LEV-水凝胶混合物装入无菌注射器中，并注入骨缺损区域，确保完全填充。
      注意：每只小鼠给予约10 μg LEV。为完成n = 5只小鼠的实验，需准备两块24孔板的SCAP聚集体以获得足够的LEV。
   2. 对照组小鼠注射等体积不含LEV的Pluronic F-127水凝胶。
   3. 使用4-0可吸收缝线缝合切口，并皮下注射镇痛药（卡洛芬，5 mg/kg）以缓解术后疼痛（参见材料表）。
      注意：卡洛芬是一种具有药理活性的非甾体抗炎药（NSAID），若意外注射或接触皮肤/眼睛可能有害。操作时应佩戴手套，防止锐器损伤，将针头和注射器丢弃至锐器盒，并按照机构的药物废弃物处理程序处置未使用的药品和受污染材料。
   4. 将小鼠置于复温毯上直至从麻醉中恢复，随后转移至单独笼具，自由摄食饮水。
      注意：在小鼠恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。仅在完全恢复后方可将其重新放入群体饲养环境。

结果

根据实验流程，成功完成了包括SCAP分离、聚集体形成、LEVs提取及治疗性移植在内的关键步骤（图1). 供体的临床阻生第三磨牙显示出未发育完全的根尖，并在开放的根管口周围附着完整的根尖乳头组织，证实了SCAP的适宜来源图2A）。当培养时 体外，纺锤形SCAPs细胞具有丰富的细胞突起，从根尖乳头组织迁移出来，在3天内逐渐融合，形成特征性的涡旋状排列（图2B）。流式细胞术证实SCAP表型为CD90阳性、CD45阴性（图3A）。自我更新能力通过CFU形成和EdU掺入实验予以验证（图3B）。通过茜素红S染色和油红O染色证实了多向分化潜能（图3C）。免疫荧光染色显示间充质标志物阳性（Nestin）、上皮标志物阴性（CK14）的表达特征（

讨论

人们对无细胞再生疗法的兴趣日益增长，使得间充质干细胞来源的微型细胞外囊泡（LEVs）成为全细胞移植的一种颇具前景的替代方案，因其能够递送生物活性分子，同时避免细胞治疗相关风险。然而，由于缺乏能够充分维持并增强LEVs功能的生理相关性培养系统，LEVs疗法的临床转化受到阻碍。传统的二维单层培养体系与支持间充质干细胞功能的天然微环境存在显著差异。 体内，导致具有有限再生潜能的LEVs^18,24为解决这一局限性，我们开发了一种基于自组装3D SCAP聚集体的实验方案，建立了一种标准化且可扩增的操作流程，不仅提高了LEV的产量，还增强了其在临床环境中的功能相关性。

本研究介绍了一种高效的无支架培养系统，该系统通过SCAPs的低黏附聚集，重现了干细胞微环境的关键生理特性。与表现出异常细胞间通讯和旁分泌信号的二维培养，或引入外源性人工产物的依赖支架的聚集方法不同，三维自组装SCAP细胞聚集体能够高度模拟高细胞密度、富含细胞外基质的微环境，有利于间充质干细胞（M...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 带针注射器	BD	300841	麻醉
10 cm 细胞培养皿	Corning	353003	细胞培养
15 mL 聚苯乙烯离心管	Corning	352095	细胞培养
75% 乙醇消毒剂	Hai Shi Hai Nuo	HS-750	手术操作
可吸收缝线 4-0	Jinhuan Medical	R413	手术操作
台式离心机	WIGGENS	CE187	EV 分离
CO₂ 培养箱，150 L，通用型	ThermoFisher	51032874	细胞培养
I 型胶原酶	ThermoFisher	17100017	细胞培养
棉球	Deroyal	30-033	手术操作
弯头手术剪	JZ Surgical Instrument	J21040	手术操作
牙科手机涡轮机	KaVo	S609C	手术操作
电子天平	Zhi Ke	ZK-DST	细胞培养
Eppendorf 管	Eppendorf	3810X	EV 分离
精细镊子	JZ Surgical Instrument	JD1020	手术操作
脱毛膏	Veet	1.00097E+11	手术操作
高速球钻	Dentsply Sirona	E0123	手术操作
高速手机	KaVo	KV-1-008-1644	手术操作
倒置显微镜	Mshot	MF53-N	细胞培养
MEM α（最低必需培养基 α）	ThermoFisher	12561056	细胞培养
纳米颗粒追踪视频显微镜 PMX-120	Particle Metrix	ZetaView PMX120	纳米颗粒追踪分析
青霉素-链霉素（P/S）	ThermoFisher	15140122	细胞培养
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	57-33-0	麻醉
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher	10010023	细胞培养
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	EV 植入
聚维酮碘溶液	Baxter	PROSL500	手术操作
特级胎牛血清（FBS）	ThermoFisher	12664025	细胞培养
无菌纱布块	Winning	10-000-681	手术操作
台式高速微量离心机	Hitachi	CT15E	EV 分离
环钻	Biomet Microfixation	01-9182	手术操作
胰蛋白酶-EDTA	ThermoFisher	25200072	细胞培养
超低吸附 24 孔板	Corning	3473	细胞培养
涡旋混合器 Genie	Scientific Industries	SI0425	EV 植入