解码表观转录组：乳腺癌中 m6A 调控网络的in silico 研究洞察

摘要

本方案介绍了一种通过整合突变谱、拷贝数变异、基因表达和临床结果，利用癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达 （GTEx）项目以及微阵列平台公开可用数据集，对m6A修饰调控因子进行in silico遗传学、分子学及预后分析的方法。

摘要

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物转录本中最丰富的内部RNA修饰，其在RNA代谢、基因表达和细胞稳态中发挥关键作用。m6A调控因子（包括“书写蛋白”、“擦除蛋白”和“阅读蛋白”）的失调在癌症生物学中的作用日益受到关注；然而，它们在乳腺癌中的全面功能仍有待阐明。本方法学文章的主要目标是为生物信息学初学者提供一个逐步框架，以利用公开可用的癌症数据集进行突变分析、评估基因表达变化，并探究其与患者生存之间的关联。作为案例研究，本文使用癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达（GTEx）项目以及微阵列平台的数据，分析了乳腺癌中的m6A调控因子。通过对转录组谱的系统分析，展示了评估m6A调控组分在乳腺癌中预后相关性的操作流程。利用该分析框架，识别出关键m6A调控因子之间不同的遗传改变模式和差异表达特征。多个调控因子（包括METTL14、CBLL1、YTHDC1、HNRNPC、HNRNPA2B1和RBMX）与较好的患者生存相关，而YWHAG则与较差的总生存率相关。本研究提供了乳腺癌中m6A调控基因的系统基因组学综合概览，同时展示了一种实用且可重复的基于网络的生物信息学分析流程。这些发现加深了对乳腺癌表观转录组调控机制的理解，并为开发新型基于m6A的诊断和治疗策略奠定了基础。

引言

表观转录组修饰代表了转录后基因调控的重要层次，参与多种细胞过程和疾病状态。在迄今已鉴定的170多种RNA修饰中，N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中最普遍且研究最深入的一种¹。m6A由包括METTL3/METTL14在内的“书写器”复合物催化形成，由FTO和ALKBH5等“擦除器”去除，并由YTH和IGF2BP家族成员等“阅读器”蛋白识别。m6A协调调控RNA的剪接、稳定性、转运和翻译，从而影响发育、分化和应激反应等关键生物学过程^2,3。

在多种恶性肿瘤中均已报道m6A调控组分的异常改变⁴。在许多癌症中，异常的m6A活性可驱动恶性表型；例如，METTL3表达升高通过调控hedgehog通路及MYC RNA的甲基化，促进前列腺癌的发生与进展^5,6。FTO最初被发现参与急性髓系白血病中的致癌作用，后续研究证实其在肝癌、肺癌及结直肠癌中亦可促进肿瘤进展^7,8,9,10。然而，研究也发现FTO和ALKBH5具有依赖于细胞环境的功能，揭示了m6A介导调控的双重性，即可同时促进致癌信号和肿瘤抑制信号^11,12,13,14。m6A识别蛋白，包括YTHDF1/2/3、 异质性细胞核核糖核蛋白 （hnRNPs）以及胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BP1-3），也被发现与肿瘤发生相关^15,16,17。

在乳腺癌中，越来越多的证据表明，m6A 调控因子经常出现失调，并可能与肿瘤亚型、免疫相关特征及临床结局相关^18,19。多项机制研究表明，METTL3 在乳腺癌中常被上调，是一种促癌因子。METTL3 介导的 m6A 修饰可稳定或增强促进细胞增殖、上皮-间质转化（EMT）、转移和化疗耐药的转录本的翻译²⁰。已有研究显示，METTL3 还可通过靶向 Bcl-2 促进乳腺癌进展²¹。ALKBH5 被发现可通过 NANOG 及其他干性相关分子调控癌症干性程序，但其作用可能因肿瘤微环境不同而有所差异²²。

近年来，随着m6A调控因子的名单不断扩大，有必要更新这些新发现的调控因子在乳腺癌中可能发生的异常调控情况。表1列出了包括m6A修饰的“书写者”（writers）、“阅读者”（readers）和“擦除者”（erasers）在内的m6A调控因子。此外，一些新型m6A调控因子（如LRPPRC和YWHAG）已被鉴定，并被发现与癌症进展相关^23,24,25。因此，本研究利用适合生物信息学背景有限的研究人员使用的分析工具，对乳腺癌中所有已知m6A调控因子进行了系统的遗传和分子特征分析。

本方法学文章的目的是提供一个基于平台的逐步生物信息学操作流程，用于利用公开的癌症基因组资源分析乳腺癌中的m6A调控因子。通过使用来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）（www.cancer.gov/tcga）、基因型-组织表达（Genotype Tissue Expression, GTEx）项目²⁶以及cBioPortal和UCSC Xena等基于网络的分析平台的数据集，本方案展示了可重复的工作流程，用于评估突变谱、基因表达改变及其与患者生存之间的关联。这种可视化且易于获取的方法旨在帮助刚进入癌症生物信息学领域的研究人员更便捷地采用表观转录组学数据分析技术。

方案

注意：编码 m6A 甲基化调控因子的基因列表（分为书写蛋白、阅读蛋白和擦除蛋白）见表1。所列所有基因均被纳入后续的突变分析、表达模式分析和总生存期分析中。本研究使用的所有软件和工具均列于材料表中。

1. m6A 调控因子中遗传改变的鉴定

1. 访问用于癌症基因组学的 cBioPortal。前往 cBioPortal 网站（www.cbioportal.org）^27,28。从首页选择“查询”选项卡，以开始新的分析。
2. 选择合适的癌症研究项目和队列。
3. 在“选择用于可视化和分析的研究”搜索栏中，输入“乳腺浸润性癌”，然后选择“乳腺浸润性癌（TCGA，泛癌图谱）”。
4. 在页面底部，选择“按基因查询”。
   关键步骤：确保所选队列（996 个样本）包含突变和拷贝数变异（CNA）数据。
5. 定义基因查询。在“输入基因”框中，输入正在研究的全部 m6A 调控因子的 HUGO 基因符号。
   注释：基因可作为以空格分隔的列表输入。在“选择基因组谱型”下，确保选中以下两种数据类型：突变和拷贝数变异。
6. 在“选择患者/病例集”下，选择与包含所有谱型病例的队列相对应的默认样本集。
7. 点击蓝色的“提交查询”按钮。
8. 获取并解读基因改变数据。提交后，结果将在“摘要”选项卡中加载。“OncoPrint”中心可视化图可提供该队列中所有被查询基因的基因改变情况的直观概览，且可下载该图。
9. 在 OncoPrint 旁边，找到“癌症类型摘要”图表。该图提供了乳腺癌各亚型中基因改变的定量分布情况。
10. 进行泛癌分析。返回 cBioPortal 首页，在“查询”选项卡下选择“TCGA 泛癌图谱研究”。
11. 在基因输入框中，输入相同的 m6A 调控因子基因列表。
12. 点击“提交查询”，在结果页面中切换到“癌症类型摘要”选项卡。该图提供泛癌视角的分析结果。

2. 使用 UCSC Xena 对 m6A 调控因子进行比较转录组学分析。

1. 访问 UCSC Xena 平台。前往 UCSC Xena 网站（https://xena.ucsc.edu）²⁹.
2. 从主页点击“Launch Xena”按钮，进入主分析浏览器。
3. 在 Xena 浏览器中，点击“数据集”.
4. 在数据集当中，选择“TCGA TARGET GTEx”。该数据集包含来自TCGA和GTEx项目正常组织的经过统一处理的RNA-Seq数据。
5. 在下一页，点击“可视化”.
6. 定义表型（样本组）变量。在“选择您的第一个变量”，选择“主要类别”在表型数据类型中。
7. 点击 "TO 第二个变量”。然后，在基因组数据类型中，勾选“基因表达”在数据集中。将基因列表添加到“添加基因或位置” 框。点击“完成”.
8. 通过热图可视化表达模式。
9. 为了从TCGA TARGET GTEx中分离出乳腺（TCGA+GTEx）样本，输入“乳腺”并使用过滤选项保留样本。
10. 热图现已可见，并可下载为 PDF 文件。
11. 为单个基因生成比较箱线图。为了量化和可视化特定基因的表达差异，使用“以图表形式查看使用此选项，数据可以箱线图、点图和小提琴图的形式展示，比较两个样本组之间的表达分布情况。
12. 使用“下载为 PDF” 选项以下载图表。
13. 统计学显著性（p 值）可通过点击“统计学”.

使用 Kaplan-Meier Plotter 评估 m6A 调控因子的预后意义。

1. 访问Kaplan-Meier Plotter工具。前往Kaplan-Meier Plotter网站（https://kmplot.com/analysis）³⁰。
2. 在首页上，选择“breast cancer”选项卡，以启动针对乳腺癌数据集的分析。
3. 配置单个基因的查询。
4. 在主要输入区域中，找到“Gene symbol”输入框。
5. 输入待分析的m6A调控基因的官方符号（例如，METTL3）。
   关键步骤：在基因输入框正下方，找到并勾选“Only JetSet best probe set”复选框。此操作可确保系统自动为该基因选择最可靠且特异的微阵列探针，从而优化数据质量 和可重复性。
6. 设定生存分析参数。在“Survival”部分，选择“Overall survival (OS)”作为本分析的主要终点。选择此设置后，工具将自动使用来自1880例乳腺癌患者的数据。
7. 确保“Split patients by”选项设置为“median”。此设置将根据所查询基因在所有样本中的中位表达值，将患者均分为高表达组和低表达组。
8. “Follow-up threshold” 可用于选择随访时间。本研究中选择180个月。
9. 生成并解读Kaplan-Meier曲线图。
10. 点击“Draw Kaplan-Meier Plot”按钮。
11. 新窗口将加载并显示生存曲线。
12. 解读曲线图的关键要素：X轴表示时间（单位为月），Y轴表示总体生存概率，两条不同颜色的曲线分别代表高表达（红色）和低表达（黑色）患者组的生存曲线。图中显示的log-rank P值表示两条生存曲线之间差异的统计学显著性。

结果

乳腺癌中m6a甲基化调控因子的突变图谱

在一项关于TCGA数据集基因组分析的早期研究中，报道了多个编码DNA甲基化调控因子的基因存在反复突变³¹。在本研究中，利用cBioPortal分析了“乳腺浸润性癌（TCGA，泛癌图谱）”数据集，以考察编码m6A RNA甲基化“书写者”、“阅读者”和“擦除者”的基因的突变谱。该分析揭示了乳腺癌患者中存在多种基因遗传改变，不同基因的改变频率差异显著——从CNBP和RBM15B的0.4%到VIRMA的12%不等（图1A）。基因扩增是最常见的改变类型，其他事件还包括深度缺失、碱基替换以及多种并发改变。值得注意的是，在476例患者（占队列的48%）中检测到调控m6A相关功能的基因发生改变（图1B），凸显了m6A修饰动态在乳腺癌中的重要意义。尽管不同类型改变的发生频率有所不同，但这些突变在乳腺癌的所有分子亚型中均有发现（

讨论

本方法文章提供了一套全面、易用且整合的工作流程，用于系统性地开展多组学分析及癌症研究中任意基因特征的临床转化，本文以乳腺癌中m6A RNA甲基化调控因子的分析为例进行了演示。通过整合多个主要的公共生物信息学平台，该方法使研究人员能够高效地从基因组发现推进到具有临床意义的假设，而无需具备高级的计算专业知识。

该方法的主要优势在于其模块化且具有假设生成能力的分析流程。本方案引导用户按照逻辑顺序逐步操作：首先确定哪些基因发生了遗传改变（使用cBioPortal），然后在经过批次校正的环境中评估基因表达失调情况（使用UCSC Xena），最后评估这种表达失调对患者生存的临床影响（使用Kaplan-Meier Plotter）。这一从DNA到RNA再到临床结局的逐步分析过程，能够有效优先筛选出值得进一步研究的候选基因。例如，将此工作流程应用于m6A调控因子时，可高效地识别出如YWHAG（高频变异，且预示不良生存预后）等作为功能验证的高优先级靶基因。

该方案设计用于泛癌分析，进一步提升了其应用价值，使研究人员能够快速确定某一分子特征是特定...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
cBioPortal	纪念斯隆-凯特琳癌症中心	https://www.cbioportal.org
基因型-组织表达数据库（GTEx）	GTEx 联合组织	https://gtexportal.org
Kaplan-Meier Plotter	Gyorffy 实验室 / A5 Genetics 公司	https://kmplot.com
癌症基因组图谱（TCGA）	美国国家癌症研究所（NCI）	https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena 浏览器	加州大学圣克鲁兹分校	https://xenabrowser.net