使用24孔板的中通量柱法DNA提取

摘要

本方案介绍了一种经济高效、可加速质粒DNA提取的方法。通过使用与标准摆动桶式板转子兼容的定制3D打印支架，研究人员可同时处理多达48个带盖离心柱或多达116个无盖离心柱，与手动微型离心法相比，显著缩短了操作时间。

摘要

硅胶膜离心柱提取法是高质量DNA纯化的标准方法，但该方法劳动强度大，且手动操作难以扩展到小批量以上规模。现有的自动化液体处理机器人对中小型实验室而言通常仍过于昂贵。本文介绍了一种简化的半自动化方法，使用专门设计的、可适配标准离心板转子的3D打印支架。

该建议的系统可同时处理多达116个标准商用离心柱。支架设计采用"嵌套"结构，可在单次离心步骤中同时实现裂解液澄清（通过过滤柱）和DNA结合（通过硅胶柱）。此外，该设计包含共用的废液储槽，从而在洗涤步骤中无需单独丢弃各个管中的流穿液。

该方法获得的DNA产量和纯度与标准手动方案相当，但对于超过24个样本的批量处理，总处理时间减少了约50–70%（由120–180分钟缩短至60–90分钟）。无论处理样本数量多少，裂解液过滤、洗涤及废液弃置等步骤所需的总时间均减少了5–10分钟。这种开源硬件方案弥合了手动小量提取与昂贵自动化系统之间的差距。

引言

1979年，Vogelstein和Gillespie首次阐明了利用二氧化硅基质分离核酸的方法，确立了在高浓度变性盐（特别是碘化钠）存在下，将DNA片段吸附到玻璃粉上的基本原理¹。这一突破性进展为当时主流的有毒酚-氯仿抽提法以及费时费力的氯化铯梯度超速离心法提供了更安全、更高效的替代方案。随后，Boom及其合作者通过引入硫氰酸胍（GuSCN）作为主要的变性剂，对该方法进行了重大优化²。这一创新至关重要，因为GuSCN不仅能作为强效的蛋白质变性剂裂解细胞，同时还能有效抑制RNase和DNase的活性，从而在初始提取阶段保护核酸的完整性。

自问世以来，这种固相萃取技术——通常被称为 "Boom 法”——已历经广泛优化。该技术已被改进用于从日益复杂的生物基质中分离核酸，范围涵盖细菌质粒³ 和基因组 DNA⁴，到真核生物线粒体⁵ 以及高分子量基因组 DNA。此外，该技术已扩展应用于临床和法医学领域，包括从血浆中分离无细胞循环 DNA⁶，提取富含多酚且难以处理的植物 DNA 和 RNA⁷，以及纯化病毒核酸⁸。目前也有多种基于离心柱的商业化试剂盒可供使用。

该过程背后的物理化学机制依赖于变性离子对水结构的破坏。在高离子强度和低pH条件下，包围在核酸磷酸骨架和二氧化硅表面周围的水合层被去除（脱水）。这促进了阳离子桥的形成——通常由Na⁺或变性阳离子介导——连接二氧化硅表面带负电的硅醇基团与核酸的磷酸基团。通过精确调控缓冲液的化学组成，可实现对核酸类型（DNA与RNA）及片段长度的选择性。例如，特定的盐浓度和pH值可优先促进长片段基因组链而非短寡核苷酸的结合，或区分RNA与DNA。此外，现代版本的该技术通常采用修饰的二氧化硅表面，以增强特定核酸种类的差异吸附等温线。

基于二氧化硅的核酸纯化标准流程包括四个明确的阶段：（1） 裂解，即生物起始材料被均质化，细胞结构被破坏，通常使用碱性条件或去污剂（如SDS/Triton）；（2） 澄清，即去除细胞碎片、沉淀的蛋白质和多糖，以防止柱子堵塞；（3） 结合，即将上清液用变性盐和乙醇调节，以促进核酸吸附到二氧化硅膜上；以及（4） 洗涤，即用含酒精的缓冲液冲洗膜上结合的核酸，去除残留的盐分和抑制物，最后在低离子强度缓冲液中洗脱核酸。

尽管该过程的化学原理十分可靠，但对中等通量工作流程（24–100个样本）而言，单个离心柱的手动操作仍是显著的瓶颈，介于手工操作与昂贵的自动化液体处理系统之间形成了一项技术空白。目前简化基于离心柱的核酸提取的手动操作方法包括使用真空 manifold 装置以及用于自动化纯化的机器人工作站^9,10,11,12。

真空抽滤装置通常有两种配置：一种是配备20–24个鲁尔接头适配器的随机访问式装置，用于离心柱；另一种是专为96孔板设计的装置。与离心法相比，适用于20–24个样品的真空抽滤装置可加快DNA纯化过程中的柱洗涤步骤，因为它无需将离心柱从转子中取出。尽管该方法较为便捷，但仍可能发生交叉污染，原因是离心柱的排液尖端会接触真空抽滤装置的鲁尔接口。如果某个离心柱中的DNA进入鲁尔接口，则在后续使用该装置时可能被转移至另一个样品离心柱中。为防止污染，制造商建议使用额外的配件^10,13；然而，这些配件会增加提取装置组装的复杂性，因此常被省略。

专为96孔板设计的真空装置具有不同的结构，其并非用于微量离心柱，而是用于配套的96孔DNA提取板，此类板的孔中含有硅胶膜。在此情况下，DNA提取需使用预包装的96孔板DNA纯化试剂盒¹⁴。这类试剂盒具有高通量优势，但适用性有限，因为处理少于96个样本通常不切实际。

用于核酸提取的自动化机器人工作站无疑是DNA纯化的最便捷方法，因其几乎无需人工干预，从而节省研究人员的时间，并最大限度地减少污染等随机因素。然而，大多数提取工作站缺乏通用性，只能与专用试剂盒配套使用。这些工作站主要应用于诊断实验室，但对于大多数中小型学术实验室而言，其成本效益较低。

因此，在实验室实践中，尚缺乏能够在1小时之内处理12至96个样本的中通量DNA提取方法。本文介绍一种24孔板架，使用带盖离心柱时可手动分离最多48个样本，使用无盖离心柱时最多可处理116个样本。该方法需配备带有摆动提篮式板转子的离心机和固定角度的微量离心机作为辅助设备。本文以质粒DNA纯化流程为例，展示24孔板架的应用，因为质粒DNA提取包含去除裂解细胞碎片的澄清步骤，使得该过程难以实现自动化。然而，这些板架几乎可用于任何基于离心柱的核酸提取方法。

方案

1. 3D打印设备的准备

1. 使用喷嘴直径为 0.4 mm 的熔融沉积成型 3D 打印机打印支架。采用通用的 PLA、PETG 或 ABS 耗材，填充率为 100%。将层高设置为 0.1 mm，并启用表面平滑功能。调整打印参数，以确保支架具有防水性和机械稳定性。
   注意：支架组件的 STL 文件见于补充文件 1。请按照指定参数打印储液槽底座。使用前通过填充 70% 乙醇并依次离心不同时间（1、2、5、10 和 30 分钟）测试储液槽，确认无泄漏或结构损坏。
2. 将储液槽底座各部件粘合，形成密封单元。

2. 细菌培养与裂解

1. 将 E. coli 转化子接种至 3–5 mL 含适当抗生素的 LB 培养基中，于 37 °C 摇床培养过夜（12–16 小时）。
2. 以 2,000 × g 离心 10 分钟收集细胞，弃去上清液。
   注意：细胞沉淀可在处理前于 −20 °C 保存。
3. 向沉淀中加入 250 µL 重悬缓冲液（Buffer P1 加 RNase A），通过涡旋或移液彻底重悬。
4. 加入 250 µL 裂解缓冲液（Buffer P2），通过轻轻翻转管体 4–6 次混匀。
   注意：避免剧烈混匀，以防基因组 DNA 断裂。
5. 加入 350 µL 中和缓冲液（Buffer N3），立即通过翻转充分混匀。
   注意：应形成白色沉淀，表明中和成功。

3. 过滤装置的组装

1. 将DNA结合柱放入支架的柱层中。
2. 将柱盖置于指定插槽中，以在离心过程中固定。
3. 将澄清/过滤柱直接放置在结合柱上方的过滤柱层中。
   注意：若无过滤柱，可将裂解液在微量离心管中离心，然后将上清液转移至结合柱中。

4. 裂解液澄清与DNA结合

1. 将步骤 2.5 中中和后的裂解液转移至过滤柱中。
2. 将组装好的支架放入摆桶式转子板中。
   注意：请使用质量相等、结构相同的配重支架，确保正确平衡。
3. 在室温下以 2,000 × g 离心 1 分钟。
4. 从离心机中取出支架。
5. 移除并弃去滤柱层。

5. 清洗

1. 将储液槽中的流穿液弃入废液容器中。重新组装带有结合柱的支架。
2. 使用多通道移液器向每个结合柱中加入 500–700 µL 洗涤缓冲液。
3. 在 2,000 × g 条件下离心 1 分钟。
4. 弃去储液槽中的流穿液。
5. 重复洗涤步骤：向每个结合柱中加入洗涤缓冲液，并在 2,000 × g 条件下离心 1 分钟。
   注意：洗涤后的结合柱可在室温或 4 °C 下保存。

6. 干燥与洗脱

1. 从支架上取下结合柱，并转移至 2 mL 收集管中。
2. 在 >10,000 × g 条件下离心 1 分钟，以干燥膜。
3. 将柱转移至洁净的 1.5 mL 离心管中。
4. 直接向膜上加入 50 µL 洗脱缓冲液或水，在室温下孵育 1 分钟。
5. 在 >10,000 × g 条件下离心 1 分钟，以洗脱 DNA。

7. 可选：二氧化钛共沉淀

1. 按 2:1 的体积与质量比将裂解缓冲液与二氧化钛粉末混合。
2. 向裂解液中加入 250 µL 二氧化钛悬浮液，通过倒置混匀。
3. 加入 350 µL 中和缓冲液，并充分混匀。
4. 在 2,000 × g 条件下离心 1 分钟。
5. 收集上清液，注意不要扰动沉淀。
6. 将上清液转移至结合柱中。

结果

离心管架的型号差异
我们开发了四种不同版本的管架，适用于多种离心机型号，可充分利用不同实验室环境中的现有资源，并满足用户的个性化偏好。所有管架均采用24孔格式，但根据不同版本，额外设有用于放置层析柱的孔位。详细尺寸和兼容性信息见补充文件2。组装完成的管架高清图像见补充图S1。

基础支架版本（图1）是最高效的配置，由四个部件组成，尺寸为 88 × 130 × 77 mm。使用带盖柱时可同时容纳最多 48 个柱，使用无盖柱时可容纳最多 116 个柱。支架组件设计便于操作，并可最大限度减少离心过程中的不良影响。离心柱插入柱层中，柱层设有用于插入盖子的凹槽，这些凹槽同样可容纳无盖柱。柱层置于储液层之上。柱的排液口位于储液层切口上方，有助于减少相邻柱之间的液体飞溅。液体通过切口底部的开口流入储液层。储液层容量约为 100 mL，可容纳高载量柱的两次洗涤步骤。在需要时，可将滤膜柱层放置在柱层上方，使滤膜柱位于结合柱上方并与之接触。盖子密封含有滤膜柱或结合柱的层，以限制离心机旋转过程中的气流。基础支架版本适用于 A-2-DWP 桶式转子（例如 Eppendorf 5804）、转子 1770（例如 HETTICH Rotina 380）或同等系统。

微型支架版本（图2）适用于多种离心机吊篮转子。该支架由三个部分组成，最小尺寸为82.5 × 128 × 58 mm（含滤柱层）。它可容纳最多48个带盖滤柱或最多90个无盖滤柱。此版本的几何结构与基础支架相似，但去除了外侧的滤柱孔位，并替换为用于放置滤柱盖的凹槽。储液槽容量因打印版本不同而异。最小的储液槽（20 mL）可为约30个滤柱提供一次洗涤步骤所需的液体；更大的储液槽可实现更高的通量。滤柱层具有圆角边缘，以便在较小的离心机中实现吊篮的顺利移动。微型支架版本兼容UC-124吊篮转子（例如Accumax iFuge UC02）或同等系统。当不使用滤柱层时，该支架兼容A-2-MTP吊篮转子（例如Eppendorf 5430）或其等效系统。

无储液槽（无盖）版本（图3）适用于3D打印经验有限的用户，因为储液槽由外部容器（如移液器吸头盒）替代。该版本由三个部件组成，尺寸为79 × 115 × 61.5 mm。可容纳最多48列带盖离心柱或最多78列无盖离心柱。其几何结构与先前版本相似，但未集成储液槽，而是使用合适的容器收集废液。柱层和滤膜层的定位孔位较少，滤膜层包含锥形座以避免与转子运动发生干涉。底座设计可适配标准容器，并可通过侧向间隔件进行固定。兼容性取决于所选容器，但包括A-2-DWP吊篮转子（例如Eppendorf 5804）、转子1770（例如HETTICH Rotina 380）以及UC-124吊篮转子（例如Accumax iFuge UC02）。

盖架版本（图4）是最简单的配置，可与5 mL或10 mL的24孔深孔板配合使用。它由单一组件构成，尺寸为73 × 109 × 4 mm，支持最多48列的使用。该版本适用于任何支持相应板型的离心机转子。

产量与纯度
采用标准手动微量离心法和基于支架的方法对 E. coli 培养物进行DNA提取。分光光度分析显示，使用支架提取的DNA质量与标准方法获得的结果相当。两种方法的A260/A280比值通常介于1.8至1.9之间。总质粒产量（µg）在传统方法与使用支架配置的提取方法之间无显著差异（图5）；原始数据见补充文件2。质粒构象也得以保持，松弛型、线性化和超螺旋形式的分布相似（图6）。

交叉污染分析
为评估潜在的交叉污染，进行了棋盘式实验。各列交替加载高浓度溴化乙锭溶液（模拟高滴度DNA）和水。在2,000 × g 条件下离心后，染料分布局限于加载列正下方的废液区域，在相邻孔或邻近柱尖端未检测到可见信号（图7）。这些结果表明，在测试条件下，该支架设计可降低溅出和柱间转移的可能性。

为了进一步评估污染情况，使用扩增子作为污染源进行了实时 PCR 检测（见补充文件 2）。仅在添加了扩增子的柱子洗脱液中检测到扩增信号（图 8）。在测试条件下，未检测到交叉污染；然而，实际表现可能因实验流程和样本类型的不同而有所差异。

图1： 支架组装示意图的基本版本。 爆炸式CAD视图显示了（A）盖帽，（B）滤柱层，（C）柱固定层，以及（D）底部储液层。该支架由四个部件组成，尺寸为88 × 130 × 77 mm，可同时使用最多48个带盖帽的柱，或最多116个不带盖帽的柱。请点击此处查看此图的放大版本。

图2： 支架组件简图的微型版本。 爆炸式CAD视图显示了（A）滤柱层、（B）柱固定层和（C）底部储液层。该版本在几何结构上与基础版本相似，但两侧的柱位被移除，并替换为用于柱帽的凹槽。该装置由三个部件组成，最小尺寸为82.5 × 128 × 58 mm（含滤柱层），可容纳最多48个带帽柱或最多90个无帽柱。请点击此处查看此图的放大版本。

图3： 无储液槽（无盖）型支架组件示意图。 爆炸式CAD视图显示了（A）滤柱层、（B）柱固定层、（C）底座以及（D）移液枪头盒。该版本用外部容器（如移液枪头盒）替代了集成式储液槽，由三个部件组成，尺寸为79 × 115 × 61.5 mm，可容纳最多48个带盖滤柱或最多78个无盖滤柱。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4： 24孔板架的盖式版本。 顶视图（左）和底视图（右）。这是最简单的板架版本，可与5 mL或10 mL的24孔深孔板配合使用。该板架由单个部件构成，尺寸为73 × 109 × 4 mm，支持最多48列的使用，可带盖或不带盖。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5： DNA 产量与纯度的比较。 质粒产量（µg/mL）的分光光度分析。传统方法与使用不同试管架构型进行提取之间的总质粒产量未观察到具有统计学意义的差异。请点击此处查看该图的放大版本。

图6： DNA质量的比较。 通过琼脂糖凝胶电泳对DNA形态进行可视化分析。标准手工提取法与基于支架的提取法在DNA的松弛型、线性化及超螺旋形态上表现相似。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：交叉污染评估。 离心后废液储槽的视图，显示离散的废液池，无重叠现象。各列分别加载高浓度溴化乙锭溶液（模拟高滴度DNA）和水。离心后，在相邻的“水”孔或邻近柱的尖端均未观察到染料，表明在测试条件下飞溅和柱间转移减少。请点击此处查看该图的放大版本。

图 8： 使用定量 PCR 分析交叉污染。 含有污染剂的样本扩增曲线以红色显示，仅含水的样本以绿色显示。仅在含有污染剂的样本中检测到扩增信号。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件 1： 支架设计的 3D 模型文件。 本文件集包含所有支架配置的 STL 文件，包括基础支架版本、迷你支架版本（含多种储液槽高度变体）、无储液槽版本以及带盖支架版本。各个组件（例如，底部储液槽、柱固定层、滤柱层和盖子）均已提供，可用于 3D 打印。请点击此处下载该文件。

补充文件 2： 支持性数据与方法。 本文件集包含离心机兼容性表格、详细的交叉污染检测流程、原始 DNA 产量数据集以及与污染分析相关的 PCR 仪器输出文件。请点击此处下载该文件。

补充图 S1：基础支架版本（完全组装后）。 基础支架完全组装后的高分辨率图像，展示整体结构和组件排列。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案旨在解决许多分子生物学实验室中存在的"通量差距"问题。虽然96孔滤板的操作速度较快，但其结合容量或最终浓度可能低于单独的离心柱¹⁴。通过将标准离心柱改造为板式转子格式，该方法结合了离心柱的高得率与基于微孔板流程的高通量优势。

当处理超过12个样本时，使用这些支架最为有利。本实验方案的主要创新在于采用24孔支架，通过共用一个废液储液槽来收集上清液和洗涤液，从而简化并加速基于离心柱的核酸提取过程。使用这些支架后，处理14至116个样本所需的时间与处理2至12个样本相当。此外，操作者的劳动强度显著降低，因为移除单个离心管、转移纯化柱、丢弃洗涤液和打开管盖等重复性操作步骤被大幅减少。由于原始试剂盒组分（溶液和离心柱）保持不变，因此预期可获得相当的DNA质量，这一结论也得到了所展示结果的支持。

使用标准设备进行24孔板架的3D打印是可行的，但基础版和迷你版可能需要一定的操作经验。无储液槽版和带盖板架版结构更简单，即使打印经验较少也可制备。在熔融沉积成型过程中，一个关键考虑因素是层间可能形成微小间隙，这在离心过程中会影响密封性。测试结果表明，100%填充率、7 mm的储液槽壁厚以及0.1 mm的层高可提供足够的密封性能。加热打印平台并进行表面平滑处理可进一步改善密封效果。相比之下，使用环氧树脂或有机溶剂进行打印后密封的方法效果不佳，因为在离心过程中发生的形变会导致裂纹和泄漏。壁厚不足还可能导致结构失效和密封性丧失，进而可能引起离心机失衡。因此，建议在使用前对打印部件进行测试。

四种支架版本适用于配备吊篮转子的多种离心机，用户可根据设备条件和通量需求选择最合适的配置。基础支架版本通量最高，但需要更大的离心机和更高的打印质量。迷你版本降低了对离心机尺寸的要求，但同时也降低了通量。无储液槽版本简化了制造过程，并可与常见的容器（如移液枪头盒）兼容，但兼容性取决于容器的几何形状。帽架版本结构最简单，但不能与过滤柱一起使用。

相较于标准的结合柱，不结合核酸的滤过柱可能较难获得⁹。若无法获得此类滤过柱，则可能需要额外的澄清步骤，从而延长整体处理时间。或者，可使用滤芯吸头（1000 µL）或二氧化钛法。

提取架可作为标准DNA提取流程的机械辅助装置⁹，不会改变缓冲液组成或柱层析化学性质（二氧化钛变体除外）。因此，预计对DNA质量无显著影响，这与琼脂糖凝胶电泳及产量比较结果一致，显示质粒形态和数量与标准方法相当。

尽管使用共用的废液储液罐存在交叉污染的潜在风险，但在测试条件下未观察到此类情况。一个关键的设计特征是 "烟囱" 柱出口的几何结构可保持柱尖与废液液面之间的分离。为维持这种分离，不应过度填充储液器，建议每次完整过柱后将废液排空。

该方法的一个局限性在于水平转子的最高速度（通常为 2,000 × g）。尽管此速度足以完成结合和洗涤步骤，但不足以实现膜的完全干燥。因此，需要在固定角转子微量离心机中进行最后的高速离心步骤。尽管增加了这一步骤，但对于超过 24 个样本的批量处理，总体时间节省仍然显著。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D 打印机耗材	NIT, 俄罗斯	-	推荐使用 PETG 或 PLA
缓冲液 N3	Qiagen, 荷兰	19064
缓冲液 P1	Qiagen, 荷兰	19051
缓冲液 P2	Qiagen, 荷兰	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, 中国
洗脱缓冲液	Qiagen, 荷兰	19086
Eppendorf 离心机 5702	Eppendorf, 德国	22626001	固定角转子
Eppendorf 离心机 5804 R	Eppendorf, 德国	22625080	摆桶式板转子
溴化乙锭	Biolabmix, 俄罗斯	EtBr-10
1000 μL 滤芯吸头滤芯	GenFollower, 中国	E-FTB1000	滤柱组件的一部分
无滤芯屏障的质粒小提旋转柱	JVLAB, 中国	-	滤柱组件的一部分
酚红	Lenreactiv, 俄罗斯	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, 捷克共和国
QIAprep 2.0 质粒小提旋转柱	Qiagen, 荷兰	27115
核糖核酸酶 A	Qiagen, 荷兰	19101
洗涤缓冲液	Qiagen, 荷兰	19065