一种基于毒素的筛选系统，用于中国台湾产果胶杆菌（Pectobacterium brasiliense）的无标记基因删除及高密度Tn5转座子诱变

摘要

本文介绍了一种在植物病原菌Pectobacterium brasiliense中构建无标记基因缺失突变体及全基因组Tn5插入突变文库的实验方案，该菌可引起马铃薯黑胫病和软腐病。该方法可实现高效的反向遗传学分析，并有助于对该生物体中与毒力相关的基因进行功能表征。

摘要

Pectobacterium brasiliense 是一种高致病性细菌，可引起马铃薯块茎软腐病、黑胫病和地上茎腐病。阐明其致病机制对疾病防控至关重要；然而，目前针对该生物体的遗传操作工具仍十分有限。本研究开发了一种基于毒素的反向筛选系统，以实现无标记基因删除和高密度 Tn5 转座子突变。该系统利用来自 pLP12 质粒的 vmi480 毒素作为反向筛选标记，构建了自杀型载体 pKV2。利用该系统，成功删除了 P. brasiliense SM 菌株中的 recA 基因。所获得的 recA 突变株作为亲本菌株，通过与携带 pKV2-LLtnp 的 RHO3 辅助菌株接合，构建了一个包含超过 12,000 个突变体的 Tn5 插入文库。在该衍生质粒中，vmi480 毒素被替换为受外向 lac 启动子调控的高活性 Tn5 转座酶，以减少极性效应。高通量块茎接种实验鉴定了多种致病力缺陷突变体，其中包括 II 型分泌系统相关基因的插入突变——该系统是介导植物细胞壁降解酶分泌的关键毒力决定因子。该平台支持功能基因组学研究，并有助于深入探究这一重要经济病原菌的毒力机制。

引言

P. brasiliense 是Pectobacterium属中最具侵袭性的物种之一，可引起马铃薯软腐病、黑胫病和地上茎腐病¹。这些病害导致马铃薯产量损失约30%，而马铃薯是全球第三大重要粮食作物，也是中国农业生产体系的关键组成部分²。尽管其具有显著的经济影响，但由于缺乏针对该物种高效且可重复的遗传操作工具，目前对P. brasiliense致病性分子机制的理解仍十分有限^3,4,5。

许多植物病原细菌的功能基因组学研究依赖于高效的等位基因交换和转座子诱变系统；然而，针对P. brasiliense的类似遗传工具仍十分有限或效率低下。特别是，适用于该物种的有效反向筛选标记极为稀缺。尽管sacB基因已被广泛用作多种细菌基因敲除中的反向筛选标记，但P. brasiliense在筛选过程中可能对高达50%的蔗糖具有高度耐受性⁵。这种耐受性可能反映了其对毒素不敏感，原因可能是将蔗糖酶解转化为糖类聚合物。此外，高浓度蔗糖可能引发有害的渗透压冲击⁶。同时，适用于该生物体的大规模高效诱变方法（如Tn5转座子插入文库构建）尚未得到良好建立。

为解决这些技术局限，研究人员开发了一种基于毒素的反向筛选系统，并为P. brasiliense建立了一套高效的Tn5转座子诱变筛选流程。与传统的蔗糖筛选方法相比，这种基于毒素的策略具有显著优势，包括更强的筛选严谨性、更准确地识别双交换事件，以及避免了渗透压胁迫带来的干扰。类似的基于vmi480毒素-抗毒素系统已成功应用于克服Vibrio属物种中的筛选障碍⁷。该方法适用于未知基因的高通量功能鉴定，且提供了一个通用性强的平台，可进一步拓展至其他相关的软腐病原Pectobacteriaceae菌种。

方案

1. 在P. brasiliense中构建无标记recA基因缺失突变株

1. 使用标准DNA提取方法，从 P. brasiliense SM 中提取基因组DNA，并从 E. coli 供体菌株中提取pKV2质粒（由pLP12衍生而来，对抗生素筛选标记和多克隆位点进行了改造）。
2. 通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop分光光度法检测所提取的基因组DNA和质粒DNA的质量与浓度。
3. 使用 EcoRI 和 NheI 双酶切在37 °C下对pKV2质粒进行线性化处理，反应5小时。通过琼脂糖凝胶电泳验证酶切是否完全，并纯化线性化后的质粒。
4. 利用基因组分析软件确定 recA 基因上下游约800 bp的区域，并设计相应的引物对LBF/LBR和RBF/RBR（本研究中使用的所有引物见材料表）。
5. 在标准PCR扩增条件下扩增两个同源臂，并纯化PCR产物。50 µL的PCR反应体系通常可获得2.5 µg产物。
   注意：可通过调整同源区域的边界来优化引物的Tm值和GC含量。
6. 使用DNA组装试剂盒，将纯化的同源臂与线性化质粒骨架连接，构建重组自杀质粒pKV2-recA。
7. 将连接产物通过热激法转化至感受态 E. coli S17-1 λpir细胞中，在LB培养基中复苏后，涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板（LB + kan）上。
   注意：最终使用的浓度为：50 mg/mL卡那霉素、0.2%（w/v）葡萄糖、0.3%（w/v）阿拉伯糖和0.3 mM 2,6-二氨基庚二酸（DAP）。
8. 通过限制性酶切或菌落PCR验证阳性克隆。（本研究中使用的所有培养基配方见材料表）。
9. 提取经验证的pKV2-recA质粒，并通过热激转化法将其转入 E. coli WM3064细胞中（预期转化效率 > 10⁶ cfu/µg）。
10. 在含有卡那霉素和二氨基庚二酸（DAP）的LB琼脂平板上筛选转化子。
11. 通过将供体菌株（WM3064 pKV2-recA）和受体菌株 P. brasiliense SM 的过夜培养物按1:1（v/v）比例混合，进行双亲接合，通常每毫升供体与受体细胞混合液可产生10⁴至10⁶个转接合子。
12. 用无菌水洗涤混合培养物一次，将混合液点种于添加了卡那霉素和DAP的LB琼脂平板上，于28 °C培养48–72小时。
    注意：若未观察到转接合子，可将供体与受体的比例提高至2:1（v/v）以提高接合效率。若背景菌生长过多，可通过用无菌水洗涤混合培养物两次以去除残留的DAP。
13. 回收接合混合物，并涂布于含有卡那霉素和葡萄糖（不含DAP）的LB琼脂平板上进行反向筛选。
14. 挑取6–8个菌落，将其复制划线至LB + kan和LB + kan + 阿拉伯糖平板上。
15. 选择在LB + kan平板上生长但在LB + kan + 阿拉伯糖平板上不生长的菌落；这些为第一轮交叉重组候选菌株。
16. 将确认的第一轮交叉重组菌株接种至LB培养基中过夜培养，随后涂布于含L-阿拉伯糖的LB琼脂平板以诱导第二轮同源重组。
17. 挑取多个菌落，复制划线至LB + 阿拉伯糖和LB + kan平板上。选择在LB + 阿拉伯糖平板上生长但在LB + kan平板上不生长的菌落；这些为疑似 recA 基因缺失突变体。
    注意：若在第二轮交叉重组后未观察到菌落，应评估目标基因对细菌生长是否具有必需性。或者，可将上下游同源区域延长至1,200 bp以提高同源重组效率。
18. 使用引物对checkF/checkR进行菌落PCR，扩增跨越 recA 启动子和终止子区域的片段，以确认 recA 突变体中目标基因的框内缺失。对PCR产物进行测序，以验证 recA 基因的精确框内缺失。
19. 成功缺失的标志是PCR产物大小减小，其长度应等于野生型片段长度减去被删除基因片段的特定长度。

2. 在P. brasiliense中用于Tn5诱变的pKV2-LLtnp质粒构建

1. 使用引物对 Tnp-F/Tnp-R 从 pMCS2-LLtnp⁸ 中扩增 Tnp 转座酶盒，使用引物对 ori-F/ori-R 从 pKV2 中扩增 oriγR6K Tn5 骨架。使用 DNA 纯化试剂盒纯化所有 PCR 产物。
2. 使用 DNA 组装试剂盒将纯化的 Tnp 盒与 oriγR6K Tn5 骨架进行组装。通过热激法将组装产物转化至化学感受态的 E. coli S17-1 λpir 细胞中，于 LB 培养基中复苏后，涂布于添加卡那霉素的 LB 琼脂平板（LB + kan）上。
3. 使用引物对 ori-F/ori-R 和 Tnp-F/Tnp-R 通过菌落 PCR 验证阳性克隆。
4. 挑取单菌落接种于 LB 培养基中，过夜培养以制备 E. coli RHO3 感受态细胞。将培养物按 1:100 稀释至新鲜 LB 培养基中，振荡培养至 OD₆₀₀ 达 0.6。
5. 将培养物置于冰上冷却，用预冷的 0.1 M CaCl₂ 洗涤细胞三次。将最终沉淀重悬于 500 µL 预冷的 20% 甘油中，于 −80 °C 保存。
6. 取 10 µL 经验证的重组质粒（pKV2-LLtnp）加入 100 µL RHO3 感受态细胞中，通过热激法转化（预期转化效率 > 10⁶ cfu/µg）。冰浴 30 分钟，42 °C 热激 45 秒，再置于冰上冷却 2 分钟。
7. 加入 500 µL LB 培养基，37 °C 振荡培养 1 小时。涂布于含卡那霉素和二氨基庚二酸（DAP）的 LB 琼脂平板（LB + kan + DAP）上，37 °C 过夜培养。
8. 使用引物 Tnp-F/Tnp-R 通过菌落 PCR 验证 RHO3 转化子中的阳性克隆。

3. 构建P. brasiliense的Tn5转座子突变文库

1. 在28 °C下于LB培养基中培养 P. brasiliense ΔrecA，并在添加了卡那霉素和二氨基庚二酸（DAP）的LB培养基（LB + kan + DAP）中于37 °C下培养RHO3/pKV2-LLtnp。使两种菌株均生长至OD₆₀₀达到1。
2. 取100 µL P. brasiliense ΔrecA与100 µL RHO3/pKV2-LLtnp混合，离心该混合液，弃去上清液，并将洗涤后的菌体沉淀重悬于10 µL LB培养基中。
3. 将重悬的混合液点样至添加DAP的LB琼脂平板上，于28 °C孵育8小时，以实现接合转移。
4. 用1 mL无菌LB培养基冲洗平板表面，回收接合反应混合物。短暂离心后弃去上清液，并用LB培养基洗涤菌体沉淀两次，以去除DAP。
5. 将洗涤后的菌体沉淀重悬于300 µL LB培养基中，并进行10倍系列稀释后涂布于添加卡那霉素和葡萄糖的LB琼脂平板（LB + kan + glucose；不含DAP）上，用于筛选转接合子。
6. 于28 °C孵育平板48小时。挑取五个单菌落，并使用引物对ori-F/ori-R和Tnp-F/Tnp-R进行菌落PCR验证，以确认Tn5转座子成功导入。对所有五个菌落进行测序，以验证Tn5在基因组中的插入情况。
   注意：在正式构建突变文库之前，从接合平板上随机挑选六个单菌落。分别使用两种不同的限制性内切酶进行质粒拯救实验，作为两个平行对照组，以确定插入位点。共获得36条测序读长。只有当每个单菌落的六个插入位点完全相同时，才确认为单一Tn5插入事件。
7. 通过重复接合步骤并计数菌落数量来估算突变文库的容量。确保文库总大小超过12,000个菌落，以满足后续筛选所需的基因组覆盖度。
   注意：若观察到诱变频率较低，可考虑使用高活性Tn5转座酶变体（如E54K/M56A/L372P突变体），以提高转座效率。
8. 将第6步获得的各个突变菌落转移至含有200 µL LB + kan培养基的96孔板中，每孔200 µL。于28 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
9. 向每孔中加入133 µL无菌50%甘油，使终浓度约为20%。密封后于−80 °C长期保存96孔板。

4. 通过马铃薯块茎和盆栽接种进行高通量致病性测定

1. 用无菌水冲洗马铃薯块茎（品种 Favorita），短暂浸入75%乙醇中，然后在洁净台中风干。将块茎切成约8 mm厚的切片，放入无菌的90 mm培养皿中。每组至少准备三片，用于生物学重复。
2. 使用多通道移液器，将每种突变株1 µL接种至马铃薯切片上，按照96孔突变文库的板式布局进行操作。以P. brasiliense ΔrecA作为阳性对照，LB + kan作为阴性对照。
3. 将接种后的马铃薯切片于28 °C培养7–8小时。记录与ΔrecA对照相比，明显出现软化程度降低或病斑面积较小的突变株。通过测量病斑的长度和宽度来量化病斑面积。将这些突变株确定为初筛候选株。
   ​注意：接种前确保突变株和对照菌液的OD₆₀₀ 值已标准化至0.8。
4. 进行次级筛选时，将每个候选菌株5 µL接种到新鲜马铃薯切片上（每片接种6个菌株，均匀分布）。每个菌株设置三个生物学重复。于28 °C培养7–8小时，记录病斑大小以确认毒力减弱。
5. 通过在LB + kan平板上划线分离表现出稳定毒力减弱的菌株。将平板于28 °C过夜培养，并将验证后的毒力减弱突变株保存于4 °C，用于后续分析。
6. 进行整株植物验证时，将细菌悬浮液（浓度标准化至1 × 10⁸ CFU/mL）150 µL接种至马铃薯茎部。使用无菌注射器将悬浮液注入茎基部区域。接种48小时后观察病害发展情况。在三株独立植株上进行生物学重复。
7. 使用黑胫病分级量表（“6级有序评分：0、1、3、5、7、9”）评估病害严重程度，并按以下方式计算病害指数：
   1. 等级0：整株植物无任何病害症状。
   2. 等级1：茎部病斑不超过茎周长的1/3，和/或个别叶片萎蔫。
   3. 等级3：茎部病斑不超过茎周长的1/2，和/或少于一半的叶片出现轻度萎蔫，和/或少数下部叶片有病斑。
   4. 等级5：茎部病斑超过茎周长的1/2，和/或超过一半的叶片出现轻度萎蔫。
   5. 等级7：茎部病斑环绕整个茎周，和/或超过2/3的叶片萎蔫。
   6. 等级9：植株所有叶片均萎蔫或死亡。
      
8. 将确认的毒力减弱突变株培养物与等体积无菌50%甘油混合，终浓度为25%，制备长期保存菌种，并于-80 °C保存。

5. 通过质粒拯救法鉴定Tn5插入位点

1. 培养目标 Tn5 突变株，并使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA。定量 DNA 浓度，以确保下游消化反应有足够的起始量。
2. 取 1–2 µg 基因组 DNA，在含有 10× 反应缓冲液和 5 µL 酶的 100 µL 体系中用 EcoRI 进行消化，37 °C 下孵育至少 3 h。通过琼脂糖凝胶电泳验证消化是否完全。
3. 向消化后的 DNA 中加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠和 3 倍体积的无水乙醇，沉淀 DNA。充分混匀后于 -20 °C 孵育 1 h。
4. 在 13,500 x g 条件下离心 5 min，依次用 75% 乙醇和无水乙醇洗涤沉淀。将沉淀空气干燥后，重悬于 17 µL 无菌水中。
5. 向消化后的 DNA 片段中加入 2 µL 10× T4 DNA 连接酶缓冲液和 1 µL T4 DNA 连接酶，进行自连连接。设置阴性对照（不加连接酶）以检测背景转化情况。将连接反应体系在 4 °C 下孵育过夜，以促进限制性片段的环化。
6. 取 10 µL 连接反应混合物，通过热激转化法转入化学感受态 E. coli S17-1 λpir 中。在 LB 培养基中复苏 1 h 后，涂布于含卡那霉素的 LB 琼脂平板（LB + kan）上，筛选携带 Tn5 转座子片段的质粒。
7. 随机挑取五个抗卡那霉素的单菌落，使用标准质粒小提试剂盒提取质粒 DNA。通过将每种质粒各 500 ng 用 HindIII 消化并在 37 °C 孵育 5 h，验证质粒结构，并通过琼脂糖凝胶电泳分析消化图谱。
8. 若质粒条带大小与预期片段模式一致，则使用位于 Tn5 末端内的 5' ME 引物进行 Sanger 测序。
9. 将 Tn5 5'-ME 区域下游 50–100 bp 的侧翼序列与 P. brasiliense SM 基因组进行比对（使用 BLAST 或基因组分析软件），确定精确的 Tn5 插入位点。
10. 确认每个突变株的五次独立测序结果均映射至同一基因组坐标（> 98% 序列一致性）。
11. 若五次测序中有任何一次映射至不同的基因组位置，则表明该突变株中存在多个 Tn5 插入位点。在此类情况下，应分析更多菌落以确定所有插入位置；或可选择进行 Southern 印迹杂交或全基因组测序，以获得更明确的插入位点定位。
12. 将所有测序结果均显示单一且一致插入位点的突变株定义为可靠的 Tn5 单插入突变株，可用于后续的表型或遗传学分析。

结果

为了克服sucB突变在P. brasiliense中引起的不稳定性，采用质粒pLP12中的vmi480毒素作为反向筛选标记，并通过替换抗生素抗性盒并调整克隆位点构型，构建了改良的自杀型载体pKV2（图1A）。为获得无标记的recA基因缺失突变株，将约800 bp的recA基因上下游同源臂片段克隆至pKV2中，随后通过两步筛选程序获得双交换重组子。使用引物对LBF/RBR进行PCR验证，并结合Sanger测序，结果显示突变株与野生型之间存在约600 bp的差异，证实recA基因成功缺失（图1B）。

以 recA 突变株作为受体背景，构建了 Tn5 转座子突变文库，共获得超过 12,000 个独立的突变株。通过马铃薯块茎（图 2A、B）和整株植物接种实验（

讨论

本研究中开发的遗传操作策略为马铃薯主要软腐病原菌P. brasiliense的功能基因组学研究提供了一种可行方案^9,10。通过将基于毒素的反向筛选系统整合到自杀型质粒骨架中，成功构建了无标记的ΔrecA突变株。该方法相较于传统的基于sacB的系统具有显著优势；由于P. brasiliense本身对蔗糖具有耐受性且对渗透压敏感，使用sacB系统常导致较高的背景生长，而基于毒素的系统则提供了更强的筛选严谨性和更高的双交换事件特异性。所获得的ΔrecA菌株可作为稳定的遗传背景，消除了非特异性同源重组，从而确保后续转座子插入的遗传稳定性。此外，recA基因的缺失未观察到对毒力或适应性代价产生影响，这是开展有意义的致病性测定的关键前提。

该方案的成功依赖于多个关键步骤，尤其是优化接合效率。由于不同供体背景和质粒大小下的效率存在差异，要获得高密度文库，需...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌基因组DNA提取试剂盒	提取细菌基因组DNA	Tiangen	DP302-02
二氨基庚二酸	1 L培养基中含0.3 mM	Macklin	D836611-5g
DNA组装试剂盒	DNA组装	Vazyme	C116-02
DNA纯化试剂盒	DNA纯化	Tiangen	DP214-02
卡那霉素	50 mg/mL	Aladdin	K103025-25g
葡萄糖	0.2% (w/v)	Aladdin	G116305-250mg
胰蛋白胨	1 L培养基中含10%	OXOID	LP0042B
酵母提取物	1 L培养基中含5%	OXOID	LP0021B
NaCl	1 L培养基中含10%	Biofroxx	1249KG001
琼脂	1 L培养基中含15%	Biofroxx	8211GR500
L-阿拉伯糖	0.3% (w/v)	Aladdin	A106196-25g
质粒小提试剂盒	提取质粒	Tiangen	DP103-02
EcoRI	限制性内切酶	Yugong Biotech	EG15536
NheI	限制性内切酶	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	限制性内切酶	Yugong Biotech	EG15539
T4 DNA连接酶	线性DNA自环化	Yugong Biotech	EG15205
离心机	RWD	M1324R
PCR扩增仪	BIO-GENER	GET3XG
数码相机	SONY	ILCE-7M4
电泳系统	LY	DYY-6C
水浴锅	JOANLAB	WB100-1F
凝胶成像系统	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
高压灭菌器	Yamato	SQ510C
摇床培养箱	ZHICHU	ZQZY-AR8
恒温培养箱	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
紫外-可见分光光度计	HITACHI	U-3900
电穿孔仪	BIO-RAD	MicroPulser
菌株与质粒
P. brasiliense SM	马铃薯致病菌	实验室菌种保藏
E. coli S17-1 λpir	大肠杆菌感受态细胞	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	大肠杆菌感受态细胞	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	大肠杆菌感受态细胞	实验室菌种保藏
pKV2	改造后的自杀质粒	本研究中构建
pLP12	自杀质粒	实验室菌种保藏
pMCS2-LLtnp	提供携带Tn5的片段	实验室菌种保藏
pKV2-LLtnp	携带Tn5片段的改造质粒。	本研究中构建
引物
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		定制合成
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		定制合成
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		定制合成
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		定制合成
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		定制合成
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		定制合成
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		定制合成
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		定制合成
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		定制合成
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		定制合成
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		定制合成