一种用于悬浮T细胞和三维细胞模型中低量CRISPR基因组编辑与mRNA转染的数字微流控电穿孔平台

摘要

本方案描述了使用“DMF-ection”（一种数字微流控（DMF）电穿孔平台）对原代人T细胞中的TCRα/β受体进行微型化的CRISPR–Cas9基因组编辑。该方法可实现并行、低样本输入的高效基因编辑，并保持高细胞活力，还可进一步适用于将mRNA递送至多细胞3D球状体。

摘要

数字微流控（DMF）电穿孔技术能够在显著减少细胞用量（最多减少100倍）并保持高细胞活性的同时，实现对哺乳动物细胞的精确、低体积遗传操作。本研究展示了一种基于DMF的高通量转染工作流程，可用于CRISPR介导的原代人悬浮T细胞中TRAC位点的敲除，以及三维HEK293T球状体的mRNA转染。通过空间定位沉积的CRISPR向导RNA和在芯片上组装核糖核蛋白（RNP）复合物，仅使用每组10,000个细胞，即可在CD4⁺和CD8⁺ T细胞群体中实现高效的TRAC位点破坏，编辑后细胞存活率超过85%。通过流致扩散和泰勒扩散分析进行的生物物理表征表明，在电穿孔缓冲液条件下，聚合物添加剂可稳定Cas9–sgRNA复合物，从而支持在亚微升级体积下的可重复基因编辑。该工作流程进一步被优化用于三维应用，通过将EGFP mRNA递送至完整的HEK293T球状体，实现了强烈且空间分布均匀的荧光表达，同时不影响球状体的生长或形态。综上所述，这些结果表明，DMF电穿孔技术可高效实现悬浮免疫细胞和多细胞球状体的基因组编辑与mRNA递送。该平台为 CAR-T细胞治疗、功能基因组学以及先进的三维细胞模型等应用提供了可扩展且低样本输入的解决方案。

引言

原代人类细胞中的基因编辑在治疗开发和基础研究中正变得越来越重要，包括在免疫工程、罕见病建模和功能基因组学中的应用¹。尽管电穿孔技术能够实现高效的基因组编辑，但传统的基于比色皿的系统通常每个实验条件需要 多达数百万个细胞，限制了其在患者来源样本和稀有免疫细胞群体中的应用²。此外，由于通量、自动化程度和试剂消耗方面的限制，这些系统也不适合大规模筛选³。

微流控电穿孔已成为一种有前景的低样本量基因组编辑方法⁴。然而，大多数现有平台依赖于连续流动架构，涉及复杂的流体操作，试剂混合灵活性有限，且每实验条件所需的细胞数量相对较多。相比之下， 数字微流控 (DMF) 能够在平面电极阵列上主动操控离散的纳升级液滴，实现对反应组分、反应时间和空间定位的精确控制。这种即插即用的液滴式平台非常适合需要节约原代细胞和试剂的低体积、高通量实验流程⁵。

近期研究已证明，基于数字微流控（DMF）的三液滴电穿孔结构可用于细胞内递送，该结构可产生局部、低电流的电场，实现高效的核糖核蛋白（RNP）和信使RNA（mRNA）递送，同时最大限度地减少热效应和电化学应力^6,7,8。在此基础上，研究人员开发出下一代DMF电穿孔平台，命名为“DMF-ection”，该平台具有 48个独立可寻址的反应位点，兼容全自动化操作，并可实现可扩展的卡盒式制造⁹（图1）。DMF卡盒由底部的印刷电路板（PCB）和顶部的塑料板组成，两者通过垫圈隔开，并通过定位卡扣实现单一正确方向的组装（图1A）。48重布局被划分为八个相同的家族（图1A–H），每个家族包含六个独立可寻址的电穿孔位点，每张卡盒最多可支持48种并行基因编辑条件（图1B）。在卡盒组装前，使用声波分配器将向导RNA文库点样至基底表面。在全部48个位点上验证了点样的位置准确性，液滴位置与电极中点的偏差均在亚毫米范围内（图1C），从而确保卡盒内RNP组装的可靠性。点样完成后，细胞和液体电极液滴在卡盒内被驱动，形成三液滴电穿孔结构（图1D）。电穿孔完成后，细胞被转移至培养板中进行恢复及后续分析，包括流式细胞术、测序和显微镜观察（图1E）。该系统能够实现高效基因组编辑，所需细胞数量比标准比色皿法少达100倍 ，显著拓展了在低细胞输入量和高通量应用场景中基因组工程的可及性 。

本研究通过递送多种生物分子货物（包括mRNA和CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物），实现了高效的转染和基因敲除，从而评估了该平台的性能。除了原代T细胞外，数字微流控电转染（DMF-ection）还为向复杂的多细胞结构中递送核酸提供了一种可推广的框架。三维（3D）球状体和类器官模型由于其结构和脆弱性，对试剂渗透构成了显著障碍，而传统的电穿孔方法通常会破坏其形态或导致递送不均一。为了评估用于T细胞编辑的相同微型化电穿孔原理是否可扩展至结构化组织，研究人员将DMF工作流程应用于3D HEK293T球状体。实验结果表明，基于DMF的电润湿技术能够轻柔地将完整的球状体定位在三液滴几何结构中，并在保持结构完整性和生长能力的同时实现均匀的mRNA递送。尽管这些结果超出了本文所述的原代T细胞实验方案，但它们展示了可编程DMF电穿孔技术在新兴的3D细胞系统中的广泛应用前景，这些系统与药物发现和疾病建模密切相关。

方案

本方案中使用的人源原代T细胞来自商业供应商，在供体知情同意下获取，并符合相关机构、伦理和监管规定。所有人源生物材料的操作均按照机构生物安全规程进行。实施本方案的研究人员有责任确保其使用人源原代细胞的行为符合当地机构审查委员会（IRB）或伦理委员会的要求、适用的生物安全法规，以及任何与人类生物材料使用相关的国家或地区法律法规。本研究中所用细胞材料未包含任何可识别患者身份的信息。

1. 初始人T细胞的制备与激活

1. 将冻存的原代人CD3⁺ T细胞在37 °C水浴中快速解冻。将细胞转移至预热的基础T细胞培养基中，于180 × g 离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于新鲜培养基中。
2. 使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。
3. 将细胞重悬于T细胞培养基中，调整密度为1 × 10⁶ 个细胞/mL，并添加可溶性四聚体抗体CD3/CD28 T细胞激活剂（按照试剂供应商说明书）以及200 IU/mL IL-2。于37 °C、5% CO₂条件下培养72小时。
   注意：激活期间维持细胞密度在0.5–2 × 10⁶ 个细胞/mL之间。使用U型底96孔板进行激活，以优化细胞与激活剂的接触及激活效率。

2. 在数字微流控基底上制备向导RNA点样（声波分配器点样）

1. 用无核酸酶水将冻干的 sgRNA 重悬，配制成 100 µM 的储存液。另取一管，用无核酸酶水配制浓度为 100 mg/mL 的聚-L-谷氨酸（PGA，钠盐，分子量 15,000–50,000 Da）储存液。按 sgRNA:PGA 体积比 5:4 混合 sgRNA 与 PGA 储存液，使终浓度为 55.6 pmol/µL 的 sgRNA 和 44.4 mg/mL 的 PGA，溶剂为无核酸酶水。短暂涡旋混匀，1,000 × g 离心 30 秒，分装为单次使用量，未使用的分装样品于 −80 °C 保存，最长可保存 6 个月。
   注意：避免反复冻融。
2. 将向导 RNA-PGA 混合物加入低残留体积的声波转移源板中，对应目标反应位点的排布位置。
3. 使用校准的声波分配仪，将 40 nL（相当于 2.2 pmol sgRNA）的向导 RNA-PGA 混合物转移至数字微流控（DMF）基底上的各个目标点样区域。
   注意：在 55.6 pmol/µL 浓度下，40 nL 可提供每个位点 2.2 pmol 的 sgRNA（55.6 × 0.040 = 2.22 pmol）。干燥的向导 RNA 在芯片内液滴合并过程中重新溶解；通过各点位一致的编辑效率可确认完全重悬。
4. 在生物安全柜中，将点样的液滴在室温下自然风干至完全无可见液体残留（约需 5 分钟）。
   注意：不得使用强制气流或加热，以免导致向导 RNA 脱落或降解。
5. 组装数字微流控（DMF）芯片。
   1. 在生物安全柜中，将上层板与已点样的基底对齐，通过上层板的非对称塑料卡扣结构与底层板的凹槽匹配，确保正确位置。沿短边均匀、同时施加压力，直至听到明显的机械卡合声，表明锁定结构已完全啮合。
      注意：芯片设计为仅有一种正确组装方向；若组装错误则不会产生卡合声。操作时始终捏住基底边缘，避免污染或损伤功能表面，且不得使基底相互滑动，以防刮伤表面涂层。
   2. 检查点：通过机械卡合声确认组装正确。
      注意：涂层完整性的电学检测无预先运行提示；任何因组装不当导致的功能异常将在运行后由质量控制报告自动检测并提示。
      暂停点：未使用的已组装芯片可在含干燥剂（硅胶包）的密封包装中室温保存，最长不超过 48 小时。

3. 细胞制备

1. 每次使用前新鲜配制1 mL完全转染缓冲液，按20:1（v/v）的比例（电穿孔缓冲液：表面活性剂）将适用于数字微流控（DMF）的电穿孔缓冲液与提供的生物相容性非离子型表面活性剂混合，使表面活性剂终浓度为0.05%（v/v）。轻柔混匀后置于冰上保存。
   注意： 此处使用的适用于DMF的转染缓冲液是一种低电导率、等渗缓冲液（电导率：3.5 mS/cm，渗透压：305 mOsm/L）。若研究人员使用其他缓冲液，需验证其与DMF驱动及细胞活力的兼容性。该生物相容性非离子型表面活性剂用于减少液滴钉扎现象；若未使用所提供的表面活性剂，应选用合适的替代品。
2. 用转染缓冲液（不含表面活性剂）洗涤活化T细胞一次。在180 × g 条件下离心5分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于含表面活性剂的完全转染缓冲液中，调整细胞密度为1.0 × 10⁷ 个细胞/mL，每根 cartridge 使用总体积100 µL。置于冰上保存。
3. 在加载至cartridge前立即向100 µL T细胞悬液中直接加入Cas9核酸酶，通过轻柔移液混匀；保持在冰上。
   注意：对于原代T细胞，每100 µL cartridge 体积加入Cas9的量为42 pmol（即0.42 pmol/µL）。每个电穿孔位点处理约1 µL细胞悬液，每次编辑递送0.42 pmol Cas9。在适配其他免疫细胞类型时，需优化此剂量（见表1）。

组分	每次编辑的最终浓度
Cas9	约 1 µL 液滴中含 0.42 pmol
sgRNA	2.1 pmol（来自 40 nL 点样）
PGA	点样混合液中储存浓度为 44.4 mg/mL
表面活性剂	0.05%（v/v）
细胞投入量	约 10,000 个细胞

表1：各转染液滴中最终浓度的汇总表。

4. 在 DMF-ection 平台上进行转染

1. 使用多通道移液器，将 10 µL T 细胞/Cas9 混合物加入每个细胞加样孔（共 8 个），并将 10 µL 完全转染缓冲液加入 16 个液体电极加样孔中（如图 1所示）。
2. 将电压设为500 V，脉冲持续时间为 3 ms，脉冲次数为 2。根据仪器平台说明启动电穿孔程序。
   1. 检查点：运行结束后立即查看质控报告。零星的失败（<10% 的位点）无需干预。若失败为系统性，应更换为提供的质控板，运行系统健康检查（约 2 分钟），若问题仍然存在，请联系技术支持。

5. 编辑后T细胞的卸载与回收

1. 使用液体处理仪，将每个反应位点的电穿孔细胞转移至含有150 µL预热的基础T细胞培养基（添加200 IU/mL IL-2）的96孔U型底板中。
2. 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育72小时，以允许蛋白质 turnover 及细胞表面受体表达发生变化。

6. 流式细胞术分析 TRAC 敲除

1. 将细胞转移至无菌的96孔圆底板中，以减少洗涤过程中的细胞损失。用流式细胞术缓冲液（1× PBS、2% FBS、2 mM EDTA）洗涤细胞两次：每次在400 × g 离心5分钟，然后轻轻翻转圆底板以吸除上清液。细胞将保留在孔底沉淀中。
2. 在流式细胞术缓冲液中配制表面染色主混合液，包含抗CD4、抗CD8和抗TCRα/β抗体，浓度按制造商推荐。每孔加入25 µL主混合液，在4 °C避光孵育20分钟。用1× PBS（不含FBS）洗涤两次，每次在400 × g 离心5分钟。将细胞重悬于100 µL含活力染料（1:1,000，v/v）的1× PBS中，在室温避光孵育10分钟。
   注意：圆底板有助于有效沉淀细胞；请确保在每一步操作中细胞充分重悬。
3. 用流式细胞术缓冲液洗涤细胞两次，每样本以150–200 µL重悬，用于上机检测。
4. 根据所用荧光染料配置流式细胞仪的合适激光线和滤光片组合（例如，活力染料使用488 nm激发；表面标记物根据需要使用405 nm或488 nm激发）。使用单染补偿对照样本和未染色样本设置电压。每样本至少采集5,000个活单细胞事件。依次设门：散射光单细胞 → 活细胞（活力染料阴性） → CD4⁺ 或 CD8⁺ → TCRα/β表达情况。
   注意：在标准条件下，考虑到洗涤和染色过程中的损失以及细胞增殖时间，每样本采集到的总活细胞事件数通常在5,000至10,000以上。
5. 通过检测CD4⁺和CD8⁺细胞群中TCRα/β阴性细胞的比例，确定TRAC基因的破坏效率。以各亚群中TCRα/β阴性细胞占活单细胞门的比例百分比报告基因敲除效率。

结果

预期结果
每种条件下对 10,000 个活化的 T 细胞进行电穿孔，通常可在转染后 72 小时达到 >85% 的 TRAC 基因敲除效率，并保持 >95% 的细胞活力。流式细胞术结果显示，在靶向 TRAC 的条件下，TCRα/β 染色信号明显丢失，而对照组（非靶向 sgRNA 对照组，NTC）以及未施加任何电场的对照组则无此现象。除非另有说明，n 代表在不同日期独立进行的 DMF-electroporation 实验次数。来自同一芯片的多次技术重复在统计分析前已取均值，不单独计入 n 值。本研究中报告的所有 T 细胞实验均使用来自单一健康供体的冻存细胞进行。相同平台下不同供体间的变异性已有进一步表征⁹。

由于阴离子聚合物添加剂的存在，Cas9–sgRNA核糖核蛋白在电穿孔条件下的稳定性得到提升
数字微流控技术的一项核心设计要求是具备高度疏水的表面，以使液滴在电润湿过程中能够自由滑动。尽管这一特性对于液滴运动和精确操控至关重...

讨论

本方案描述了一种微型化的数字微流控电穿孔工作流程，可利用纳升级液滴实现向原代人T细胞的高效细胞内递送。该方法的一个核心优势在于，每个反应仅需10,000个细胞即可完成CRISPR–Cas9基因组编辑，与传统电穿孔相比，显著降低了材料需求。基于液滴的架构支持自动化，确保在多个平行位点上试剂操作和反应体系构建的可重复性。

在先前的研究中，将 DMF-ection 平台与一种广泛使用的系统进行直接对比表明，在每编辑 10,000 个细胞的条件下，传统核转染产生的 GFP 阳性 T 细胞不足 2%，而 DMF-ection 平台在相同低输入条件下实现了 >90% 的转染效率。对于包含 192 个条件的阵列式筛选，DMF 平台每个条件所需的细胞数量比传统方法少 25 倍，Cas9 用量约为传统方法的 50 分之一⁹。这些比较凸显了微型化数字微流控电穿孔技术在低输入量和高通量筛选应用中的材料优势

关键步骤与故障排除
多个步骤对成功至关重要...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 通道 VOYAGER 可调枪头间距移液器	Integra	4732	仪器设备
1× PBS	Gibco		流式缓冲液
96 孔板，Sphera 低吸附表面	Thermo Fisher	174927	类球体实验方案
96 孔圆底板	Sarstedt	82.1583.001	类球体实验方案
Alexa Fluor 647 抗人 CD4 抗体	Biolegend	357421	1:200 稀释，克隆号 A161A1
Attune 流式细胞仪	ThermoFisher		仪器设备
DMEM 培养基	Gibco	10564011	培养基补充剂—类球体培养
适用于 DMF 的缓冲液	DropGenie		转染
DropGenie 转染系统	DropGenie		仪器设备
Echo 声波移液器 650 系列	Beckman Coulter Life Scienes
Echo 认证的 384 孔低残留体积板	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		流式缓冲液
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS 荧光显微镜	ThermoFisher		仪器设备
胎牛血清	Gibco	16000044	培养基补充剂—类球体培养
Fida 1 仪器及 Fida Neo 480 nm 检测器	Fida Biosystems ApS		仪器设备
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T 细胞	ATCC		类球体实验方案
人 IL-2 重组蛋白	Peprotech	200-02 50ug	T 细胞培养基补充剂
人原代泛 CD3+ T 细胞	All Cells		外周血，冷冻保存，泛 CD3+ 辅助 T 细胞，阴性筛选
Immunocult CD3/CD28 激活剂	StemCell Technologies	10970	T 细胞激活培养基
Immunocult 扩增培养基	StemCell Technologies	10981	T 细胞激活培养基
Incucyte 活细胞分析系统	Sartorius		仪器设备
INTEGRA ASSIST PLUS 移液机器人	Integra	4505, 4 位竖直支架（货号 4521）	仪器设备
非靶向合成向导 RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE 抗人 TCR α/β 重组抗体	Biolegend	380805	1:200 稀释，克隆号 QA20B12
PE-Cy 7 抗人 CD8	BD Pharmingen	557750	1:200 稀释，克隆号 RPA-T8
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	培养基补充剂—类球体培养
聚-L-谷氨酸（PGA）	Sigma Aldrich	P4761-100MG	使用浓度为 100 mg/mL
Prism 版本 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		软件
sNLS-SpCas9-sNLS 核酸酶	IDT	10017687
类球体微孔板	Corning	3830	类球体实验方案
表面活性剂 F	DropGenie		转染—在 DMF 兼容缓冲液中以 1:20 比例使用，配制完整的转染缓冲液
TRAC 合成向导 RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Gibco	25-300-062	类球体实验方案