高分辨率昆虫摄影的焦点堆叠方案

摘要

本研究旨在利用经济实惠的设备，提供一种易于实现且标准化的昆虫摄影焦点堆叠方法，以生成清晰、高分辨率的图像，用于分类学、生物多样性研究、生态学研究以及公众科普推广。

摘要

本文介绍了一种利用模块化数字成像系统，通过摄影对焦堆叠技术获取昆虫标本高分辨率、大景深图像的实验方案。该方法建立了标准化的工作流程，涵盖设备组装、校准、图像采集和后期处理等环节。通过将全画幅无反相机（6100万像素）与显微物镜结合，并配合同步闪光照明，本方案可实现0.76 µm–0.19 µm的像素尺度，并以亚微米级对焦步进（0.2 µm）生成无伪影的合成图像。在常规实验室条件下，该流程每周可完成约20幅最终图像的采集与处理。与现有的堆叠成像方案相比，这一低成本混合系统（成本不足商业系统的<30%）在保持衍射极限图像质量的同时，显著提高了技术的可及性。典型应用包括为分类学研究制作色彩校准的鉴定图版、生物多样性数字化以及科普推广。本方案的标准化结构有助于在不同实验室和野外工作站之间实现可重复性，支持在资源有限和机构化环境中开展大规模昆虫图像采集项目。

引言

昆虫是地球上种类最丰富的生物类群，在生态系统功能中发挥着关键作用¹。然而，全球评估表明，昆虫的丰度和多样性在世界范围内正以惊人的速度下降^2,3。准确记录昆虫形态对于分类学、生态监测和保护工作至关重要，尤其是在许多类群尚未被描述的生物多样性丰富的热带地区⁴。然而，传统的微距摄影受限于景深较浅，无法使单张图像中的三维结构（如触角或翅膀）全部清晰呈现⁵。

为科学目的拍摄昆虫照片的努力可追溯到一个多世纪以前，早期的方法学描述强调了捕捉精细形态特征的固有困难⁶。尽管常规的微距摄影被广泛使用，但在高倍放大下可实现的景深较浅，这一限制仍然存在^7,8。该局限性使得记录触角、足或翅膀等三维结构变得困难，导致图像缺乏准确鉴定或形态学分析所需的分辨率。

数码摄影与图像处理技术的进步推动了显著发展。聚焦堆叠技术通过合并在不同焦平面拍摄的多张图像，生成完全清晰的合成图像，已成为一种尤为有效的手段⁹。通过将商业设备与低成本半自动解决方案进行比较，该技术在昆虫学领域的应用价值凸显，展示了其在模式标本大规模数字化中的潜力⁹。后续研究进一步探索了配备聚焦堆叠功能的紧凑型、低成本相机的应用，表明该方法可超越资金充足的机构，支持更广泛的数字化项目¹⁰。

聚焦堆叠——将不同焦平面拍摄的连续图像进行组合，以生成一个扩展焦距的合成图像——已成为一种实用的解决方案⁶。早期的比较研究⁷表明，即使是低成本的半自动系统也能接近商用显微镜的性能，但仍缺乏适用于资源有限实验室的标准化、可重复的实验方案。其他三维成像方法，如DISC3D⁸，虽可提供精确的模型，但需要专用硬件和复杂的重建软件，限制了其普及性。

本文介绍了一种针对昆虫标本优化的实验方案，可在图像质量、成本和便携性之间实现良好平衡。该系统整合了广泛可得的光学与机械组件，并结合严格的色彩校准及后期处理步骤。其适用场景涵盖博物馆数字化及半永久性野外工作站，使研究人员无需依赖专有设备或高成本的自动化显微镜，即可获得可重复的图像结果。
该研究通过提供一种经过验证的开放式工作流程，填补了方法学上的空白
强调透明性和可重复性。

方案

1. 设备设置

1. 设计一个模块化成像系统，将高端光学组件与价格实惠且广泛可得的设备相结合（补充文件 1）
2. 结合精密机械结构、可控照明和先进光学元件，在保持对不同昆虫尺寸和形态适应性的同时，实现高分辨率的焦点堆叠成像。
3. 使用以下核心组件。
   1. 相机
      1. 使用具有高动态范围的高分辨率全画幅数码相机，以精细捕捉形态学结构细节。
      2. 将相机安装在高度专用的对焦轨道上（补充文件 1）
   2. 光学系统
      1. 使用无限远校正的显微镜物镜，放大倍数如 5X、7.5X、10X 和 20X（补充文件 1），并安装于镜筒系统中。
      2. 对于较大的样本，配合使用超微距镜头以补充物镜配置。
      3. 根据需要配备不同放大级别的镜筒（补充文件 1）
   3. 照明系统
      1. 将两个影室闪光灯安装在后方直立位置，以提供稳定且强效的照明。
      2. 将两个高速闪光灯以一定角度置于前方，以实现短闪光持续时间和快速回电时间。
      3. 将光源安装在可调节支架上，以实现均匀、无阴影的照明（补充文件 1）。
      4. 在镜头前放置漫射器，以柔化光线并减少强烈阴影（补充文件 1）。
   4. 支撑系统
      1. 设置防震台，以最大限度减少图像采集过程中的振动。
      2. 使用三脚架支撑和黑色无反光背景，以减少振动和反射。
      3. 添加专用微距轨道，以在堆叠系统中稳定相机（补充文件 1）。
      4. 使用三轴旋转定位装置（补充文件 1），以精确对齐和定位样本。
      5. 使用精密微米级调节平台，进行精细的毫米尺度宏观调整。
   5. 对焦系统
      1. 通过专用控制单元和网线操作步进电机控制的对焦装置。
      2. 将移动步长调节至低至 0.2 µm，以确保焦点堆叠时精确的景深采样。
      3. 在成像极小样本时，使用圆柱形黑色隧道控制光路方向并减少反射（补充文件 1）。
      4. 使用触发器精确同步闪光灯与相机快门（补充文件 1）。
   6. 计算设备与配件
      1. 使用配备至少 128 GB 内存的高性能笔记本电脑进行图像处理。
      2. 使用高速存储卡读卡器、图形数位板和高精度鼠标，以加快后期处理速度。
      3. 携带两张大容量存储卡，以确保野外作业时有足够的存储空间。
4. 从多个制造商采购组件组装该系统，构建一个专为昆虫成像优化的定制混合式装置。

2. 颜色校准

1. 通过使用涂黑的墙壁包围相机装置，减少杂散光和色彩失真。
2. 使用6500 K的标准日光光源，以模拟自然日光并保持成像条件的一致性。
3. 执行相机校准。
   1. 使用标准色彩参考图卡对相机进行校准。
   2. 在与昆虫标本拍摄相同的日光平衡光照条件下拍摄色彩参考图卡。
   3. 使用色彩校准软件生成自定义色彩配置文件。
   4. 在后期处理过程中应用该自定义色彩配置文件，以校正镜头和照明引起的色彩偏差。
4. 执行显示器校准。
   1. 使用色彩管理设备对显示器进行校准。
   2. 使用色度计和配置文件生成软件对图像编辑显示器进行校准。
   3. 将显示器校准设置为伽马值2.2、白点D65，以匹配成像条件。
5. 保持此双重校准工作流程，以确保从图像采集到最终输出的色彩准确性。

3. 叠加

1. 将每个样本安装在可调节的支撑架上，以确保位置稳定。
2. 使用电动调焦装置获取图像。
3. 根据样本大小和所需的景深，将步进距离调整为 0.2 至 2 µm 之间。
4. 对每个样本，在焦距范围内采集 50 至 2,000 张图像。
5. 同步照明与相机曝光，以最小化运动模糊。
6. 将原始图像文件存储在存储卡上，并在采集完成后立即传输至处理计算机。

4. 软件

1. 将原始文件传输至图像管理软件进行初步整理。
2. 选择所有图像，并应用相机专用的色彩配置文件以保持色彩准确性。
3. 将图像导出为高分辨率的 TIFF 文件。
4. 在景深合成软件中处理 TIFF 文件。
5. 根据样本复杂程度测试可用的合成方法。
   1. 处理结构简单、均匀的样本时，使用基于对比度的平均法。
   2. 需要在清晰度与伪影抑制之间取得最佳平衡时，使用基于深度图的方法（补充文件 1）。
   3. 需要捕捉精细细节和复杂边缘时，使用基于金字塔的方法，同时注意监测晕影伪影。
6. 应用混合工作流程。
   1. 首先使用基于深度图的方法处理原始图像序列，生成一个整体清晰度高且色彩保真度强的中间合成图像。
   2. 保存第一个中间结果。
   3. 使用基于金字塔的方法重新处理原始图像序列，生成第二个突出边缘细节的中间合成图像。
   4. 保存第二个中间结果。
   5. 在景深合成软件中将两个中间结果作为新的图像序列加载。
   6. 再次应用基于深度图的方法，将两者合并为最终合成图像，结合两种方法的优势并最小化伪影。
7. 在图像编辑软件中进一步优化合成后的图像。
   1. 去除背景，校正伪影，并验证色彩校准。
   2. 进行细微的对比度和亮度调整，以提高形态可见性。
   3. 记录所有后期处理步骤，确保可重复性。
   4. 使用图形数位板以提高高级编辑过程中的精确度。
8. 在高级编辑过程中使用以下工具。
   1. 使用自由选区工具选择不规则区域，进行针对性编辑。
   2. 使用减光工具选择性地降低过曝或不均匀区域的亮度。
   3. 使用导航工具在精细编辑过程中移动和重新定位图像。
   4. 使用修复或校正画笔去除瑕疵、灰尘痕迹和轻微缺陷。
9. 在资源有限的条件下，高效生成完全清晰、达到发表质量的图像。
   （在此处插入 补充文件 1）

5. 准备与设置

1. 组装成像工作站
   1. 将减震光学平台放置在稳定的表面上。
   2. 将相机安装导轨置于平台中心位置。
   3. 使用刚性板适配器将数码相机机身固定在导轨上。
   4. 通过合适的镜筒适配器安装选定的显微物镜（5×–20×）或微距镜头。
   5. 安装两个后置和两个前置配有漫射器的光源，以实现均匀照明。
   6. 在镜头轴线下方直接安装样品支撑装置（XYZ平台或旋转支架）。
      ​注意： 暂停点：如果整个硬件装置被覆盖以防止灰尘污染，可长期保持组装状态。
2. 验证系统对准
   1. 确保光轴与样品平面垂直。
   2. 使用阶段测微计调节水平和垂直方向，直至反射光对称。
   3. 确认视场内照明均匀；根据需要重新调整漫射器。

6. 颜色校准

1. 设置照明和环境。
   1. 使用约 6500 K 的漫射光（相当于日光）。
      1. 通过在装置周围使用深色哑光表面，尽量减少环境反射。
   2. 颜色校准
      1. 在成像光源下拍摄 24 色块颜色参考图。
      2. 使用配套的校准软件生成相机配置文件。
      3. 在后续原始图像转换过程中应用此配置文件。
      4. 将显示监视器校准至 γ = 2.2 和白点 D65，以确保整个工作流程中颜色呈现的一致性。

7. 标本安装与聚焦

1. 标本制备。
   1. 将干燥或乙醇保存的昆虫固定在软质安装基底（如油泥）上。
   2. 根据所需的观察视角（背侧、侧侧、腹侧或前侧）调整标本方向。
   3. 将支撑物置于光轴正下方并居中定位。
2. 焦距堆叠间距的调整
   1. 使用最近和最远的清晰焦面确定焦距范围的起始与终止位置。
   2. 根据放大倍数设置步进移动距离，范围为 0.2 µm 至 2 µm。
   3. 同步图像采集触发信号，使照明光源在每次图像曝光时同步闪光。
   4. 根据标本大小和深度采集 50–2000 张图像序列。
      注意：暂停节点：可在序列之间安全暂停采集。

8. 图像处理

1. 转换并整理原始图像。
   1. 采集后立即将文件传输至本地计算机。
   2. 使用递增编号将每个图像序列归入独立的文件夹。
   3. 应用镜头和色彩校正配置文件，然后将图像导出为16位TIFF文件。
   4. 图像堆叠
   5. 在焦平面堆叠软件中打开TIFF序列。
   6. 为首个合成图像选择深度图算法（相当于“方法B”）。
   7. 可选：使用边缘增强算法（“方法C”）重新堆叠，并将两次输出结果合并，以在减少光晕的同时最大化清晰度。
   8. 以无损格式保存最终合成图像。
2. 图像后期处理
   1. 在图像编辑软件中打开合成图像。
   2. 使用选区和修复工具去除背景伪影和灰尘。
   3. 调整整体亮度和对比度，以增强形态特征的可见性。
   4. 记录每一次调整，以确保可追溯性。
      注意：暂停点：清洁阶段可后续继续，且不会造成数据丢失。

9. 质量保证与储存

1. 在100%放大倍率下检查最终图像，以确认不存在拼接错位或颜色偏移。
2. 将所有成像参数（放大倍率、步长、曝光时间、软件版本）记录在元数据表中。
3. 将原始文件、中间文件和最终文件存储在冗余硬盘中；并维护电子实验记录本。

结果

图像质量与分辨率的验证

在5×至20×的放大倍数下，焦点堆叠系统生成了完全清晰、高对比度的合成图像。计算得到的像素尺度在物空间中范围为0.76 µm（5×）至0.19 µm（20×），证实了对昆虫表皮及附肢的亚微米级结构细节具有足够的采样能力。由800至2000帧组成的代表性图像堆叠显示，平面内清晰度一致，且无光晕伪影。该方案保持了各帧间±0.2 µm以内的对齐精度。

有效分辨能力——通过可观察到的最小周期性结构估算——约为 4 µm，与所用物镜的衍射极限相匹配。这一对应关系表明，该系统在可见光成像的物理分辨率边界下运行。定量数值汇总于表 1，而表 2详细列出了预期的景深范围。

讨论

聚焦堆叠过程的最佳性能取决于以下三个因素：(i) 将装置完全与振动隔离，(ii) 以亚微米级增量精确校准聚焦轨道，以及 (iii) 一致的色彩校准。任何偏离这些参数的情况都会显著增加光晕形成和色彩偏移⁹。机械稳定性与标准化照明的结合是决定图像质量的最关键因素。

在系统优化过程中，探讨了故障排除方法及可能的改进措施。通过验证漫射器的对准情况并降低闪光强度的不对称性，纠正了照明不均的问题。通过更新聚焦控制器固件并确认线性步进系统的正确校准，解决了图像堆叠错位的问题。针对光源过热问题，在每完成1500次曝光后引入10分钟的冷却间隔，从而缓解了该问题。在野外适应性改进中，当无法获得防振台时，采用致密的石材或金属结合橡胶隔振材料构建便携式支撑结构；该配置在放大倍数不超过7.5×时表现令人满意[17.1]。其他改进措施包括实施自动采集脚本以及使用开源堆叠软件，从而显著缩短了处理时间并降低了软件授权成本¹⁰。

该系统的分辨率最终受限于衍射效应（在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
支撑台	优选三脚支撑	为整个装置提供稳定基础	150
防震台	定制	在图像采集过程中最大限度减少振动	3,200
圆柱形黑色隧道	定制	控制光线方向	350
减少小样本的反射
Novoflex CASTEL-MICRO 聚焦轨道（微距导轨）	步进电机–控制，控制单元，网线，欧规交流适配器	亚微米级精确对焦（0.2 µm 步进）；	3,000
自动控制相机移动
XYZ 旋转平台	可调支架	精确的样本对齐与定位	500
相机	Sony Alpha 7R IV（6100万像素全画幅）	高分辨率图像采集	3,000
照明	2× Godox SK300II	均匀、无阴影照明；	400
照明	2× Godox QT600II	高速闪光，闪光持续时间短	1400
闪光灯支架	3个可调支架	灵活调整灯光位置	100
光效调节器	柔光罩	柔化光线，减少强烈阴影	50
背景材料	“黑洞”绒布	消除反射，提供均匀背景	200
显微物镜	Mitutoyo Plan Apo 无限远校正：5×	高质量微结构放大	1,000
Mitutoyo Plan Apo 无限远校正：7.5×	2,000
Mitutoyo Plan Apo 无限远校正：10×	1,400
Mitutoyo Plan Apo 无限远校正：20×	5,000
镜筒系统	直接使用 Mitutoyo M-Plan 镜头（2x, 5x, 7.5x, 10x, 20x）连接相机	将显微物镜与相机耦合	400
转接环	Sony E卡口转 NOVOFLEX 通用卡口A	相机与光学系统的机械连接	300
微距镜头	Venus Optics Laowa 100 mm f/2.8 2× 超级微距 APO（Sony E卡口）	对较大样本进行高倍率成像	550
触发器	闪光触发器	同步闪光灯与相机快门	50
计算机	ASUS 或 Alienware 笔记本电脑，≥128 GB 内存，高性能处理器	图像处理与存储	3,000
存储介质	2× SD 256 GB，高速SD卡读卡器	安全的大容量图像存储与传输	200
配件	游戏鼠标	编辑与导航时实现精准操作	50
配件	Wacom One（绘图板）	图像清理与编辑时实现精细控制	500
总成本			26,800