利用互锁脉冲注射技术与显微外科血管修复构建高保真临床前小鼠脑转移模型

摘要

本研究通过颈动脉内短暂注射肿瘤细胞，结合Interlock脉动注射技术和显微外科修复，建立了高保真小鼠脑转移模型。via该方法可维持脑血流，防止颈总动脉闭塞，提供更优的临床前模型，显著提高肿瘤转移率并降低动物死亡率。

摘要

脑转移仍然是一个严重的临床问题。脑转移研究中的主要挑战之一是缺乏能够准确模拟转移过程的高质量模型，从而难以深入理解癌细胞如何在脑内定植的机制。传统的颈内动脉注射脑转移模型通常需要永久结扎颈总动脉（CCA），这会改变脑血流动力学，并破坏血脑屏障（BBB）的完整性。本方案介绍了一种建立高保真小鼠脑转移模型的优化方法。其核心创新在于采用“互锁脉冲注射”（Interlock Pulsatile Injection, IPI）技术进行肿瘤细胞递送，随后在穿刺部位进行显微外科动脉重建，以恢复颈总动脉的生理血流。与传统的颈总动脉结扎模型相比，IPI结合显微外科修复方法显著降低了围手术期死亡率（2.86% vs. 25.71%），并提高了脑转移建模成功率（94.12% vs. 65.38%）。IPI技术采用串联注射器装置，以最大限度减少颈内动脉注射过程中细胞反流。在完成肿瘤细胞灌注后，在体视显微镜下使用显微缝合技术对颈总动脉进行精细修复，从而避免永久性闭塞。该方法在肿瘤细胞进入时保留了原有的脑血流动力学状态和血脑屏障完整性，同时显著提高了手术成功率并降低了死亡率。转移性颅内病灶通过连续的生物发光成像和组织病理学方法得到验证。该方法为研究脑转移的病理生理机制以及开展临床前治疗评估提供了更优越的平台，能够更真实地再现转移过程。

引言

脑转移瘤是成人中最常见的恶性脑肿瘤，其发生频率约为原发性脑肿瘤的十倍¹。据估计，在系统性癌症患者中，有10%–20%会在疾病晚期发展为脑转移瘤，而脑转移是导致患者死亡的主要原因之一^1,2。尽管原发性癌症的治疗已取得显著进展，但脑转移瘤患者的预后仍然较差，其一年生存率不足20%³。目前尚不清楚某些癌症为何以及如何发生脑转移。脑转移瘤的治疗面临巨大挑战，其原因在于其独特的生物学特性，包括血脑屏障（BBB）的存在、独特的脑部免疫微环境，以及肿瘤细胞与神经胶质细胞之间复杂的相互作用^4,5。

脑转移的药效学和发病机制研究在很大程度上依赖于能够精确模拟人类疾病过程的可靠临床前动物模型。目前广泛应用的脑转移动物模型主要基于颅内原位移植、静脉或尾静脉注射、心内注射或颈内动脉注射^6,7,8,9,10。然而，这些模型在模拟人类疾病进展方面存在不足，常常无法真实再现关键步骤，例如在生理血流条件下肿瘤细胞穿过完整血脑屏障（BBB）的外渗过程¹¹。静脉注射和心内注射导致脑部特异性肿瘤形成效率较低，且常引起广泛的颅外转移，导致动物在脑转移灶充分发展之前过早死亡¹²。传统的颈内动脉注射方法虽可提高颅内肿瘤形成率，但需要永久结扎颈总动脉（CCA）。这种结扎会改变脑部血流动力学，可能引起同侧脑区缺血，并破坏肿瘤细胞输送所必需的正常血流模式，从而影响肿瘤细胞在脑内的空间分布及其定植微环境^13,14。

能够更真实地模拟脑转移病理生理过程的高质量动物模型至关重要¹⁵。理想的脑转移模型应能重现整个转移级联过程，包括肿瘤细胞归巢至脑血管、穿过血脑屏障（BBB）的外渗过程，以及与脑微环境的动态相互作用¹⁶。高保真模型对于机制研究和治疗评估均具有重要意义⁶。然而，现有的颈动脉注射模型未能充分再现关键的生理条件，特别是正常脑血流的维持以及循环肿瘤细胞的自然分布。

为了克服现有脑转移前临床模型的局限性，基于IPI技术及显微外科动脉修复方法，建立了一种能够更准确地模拟转移级联过程的高保真动物模型。该方法在肿瘤细胞注射后实施短暂的动脉阻断，随后精细修复动脉穿刺部位，以恢复同侧颈总动脉（CCA）的正常生理血流。该策略不仅提高了模型的一致性和成功率，更重要的是通过维持天然的脑血流动力学，保护了血脑屏障（BBB）。通过最小化脑血流的干扰，改良的颈内动脉注射模型提供了一个高保真的研究平台，能够更真实地再现脑转移定植的自然过程，从而为研究脑转移机制及评估潜在治疗手段提供了更优的工具。

方案

所有动物实验均经中国科学院生物物理研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（批准号：SYXK2021124）。达到预设终点的动物均依照中国科学院生物物理研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）《动物安乐死指南》及《美国兽医协会动物安乐死指南》（2020年）¹⁷ 进行安乐死处理。

1. 单细胞悬液的制备

1. 将B16F10和4T1细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的完全RPMI-1640培养基中。
2. 在37℃培养细胞 °C，在含5% CO₂的湿润化培养箱中₂.
3. 手术前一天确认荧光素酶表达，并验证无支原体污染。
4. 手术当天，当细胞融合度达到80%时，先用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，再用0.25%胰蛋白酶在37℃消化不超过3分钟，收集细胞 °C.
5. 加入含10% FBS的RPMI-1640培养基以终止0.25%胰蛋白酶的消化作用。
6. 将细胞在300 × g离心 × g 孵育3分钟。用PBS洗涤细胞两次以去除残留血清，然后使用血细胞计数板进行计数。
7. 使用台盼蓝排斥法检测，以确认注射期间细胞活力维持在90%–95%。
8. 将细胞重悬于 PBS 中，浓度为 2 × 10⁶ 细胞/mL。注射前将细胞置于冰上保存。
   注意：可使用荧光素酶标记的 B16F10 和 4T1 细胞。本文以 B16F10 作为代表性示例。

2. 小鼠准备与围手术期准备

1. 使用 7–8 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠。
2. 在手术板下方放置加热垫以防止低体温。术前 30 分钟打开加热垫。
3. 使用高压灭菌器对所有手术器械、手术板和饲养笼进行灭菌。使用 75% 乙醇对体视显微镜和手术台进行消毒。
4. 无法通过高压灭菌的其他物品应使用紫外线照射和 75% 乙醇进行消毒（图 1A）。
5. 在麻醉前称量小鼠体重，并记录术前体重作为基线值。
6. 将 10 g 三溴乙醇加入离心管中，然后加入 10 mL 叔戊醇。振荡试管直至三溴乙醇完全溶解。
   注意：三溴乙醇可能引起不良反应，包括死亡；需密切监测麻醉深度。
7. 通过 0.22 µm 滤器过滤溶液，制备 100% 储存液。
8. 将 100% 储存液用 0.9% NaCl 生理盐水或稀释液稀释至 2.5% 工作液（1:40 稀释）。每次新配制的工作液均需在小鼠中测试其麻醉效果。
9. 通过腹腔（i.p.）注射 2.5% 三溴乙醇（剂量为 0.2 mL/10 g 体重）对小鼠进行麻醉。必要时，可追加原麻醉剂量三分之一的补充剂量以延长麻醉时间（图 1B）。
   注意：应根据体重调整麻醉剂量，并持续监测呼吸情况。
10. 通过施加轻微刺激（例如脚趾夹捏）并观察无运动反应，确认小鼠已完全麻醉。
11. 麻醉后剃除颈部区域的毛发，并进行脚趾剪切标记。
12. 涂抹眼膏以保护眼睛免于干燥。
13. 将小鼠置于手术板上，并用胶带固定四肢和上颌门齿（图 1C）。
14. 通过评估呼吸频率和夹捏反射来监测麻醉深度，确保小鼠在手术过程中无痛且保持不动。
15. 将动物随机分配至实验组，图像分析由对分组情况设盲的研究人员完成。

3. IPI 技术与显微外科修复的标准手术步骤

1. 用聚维酮碘溶液对颈部区域进行消毒，并在继续操作前让皮肤完全干燥（图1D).
2. 无菌手术巾覆盖小鼠，仅暴露颈部区域（图1E).
3. 使用无菌手术剪在颈部正中做一长约0.8–1 cm的切口，同时用精细镊子进行组织牵拉图2A).
4. 使用精细弯头镊子钝性分离浅筋膜及下方肌肉，以暴露右侧颈动脉鞘（图2B1, 图2C1).
5. 分离右侧颈外动脉（ECA）与颈动脉鞘，并结扎右侧 ECA 以防止细胞泄漏至颅外分支图2B2, 图2C2).
6. 仔细分离颈动脉鞘内的右侧颈总动脉，保留位于血管外侧及下方的迷走神经（图2C1).
7. 在分离出的右侧颈总动脉下方放置一小块橡胶手套和一个浸有生理盐水的棉球作为垫枕，以抬高并稳定血管。
   注意：抬高颈总动脉可稳定血管，便于准确穿刺和注射。图2B4, 图2C4).
8. 在棉球远端和近端的颈总动脉上各放置一个未扎紧且带有开放环的结，然后结扎近端的结图2B3, 图2C3).
9. 在远端未扎紧的结扎线附近的颈总动脉（CCA）上应用微血管夹，以暂时阻断 CCA 血流（图2B4, 图2C4).
10. 癌细胞植入
    1. 互锁穿刺
       1. 使用32G针头穿刺右侧颈总动脉的抬高段，针尖斜面朝上。
       2. 在保持穿刺部位不变的情况下，撤出初始注射器。
       3. 涡旋混匀癌细胞悬液，并吸取100 µ将液体吸入微量注射器中，确保不吸入气泡。
       4. 将微量注射器的针尖插入先前在穿刺部位形成的开口中 步骤 3.10.1.1 并保持稳定，不要开始注射，以确保在细胞输送前位置稳定（图2B5, 图2C5, 补充图1).
          注意：使用32G注射器进行穿刺，使用微升注射器进行注射，以确保定位稳定和给药可控。 补充图1 显示了两支注射器的参数。32G注射器的外径为0.22 mm，而微升注射器针头为0.26 mm，便于稳固插入并实现可控注射。
    2. 脉冲式注射（图2C5)
       1. 移除先前施加的微血管夹 步骤 3.9.
       2. 通过微量注射器将肿瘤细胞悬液注入颈内动脉。
       3. 采用脉冲式注射动作输送悬液，轻轻以小脉冲方式推进注射器活塞，而非持续施加压力。
       4. 根据以下任一标准进行悬浮液注射：心搏周期标准，即注射约1 µ每8个心动周期，根据颈内动脉远端搏动性逆流血流，注入细胞悬液；或依据注射速率标准，注入约1 µL/s，同时确保速率不超过60 µL/min
       5. 注射过程中监测血管。当悬液通过管腔时，若红色血管暂时变为透明，且穿刺部位周围无可见外渗，则表明给药成功。
       6. 注射完成后，小心撤出微量注射器。
       7. 立即以受控方式收紧远端结扎线，以封闭血管并尽量减少反流（图2B6, 图2C6).
          注意：脉冲式注射可减少过度灌注，并最大限度降低颅内压升高的风险。
11. 显微外科修复（图2B6, 图2C6)
    1. 使用10-0尼龙显微外科缝线以不漏水的方式闭合穿刺部位，缝针的进针点和出针点应紧邻缺损边缘，以最大限度减少血管渗漏并保持管腔通畅。
    2. 在高倍放大下将显微缝合针穿过血管壁的穿刺孔，并暂时不打结。
    3. 用肝素化生理盐水冲洗手术区域。
    4. 用两到三个方结固定缝线。
    5. 将缝线的游离端剪至约1–2 mm，以防止松脱，同时尽量减少异物负荷。
       ​注意：IPI 技术及显微外科修复的标准手术操作步骤见于 补充视频 1.

4. 恢复颈总动脉的血流

1. 逐渐松开近端结。
2. 冲洗管腔以清除任何可能的微小血凝块。在手术区域放置干燥的棉球以监测是否有过度出血。‌
3. 一旦确认穿刺部位无活动性渗出，小心松开远端结扎线以恢复颈动脉血流（图2B7, 图2C7).

5. 确认修复成功

1. 恢复搏动
   1. 观察CCA 是否有明显的搏动，以表明再灌注成功。
2. 验证通畅性与血管完整性​
   1. 检查修复部位，确保无狭窄，且管腔保持通畅，并与近端血管节段连续。

6. 伤口冲洗与缝合

1. 使用不含肝素的生理盐水充分冲洗手术区域，以清除碎屑和血凝块。
2. 采用连续缝合关闭皮肤切口。
   注意：保持手术区域湿润，所有操作应轻柔进行，以尽量减少组织损伤。

7. 术后护理

1. 液体支持：术后立即皮下注射 0.5–1 mL 温热的无菌生理盐水，以补偿围手术期的液体丢失。
2. 感染预防：若手术持续时间超过 40 分钟，需给予恩诺沙星（5 mg/kg，每日一次），连续使用 3 天。若手术时长少于 40 分钟，则无需使用抗生素。
3. 营养与 hydration：术后至少 1 周内提供水凝胶或软化食物，以确保充分的 hydration 和营养摄入。
4. 每日监测：每日进行健康评估，观察是否存在转圈行为、神经功能缺损、伤口感染及体重下降等情况。
5. 预期术后病程：术后前 48 小时内，小鼠可能出现活动减少、轻度竖毛及体重下降（最多达术前基础值的 15%），随后逐渐恢复。
6. 镇痛处理：术后每日皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），连续 2–3 天，以缓解疼痛并促进恢复。

8. 动物模型成功建立的评估标准

1. 体重监测
   1. 每天称量小鼠体重并记录。
2. 临床评估
   1. 每天评估临床体征，包括姿势和转圈行为。
3. 生物发光成像
   1. 打开成像仪器和计算机的电源开关。
   2. 启动生物发光成像分析软件（版本 4.7.2），点击“Initialize”以初始化生物发光成像系统。
   3. 在初始化过程中，成像系统控制面板上的温度状态指示灯呈红色。待温度状态指示灯变为绿色后，方可进行成像。
   4. 成像前 6 小时禁食禁水，以防止麻醉期间发生误吸。
   5. 配制浓度为 10 mg/mL 的成像底物，操作全程避光。按 10 µL/g 体重计算注射体积。
   6. 固定小鼠以进行成像。用 75% 医用酒精清洁左下腹部注射部位。
   7. 用棉签轻轻刺激注射部位的腹壁，以降低针头刺入肠道的风险。
   8. 穿刺腹壁后，轻柔回抽确认无血液，然后缓慢注射 in vivo 成像底物。
   9. 注射底物后 4 分 30 秒，将小鼠转移至麻醉诱导室。
   10. 使用 3% 异氟烷诱导麻醉。待翻正反射和夹趾反射消失后，将异氟烷浓度降至 2% 维持麻醉。
   11. 将麻醉后的小鼠置于成像室中，确保鼻罩完全覆盖口鼻。牢固关闭成像室门。
   12. 在成像系统控制面板中，选择“Luminescent”作为成像模式。手动设置曝光时间为 60 秒。选择“Photography”、“Overlay”和“Alignment Grid”。
   13. 设置视野为 D，用于同时成像三只小鼠。调整成像高度至 1.5 cm。激发滤光片选择“Block”，发射滤光片选择“Open”。
   14. 注射底物后 10 分钟，点击“Acquire”以采集图像。
   15. 图像采集完成后，进入工具面板并选择“ROI Tools”。使用“Circle”工具划定感兴趣区域（ROI），然后点击“Measure ROIs”以获取定量数据。
4. 组织学分析
   1. 在实验终点采集脑组织并进行组织学分析。
   2. 通过苏木精-伊红（H&E）染色识别并确认转移病灶。

9. 人道终点

1. 为确保动物福利并符合伦理标准，已设定预先规定的安乐死终点作为立即实施安乐死的依据。
2. 小鼠通过吸入二氧化碳（CO₂）实施安乐死，随后采用颈椎脱位作为辅助的物理方法以确认死亡。
3. 若出现以下任一情况，应立即实施安乐死。
   1. 神经系统功能障碍
      1. 运动功能障碍：共济失调（步态不稳、摇晃）、转圈行为、瘫痪、偏瘫或震颤。
      2. 行为或意识改变：嗜睡、昏睡或昏迷。
      3. 颅内压增高征象：异常姿势（例如弓背提示痛苦）或头倾斜。
      4. 癫痫发作：全身性或局灶性惊厥。
   2. 体重及生理功能变化
      1. 体重减轻超过20%，或因肿瘤负荷或严重虚弱导致无法自主进食或饮水。
      2. 呼吸困难（张口呼吸或急促喘息）或尿失禁/粪失禁。
   3. 肿瘤状态
      1. 一旦发现与肿瘤相关的溃疡、感染或坏死，应立即终止实验。
   4. 最大耐受肿瘤负荷
      1. 小鼠每周接受两次生物发光成像。
      2. 一旦颅内肿瘤信号进入指数增长阶段（例如连续两次成像期间信号翻倍），则将神经系统监测频率增加至每日两次。
      3. 一旦出现共济失调或癫痫发作，无论生物发光信号数值如何，应立即实施安乐死。

结果

生物发光成像与定量分析
根据标准化的手术方案，优化后的小鼠脑转移模型在术后连续的活体成像中显示出稳定的颅内生物发光信号。图3A所示为颈动脉内接种后4周内的连续活体生物发光成像结果，图3B为定量分析结果，显示转移性B16F10细胞在脑微环境中增殖。术后体重监测显示，与PBS对照组相比，荷瘤小鼠体重进行性下降（图3C）。Kaplan–Meier生存分析进一步表明，B16F10注射组小鼠生存期缩短（图3D）。

脑组织样本的大体形态学检查
图 3E 展示了来自B16F10小鼠脑转移模型的福尔马林固定、石蜡包埋脑组织块的大体形态学检查及冠状面切片结果。低倍镜（4x）下苏木精-伊红...

讨论

能够准确模拟脑转移的稳健的临床前模型，对于阐明其病理生理机制和评估治疗效果至关重要。传统的颈内动脉注射模型需要结扎颈总动脉（CCA），这会以非生理方式改变脑血流，可能引发同侧缺血性损伤并破坏血脑屏障（BBB）^9,11,15,16。该模型存在三个主要局限性：单注射器注射导致肿瘤细胞反流，从而降低肿瘤形成率；持续注射引起较高的术中死亡率；以及因颈动脉结扎而无法准确再现转移过程。为克服这些局限性，本研究结合优化的颈内动脉注射技术与显微外科动脉修复，建立了一种高保真、可重复的脑转移模型，从而维持了生理性的脑血流动力学和血脑屏障完整性。

在传统模型中，肿瘤细胞递送 通过 单注射器连续注射法会导致明显的反流，尽管进行了技术改进，反流仍是模型失败的主要原因（图 4D...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带针10-0显微外科缝合线	Lingqiao	2650798	用于修复颈总动脉穿刺部位的显微外科缝合线
100 µL微量注射器	Bolige Tools	100UL	用于锁孔脉冲注射过程中递送肿瘤细胞的微量注射器
100 µL移液器	Eppendorf	3123-000250	用于手术区域生理盐水冲洗的移液器
32G 1 mL胰岛素注射器	Kindly	YY0497	用于创建初始动脉穿刺部位的胰岛素注射器
4-0丝线缝合线	Ethicon	W501	用于关闭皮肤切口的缝合材料
4T1乳腺癌细胞系	来源于中国科学院生物物理研究所王升殿实验室	CRL-2539	用于颈动脉内脑转移建模的肿瘤细胞系
75%乙醇	Annjet	Q/371402AAJ008	用于清洁注射部位的消毒剂
7–8周龄雄性C57BL/6J小鼠	Charles River Laboratories	1.10011E+17	用于B16F10脑转移模型的实验动物
8周龄雌性BALB/c小鼠	Charles River Laboratories	1.10011E+17	用于4T1脑转移模型的实验动物
弯头镊	Kewo Tools	—	用于组织解剖和血管操作的显微外科镊
B16F10黑色素瘤细胞系	来源于中国科学院生物物理研究所王升殿实验室	CRL-6475	用于颈动脉内脑转移建模的黑色素瘤细胞系
生物发光成像分析软件	Living Image（版本4.7.2）	—	用于分析生物发光成像数据的软件
DMEM	Xigong Bio Tech	M1805	用于肿瘤细胞维持的细胞培养基
恩诺沙星（抗生素）	MCE	HY-B0502	用于术后感染预防的抗生素
伊红Y溶液	Beyotime	E301879	用于伊红染色的组织学染色试剂
眼膏	Baiyunshan	H44023089	麻醉期间用于保护眼睛的眼科药膏
胎牛血清（FBS）	Pan Sera Tech	ST30-3302	细胞培养基中的血清补充剂
GraphPad Prism	版本4.7.2	—	用于生存曲线和定量数据分析的统计分析软件
苏木精溶液	Beyotime	C0105S	用于苏木精染色的组织学染色试剂
异氟烷	H.F.Q. Biotechnology	101357015	成像过程中使用的吸入性麻醉剂
IVIS Spectrum活体成像系统	Lumina Series III	—	用于活体生物发光成像的成像系统
美洛昔康（镇痛药）	齐鲁动物健康	150252467	用于术后镇痛的非甾体抗炎药
显微外科剪刀	Kewo Tools	—	用于组织解剖的显微外科剪刀
微型血管夹	Zheyong Tools	200521	用于暂时阻断颈总动脉的微血管夹
持针器	Jiangxin Tools	1420 20Cr13	用于操作显微外科缝合线的外科器械
多聚甲醛（4%）	中盛万达科技	20240411	组织学分析前用于脑组织固定的固定剂
青霉素	Gibco	1758-9324	用于细胞培养的抗生素
聚维酮碘溶液	Sihuanpai	Q/PGSHW0009	用于外科皮肤消毒的抗菌溶液
RPMI-1640培养基	Xigong Bio Tech	12-115F	用于肿瘤细胞生长的细胞培养基
Scilogex混匀仪	Scilogex	MX-S	用于均质化肿瘤细胞悬液的涡旋混合器
蒸汽指示胶带	3M-Comply	1322-24MM	用于高压灭菌外科器械的灭菌指示剂
体视显微镜	Olympus	SZ61	用于显微外科手术过程中可视化的显微镜
蔡司Stemi 508体视显微镜	Zeiss	Stemi 508	用于高倍放大手术可视化的体视显微镜
无菌生理盐水（0.9%）	科伦	25M14D07	用于维持手术区域湿润的无菌冲洗液
链霉素	Gibco	1758-9319	用于细胞培养的抗生素
手术单	大方	001-2016	用于隔离手术区域的无菌单
外科手套	Ansell Medi-grip	210-64005	手术过程中使用的无菌手套
三溴乙醇	Sigma-Aldrich	MKBH0634V	用于手术的注射用麻醉剂
超声多普勒	Mindray S7 SCI	—	用于评估颈总动脉血流的高分辨率超声系统