一种用于通过液相色谱-质谱法分析精英拳击运动员运动诱导代谢变化的标准化代谢组学方案

摘要

本方案描述了一种基于液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法（LC-QTOF-MS/MS）和多变量数据分析的标准化血清代谢组学工作流程，用于分析精英男性拳击运动员在急性期及短期恢复期间相关的代谢变化。

摘要

高水平拳击运动会引起快速的代谢变化，而这些变化无法通过常规生理学测量手段完全捕捉。本研究采用基于液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法（LC-QTOF-MS/MS）的非靶向血清代谢组学标准化分析流程，对七名男性精英拳击运动员在实战训练前、实战训练后即刻以及实战训练后24小时采集的样本进行了分析。该流程包括标准化样本采集、混合质控监测、代谢物谱分析、多变量统计分析以及代谢通路解析。急性实战训练与糖酵解和糖异生相关代谢物的变化有关，而24小时时间点则与硫代谢相关。

磷脂酰肌醇 PI(16:0/18:2(9Z,12Z)) 能够显著区分拳击训练后即刻状态，而硫代硫酸盐则与24小时恢复期状态相关。这些结果支持在本研究的七名男性精英拳击运动员队列中，采用该工作流程对运动相关的代谢变化进行可重复的特征分析。该方案适用于小样本队列的急性运动及短期恢复研究，强调可重复的样本处理、混合质控监测以及可解释的下游分析。

引言

高水平拳击运动的特点是进行三轮、每轮2分钟的高强度对练，其能量供应依赖于无氧代谢与有氧代谢的共同作用，并引发能量底物、氧化应激介质以及与组织修复相关代谢物的快速变化。传统的评估方法（如血乳酸和心率）仅能捕捉孤立的生理终点指标，无法揭示从“对练前基线 → 对练后急性应激 → 24小时恢复期”这一过程中系统性、相互关联的代谢变化。

基于液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱技术的非靶向代谢组学能够全面分析生物样本中的小分子代谢物，从而克服这一局限性。该方法通常可检测到数千个代谢峰，并通过与经过审编的数据库整合，注释出数百至数千种代谢物^1,2,3。该策略能够揭示传统方法难以捕捉的精细代谢动态变化，但目前针对拳击运动的代谢组学研究缺乏标准化：研究常未采用受控的模拟对抗方案、严格的质控（QC）步骤或长期恢复时间点的监测，导致结果不可重复，并限制了其在训练或恢复策略中的转化应用^4,5。

本文介绍了一种基于液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法（LC-QTOF-MS）并针对优秀拳击运动员优化的标准化代谢组学工作流程，用于捕捉急性运动反应及延迟性恢复过程。该方案包含三个关键时间点（实战训练前 [T0]、实战训练后即刻 [T1]、实战训练后 24 小时 [T2]），以区分短暂性应激与持续性适应^6,7,8。关键技术要素包括：（1）控制实战训练强度（达到最大心率的 80–85%），以确保运动强度的一致性^7,9；（2）采用高分辨液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF）技术，实现对血清中低丰度代谢物的高灵敏度检测^2,3,10；（3）结合多变量与单变量分析方法，包括主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）以及成对统计检验，以鉴定对运动有响应的代谢物^6,8,11；以及（4）使用单一混合血清质控样本（将所有研究样本等体积混合），进行多次进样，以评估仪器信号漂移情况下的稳定性¹²。

本方案可能适用于其他高强度、短时间的运动项目（例如短跑和摔跤），但此类适用性需在特定运动项目的群体中进行验证。在本研究中，该工作流程为识别精英男性拳击运动员的压力与恢复代谢标志物提供了初步框架。该工作流程最适合用于基于血清的非靶向代谢组学，对特征明确的小规模运动员群体开展急性运动及短期恢复的对照研究。若无额外验证，该流程直接外推至其他运动项目、女性运动员、大规模异质性人群或长期适应性研究时，可能不太适用。

该研究旨在表征精英拳击对练所引起的血清代谢变化，并区分对练后急性期反应与24小时恢复期相关的变化。研究假设急性对练主要影响能量代谢，而24小时恢复期则与氧化还原平衡及组织修复相关的代谢物变化有关。整体实验流程见图1。

方案

所有操作均须依照首都体育学院人类研究机构伦理委员会的批准进行（批准编号：2025A005）。

警告：将所有人类血液标本视为可能具有传染性。佩戴手套、实验服和眼部防护装备。静脉采血、血清处理及废弃物处置应遵循机构的生物安全规程。样本操作后应对工作表面进行去污染处理。

警告：甲醇、乙腈和甲酸为危险化学品。请在经认证的化学通风橱中进行溶剂配制、提取和复溶操作。避免皮肤接触和吸入。将溶剂废液收集于经批准的容器中。

1. 研究参与者招募与准备

1. 招募7名年龄在20至28岁之间、参加60–75公斤级别比赛的优秀男性拳击运动员。
2. 确认每位参与者至少具有5年专业训练经验，且无代谢性疾病史。
3. 排除在过去6个月内有肌肉骨骼损伤的参与者。
4. 要求参与者在测试前3天遵循标准化饮食，其中碳水化合物占55%，蛋白质占25%，脂肪占20%。
5. 要求参与者在测试前48小时内避免进行强度达到或超过最大心率60%的剧烈运动。
6. 要求参与者在采血前禁食12小时，禁食期间允许饮水。
7. 在实战训练前1周通过递增负荷运动试验测定最大心率。
8. 每3分钟增加跑步机速度1 km/h，直至力竭；利用测得的最大心率确定实战训练的目标强度。

2. 对打实验方案及血清样本采集

1. 准备一个标准的 6 × 6 米拳击台、16 盎司拳击手套和胸带式心率监测器。
2. 进行标准化的 10 分钟热身，包括以 8 km/h 的速度慢跑 5 分钟、动态拉伸 3 分钟和空击练习 2 分钟。
3. 按以下方式执行对练方案。
   1. 进行三轮对练，每轮持续 2 分钟。
   2. 根据体重级别和技术水平匹配对练对手。
   3. 每轮之间允许 1 分钟的休息间隔。
   4. 在整个训练过程中每 30 秒监测一次心率。
   5. 调整对练强度，使心率维持在最大心率（MHR）的 80%–85%。
   6. 若心率超过最大心率的 90%，则暂停对练；待心率恢复至目标范围后方可继续。
4. 在三个时间点采集血清样本，具体如下。
   1. 热身后 30 分钟，使用一支 8 mL 血清分离管（SST）从肘前静脉采集 5 mL 静脉血，作为 T0 时间点样本。
   2. 最后一轮对练结束后 5 分钟内，使用新的 SST 管从同一静脉采集 5 mL 静脉血，作为 T1 时间点样本。
   3. 在与 T0 相同的时间点，使用新的 SST 管采集 5 mL 静脉血作为 T2 时间点样本。确保受试者在 T2 前遵循与 T0 相同的禁食和活动限制。
5. 按以下步骤处理血液样本。
   1. 采集后 1 小时内，将每支 SST 管在 4 °C 条件下以 11000 × g 离心 15 分钟。
   2. 将上层血清层中的 2–3 mL 转移至 1.5 mL 冻存管中。
   3. 立即将冻存管置于 -80 °C 保存。
   4. 每个样本的冻融循环次数不得超过两次。
6. 制备混合质控（QC）样本。
   1. 在制备混合 QC 样本前，将全部 21 份研究血清样本（来自 7 名受试者的 T0、T1 和 T2 样本）置于冰上解冻。
   2. 从每份研究样本中取等量分装，转移至同一支 1.5 mL 离心管中。
   3. 从每份样本中各转移 20 µL，最终获得总体积为 420 µL 的混合 QC 样本。
   4. 将混合 QC 样本涡旋振荡 10 秒。
   5. 在 LC-QTOF-MS 分析过程中，使用该混合 QC 样本进行重复进样，以监测仪器稳定性和信号漂移。

3. 从血清样本中提取代谢物

1. 从 -80 °C 取出冷冻的血清样本（T0、T1、T2 和 QC），在冰上解冻 30 分钟，并对每个样本涡旋振荡 10 秒。
2. 用移液器将 100 µL 血清转移至一个 1.5 mL 低蛋白结合力的微量离心管中。加入 500 µL 冰冷的提取溶剂（甲醇:乙腈 = 1:1, v/v）。涡旋振荡 30 秒。
   1. 提取过程中不得添加内标。在最终确定的实验流程中，不得应用基于内标的提取校正或下游归一化方法。
3. 将离心管置于冰水浴中，在 4 °C 条件下以 300 W 和 40 kHz 超声处理 10 分钟。随后将离心管在 -20 °C 孵育 1 小时，以沉淀蛋白质。
4. 在 4 °C 条件下以 13200 × g. 离心 20 分钟。转移约 450 µL 上清液至新的微量离心管中，沉淀物作为危险生物废弃物丢弃。
5. 在真空浓缩仪中，于 37 °C 和 -0.09 MPa 条件下干燥上清液 45 分钟，或直至完全干燥。
6. 用 100 µL 乙腈:水（1:1, v/v）重新溶解干燥的提取物。涡旋振荡 30 秒。
   注：选用乙腈:水（1:1, v/v）是因为其与本实验流程中使用的反相色谱柱兼容，并且在初步测试中未产生可见沉淀。
7. 将重悬后的溶液在 4 °C 条件下以 13200 × g. 离心 15 分钟。转移约 90 µL 上清液至配有 200 µL 插件的 LC-MS 玻璃小瓶中，并密封小瓶。

4. 液相色谱-质谱检测

1. 在液相色谱系统中安装适用于血清代谢组学的反相色谱柱（参见材料表）。将色谱柱温箱设置为 40 °C。
2. 将流动相 A 配制为含 0.1% (v/v) 甲酸的超纯水。将流动相 B 配制为含 0.1% (v/v) 甲酸的乙腈。
3. 使用 0.22 µm 滤膜过滤两种流动相。
4. 设置流速为 400 µL/min，进样体积为 5 µL。
5. 采用以下梯度程序：0.0–0.5 min，95% A 和 5% B；0.5–5.5 min，线性梯度变为 50% A 和 50% B；5.5–9.0 min，线性梯度变为 5% A 和 95% B；9.0–10.5 min，保持 5% A 和 95% B；10.5–12.0 min，恢复至 95% A 和 5% B 并重新平衡。
6. 将液相色谱系统与配备电喷雾电离源的高分辨质谱仪联用。
7. 在正离子模式和负离子模式下分别进行数据采集。
8. 在正离子模式下，设置毛细管电压为 2500 V，锥孔电压为 30 V。
9. 在负离子模式下，设置毛细管电压为 -2000 V，锥孔电压为 25 V。
10. 设置脱溶剂气温度为 500 °C，脱溶剂气流速为 800 L/h，锥孔气流速为 50 L/h。
11. 在 m/z 50–1200 范围内采集数据，扫描时间为 0.2 s。
12. 通过使用低碰撞能量（0 V）和高碰撞能量（10–40 V）采集串联质谱数据。
13. 按以下顺序运行样品：一次重悬溶剂的空白进样；连续三次混合质控（QC）样品进样；所有研究样品，每五个研究样品后插入一次空白进样和一次 QC 进样；最后一次 QC 进样；以及最后一次空白进样。
14. 通过混合质控样本的相关性分析和主成分分析（PCA）聚类，在正负两种离子模式下评估数据质量和分析稳定性。
15. 若混合质控样本的相关系数大于 0.8，则认为在整个分析序列中具有可接受的分析稳定性。

5. 数据预处理与统计分析

1. 将原始的液相色谱-质谱数据文件导入数据处理软件，进行保留时间校正、去卷积、峰对齐和特征提取（参见材料表）。
   1. 选择第一次混合质控样本注入作为对齐参考。
   2. 使用所选软件的默认工作流程进行保留时间校正、去卷积和峰对齐。保留时间容差设为 ± 0.1 分钟，质量容差设为 ± 5 ppm。
   3. 进行峰提取，并保留至少在一个组中出现在至少 80% 样本中且强度大于 1000 计数的特征。
   4. 在任一离子模式下均不应用额外的预处理后归一化。
   5. 导出包含 m/z、保留时间及峰面积值的已处理特征表。
   6. 对所有保留的峰强度进行 log2 转换。
   7. 对缺失值进行填补，使用每个特征最小正值的五分之一进行填充。
   8. 在进行多变量分析前，对每个特征进行均值中心化，并除以其标准差。
   9. 使用经过转换和标准化的矩阵进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、聚类分析和相关性分析。使用原始的已处理特征强度数据绘制丰度图。
2. 通过将特征与公共代谢组学数据库（包括人类代谢组数据库 HMDB、京都基因与基因组百科全书 KEGG 以及适用时的 LIPID MAPS）进行比对，注释代谢物。
   1. 根据前体离子质量误差、同位素分布以及串联质谱碎片匹配情况对每项注释进行评分。每项标准最高得分为 20 分。
   2. 前体离子质量误差窗口设为 100 ppm，碎片离子质量误差窗口设为 50 ppm。不设定固定的保留时间窗口。
   3. 仅保留总分不低于 40 分（满分 60 分）的注释，排除得分较低的注释。
3. 明确界定比较组如下：A = T0（赛前）、B = T1（赛后即刻）、C = T2（赛后 24 小时）。
4. 使用统计计算软件及相关分析包进行下游统计分析（参见材料表）。
   1. 在进行单位方差标准化后执行主成分分析（PCA），并可视化得分图。
   2. 构建 A 与 B、B 与 C、A 与 C 之间的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型。
   3. 当样本数量不少于 7 时，采用 7 折交叉验证；若样本数量少于 7，则将折数设为样本数。
   4. 进行 200 次置换检验以评估模型有效性。
   5. 通过以下阈值筛选差异代谢物：倍数变化（FC）≥ 2 或 FC ≤ 0.5，投影中变量重要性（VIP）≥ 1，t 检验 P. < 0.05。
   6. 生成成对比较的火山图及相关统计图形。
   7. 使用 log2 转换并经单位方差标准化的矩阵生成热图。
   8. 生成相关性热图，显著性阈值设为 P ≤ 0.05，并显示最多 20 种代谢物。
   9. 在进行 k 均值聚类前确定最优聚类数。在单位方差标准化后执行 k 均值聚类。
   10. 基于原始的已处理特征强度数据生成丰度柱状图。
   11. 生成维恩图以总结成对比较间的重叠情况。
   12. 对选定的代谢物进行受试者工作特征（ROC）分析，并通过曲线下面积（AUC）评估诊断性能。
5. 使用适当的生物信息学软件包中的通路富集功能，将差异代谢物映射到 KEGG 通路（参见材料表）。
   1. 解释 P. < 0.05 的通路。最终分析记录中未报告多重检验校正。

结果

LC-QTOF-MS/MS 数据的质量控制（QC）验证

为评估信号稳定性和重现性，在两种离子模式下均对混合的质控（QC）样本进行了重复进样分析。在两种离子模式下，混合QC样本进样之间的Spearman相关系数均超过0.8，表明在整个分析序列中仪器性能稳定。对所有研究样本和QC进样的主成分分析（PCA）显示，QC进样点聚集紧密，且无明显离群值，说明分析稳定性可接受（图2）。未观察到QC分散范围扩大或空白样本显著残留现象；若出现任一情况，均提示分析性能不理想，需重新进样或剔除该批次数据。综上，这些结果证实该分析流程在两种离子模式下均表现良好。

不同时间点的全局代谢差异

主成分分析显示，T1 与其他两个时间点有明显分离，而 T0 与 T2 部分重叠（图 2）。这些结果表明，急性对抗训练引起了最...

讨论

本标准化工作流程描述了在小规模受控队列中，精英拳击手实战训练及短期恢复期间相关的代谢物变化。混合质控样本（pooled-QC）的重复进样、基于质控的相关性分析、主成分分析（PCA）聚类以及多变量分析共同证明了分析过程具有可接受的稳定性。该方案的成功主要依赖于四个因素：将实战训练强度维持在最大心率的80%–85%之间，血液样本在采集后1小时内完成处理，每个样本冻融次数不超过两次，以及通过重复进样混合质控样本对分析序列进行监控。在本数据集中，混合质控样本的相关系数>0.8、主成分分析得分图中质控样本紧密聚类，以及无明显空白样本残留，均表明方法性能良好。若混合质控样本在主成分分析中显示离散范围扩大、混合质控相关系数降至0.8以下，或出现明显的空白残留，则应重新评估分析序列，并对受影响的样本或批次重新进样或予以剔除。与先前版本相比，当前版本与实际的预处理流程及基于混合质控的质量评估保持一致，且未应用额外的预处理后标准化方法。

在不同时间点观察到的代谢变化与能量代谢、氧化还原平衡以及恢复相关过程的改变一致。急性对抗训练与乳酸和硫代硫酸盐升高以及PI(16:0/18:2(9Z,12Z)...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂	乙腈	Merck	LC-MS 级，CAS 75-05-8
试剂	甲醇	Merck	LC-MS 级，CAS 67-56-1
试剂	甲酸	TCI	LC-MS 级，CAS 64-18-6
耗材	VACUETTE TUBE CAT 血清凝块激活管	Greiner Bio-One	8 mL 血清凝块激活管
耗材	Nalgene 冻存管	Thermo Fisher Scientific	1.5 mL，外螺纹
耗材	Protein LoBind 管	Eppendorf	货号 0030108442，1.5 mL
玻璃器皿	带插件的螺口玻璃小瓶	Agilent	2 mL 小瓶，含 200 μL 玻璃插件；插件货号 5183-2090
耗材	Millex-GP 滤器	Merck	货号 SLGP033RS，0.22 μm 膜
仪器	定制 6×6 米拳击台	Muay Thai Sport	6 × 6 米训练用拳击台
耗材	Pro Style 2 拳击手套	Everlast	16 盎司
仪器	Polar H10	Polar	胸带式心率传感器
仪器	quasar	h/p/cosmos	电动跑步机
仪器	Centrifuge 5425 R	Eppendorf	制冷微量离心机
仪器	Bransonic CPX2800	Emerson / Branson	40 kHz 数字超声波清洗仪
仪器	Savant SpeedVac SPD1030	Thermo Fisher Scientific	集成式真空浓缩仪
仪器	VWR Mini Vortex Mixer	Avantor / VWR	货号 10153-688
仪器	TSX ULT 冰箱	Thermo Fisher Scientific	型号 TSX50086A
仪器	ACQUITY UPLC I-Class PLUS	Waters	UHPLC 系统
仪器	Xevo G2-XS QTof	Waters	QTOF 质谱仪
仪器	ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱	Waters	部件号 176001132，1.8 μm，2.1 × 100 mm
软件	MassLynx	Waters	版本 4.2
软件	Progenesis QI	Waters	版本 2.3
软件	R	R 统计计算基金会	版本 3.6.1
软件	prcomp	base R	Base R 函数
软件	ropls	Bioconductor	R 软件包
软件	pheatmap	CRAN	R 软件包
软件	corrplot	CRAN	R 软件包
软件	kmeans	base R	Base R 函数
软件	NbClust	CRAN	R 软件包
软件	venn	CRAN	R 软件包
软件	MetaboAnalystR	CRAN / Xia Lab	版本 1.0
软件	pROC	CRAN	版本 1.15.0
软件	clusterProfiler	Bioconductor	Bioconductor 软件包
数据库	人类代谢组数据库（HMDB）	HMDB	在线数据库
数据库	京都基因与基因组百科全书（KEGG）	KEGG	在线数据库
数据库	LIPID MAPS	LIPID MAPS	在线数据库