用于活细胞成像的通用压力加载装置，在持续生理机械应力条件下

摘要

本文所述的压力加载装置可实现对培养细胞的延时光学成像，并与标准细胞培养皿和倒置显微镜兼容。利用该装置，已证实肿瘤组织的静水压微环境可增强钙信号转导，为研究肿瘤微环境中机械信号转导提供了可行的实验平台。

摘要

本方案描述了一种可实现对贴壁细胞在持续静水压刺激过程中进行实时显微观察的静水压加载装置，该装置兼容市售的3.5 cm细胞培养皿。该设备由铝制底座、光学透明的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）盖板、集成于盖板上的气体进出端口以及一个密封的观察窗口构成，形成一个密闭的培养腔室。通过连接受控气源，该装置可在维持稳定静水压（0–200 kPa，可调）的同时，支持连续的相差或荧光成像。利用该静水压加载装置，可记录压力诱导的细胞表型及行为变化（如形态、增殖和迁移）的剂量依赖性效应。此外，还可实时记录荧光信号。本文中，通过倒置荧光显微镜结合延时成像技术，观察并量化了乳腺癌MDA-MB-231细胞和宫颈癌HeLa细胞中由压力触发的Ca^2⁺信号异质性与动态变化。该平台将力学加载与活细胞成像相结合，克服了传统终点检测系统的局限性，为力生物学研究提供了一种通用工具。

引言

许多细胞、组织和器官在其生理过程中会经历持续或间歇性的压缩力¹。例如，肺泡细胞在呼吸过程中会受到周期性加压²，而膀胱上皮细胞在储尿过程中则承受机械负荷³。在实体瘤等病理条件下，癌细胞会持续暴露于空间受限和间质流体压力升高所产生的压缩力中⁴。类似地，在半月板退变和肺纤维化等其他疾病中，半月板细胞⁵和肺泡上皮细胞⁶也会因张力和基质刚度衍生的压力而经历持续的机械应力。

越来越多的证据表明，机械压力是细胞表型和行为的强有力调控因子^7,8。在非恶性细胞中，压缩应力可促进牙周干细胞的增殖，并通过侵袭性突起诱导破骨细胞融合⁹。相反，在癌症模型中，压缩作用表现出双重效应：它抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移，同时激活转录组重编程，从而促进化疗耐药性^10,11。此外，由高渗压力引起的体积压缩可导致细胞内拥挤，并通过液-液相分离（LLPS）促进蛋白质浓度和离子强度的重新分布，从而深刻改变细胞行为和命运。这种物理扰动可通过激活Wnt/β-catenin信号通路以及增强肠干细胞的自我更新能力，促进肠道类器官的扩增¹²。另外，在细胞核内，由体积变化诱导的LLPS通过协调转录起始、延伸和终止过程参与基因转录调控^13,14。

为了定量研究这些压力诱导的生物学效应，必须使用能够施加明确定义且均匀的压缩刺激的实验系统。对于培养的细胞 体外，其周围被水性介质包围，静水压作为一种主要且具有生理相关性的施加此类压缩力的手段，已被广泛用于研究细胞的机械转导¹⁵静水压力可提高碱性磷酸酶活性，并在无需添加成骨诱导因子的情况下加速人脂肪源性间充质干细胞的成骨分化¹⁶在非酒精性脂肪性肝病中，流体静压等机械力可在无明显纤维化的情况下导致门静脉高压，凸显其在组织异质性中的作用¹⁷尽管静水压在病理生理调节中起着重要作用，但针对静水压的机制研究面临一个关键限制：传统的压力舱无法在刺激过程中实时观察活细胞。大多数实验系统仅允许终点分析，从而掩盖了机械转导事件（如Piezo1的机械激活、Ca²⁺²⁺ 流异质性以及细胞骨架的重排。这一空白限制了人们对静水压如何驱动肿瘤或其他组织中表型多样性的理解。

为解决这一技术空白，开发了一种新型实验平台，可借助光学成像实现对细胞在精确控制的静水压条件下实时响应的观测。该系统整合了三项关键功能：（1）施加0–100 kPa范围内持续的静水压 通过 可调节气体压力控制器（压力表量程为 0–200 kPa，施加的压力可根据生理参数进行选择。例如，根据已报道的不同细胞类型的压缩应力：人骨髓基质细胞为 8–16 kPa）¹⁸，12–24 kPa 用于血管平滑肌细胞¹⁹，以及人乳腺上皮细胞的0–15 kPa²⁰；（2）在施加静水压期间以高时间分辨率进行连续的活细胞成像；以及（3）在整个长时间实验过程中维持生理性的培养条件。该方法可直接可视化机械刺激所引发的动态过程，包括Piezo1通道的募集与激活、钙信号波动以及细胞骨架重塑。此外，该装置与大多数市售培养皿和倒置显微镜兼容，便于实验室广泛使用。实时监测这些细胞内生化事件的能力，为细胞如何感知并适应静水压提供了前所未有的见解。通过捕捉机械转导事件的时间序列——包括力的初始感知、下游信号传导及表型变化——该平台为研究静水压在生理与病理条件下影响细胞行为的基本机制提供了一个强有力的工具。

方案

1. 材料

1. 设备规格（见图1）
   1. 根据下述规格准备组件：
      底座：铝材（Ø 56 mm，高 15 mm），中央窗口 Ø 40 mm。
      盖子：聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，Ø 56 mm），含：6 × M3 螺纹孔、鲁尔锁气体接口、硅胶垫圈（内径 25 mm，外径 32 mm，厚度 0.8 mm）
      ​压力调节器：（0–200 kPa 范围）
2. 细胞与试剂
   1. 本研究中使用 MDA-MB-231 和 HeLa 细胞。使用 L-15 培养基、RPMI 1640 培养基、新生牛血清（NCS）、1% 抗生素-抗真菌溶液以及钙离子成像探针用于细胞培养和 Ca²⁺ 标记。

2. 设备准备

1. 制造
   1. 定制本研究的核心部件。根据规格精密加工铝制底座和PMMA盖板（见图1和补充图1）。
   2. 裁剪硅胶垫圈，并加工至所需尺寸。
      ​注意：PMMA材料的光学透光率足以满足标准透射光成像需求。所有部件均可灭菌且具有生物相容性，适用于后续细胞培养实验。本装置对加工公差无特殊要求（本研究中采用±0.1 mm的公差）。
2. 灭菌
   1. 将底座（铝制）在121 °C条件下高压蒸汽灭菌20分钟。
   2. 将盖板（PMMA）用75%乙醇擦拭后，进行紫外线灭菌30分钟。
   3. 将硅胶垫圈在121 °C条件下高压蒸汽灭菌20分钟。

3. 细胞处理

1. 细胞培养
   1. 将细胞以30%–70%的融合度接种于35 mm培养皿中，在37 °C、5% CO₂的CO₂培养箱中，使用RPMI-1640或L15培养基（添加10% NCS）培养24小时。
   2. 进行细胞传代时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，并用完全培养基终止消化。当细胞融合度达到70%–80%时，用于重新接种。
2. Ca²⁺染色
   1. 移除培养基，然后在生物安全柜中用预热的Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞两次。
   2. 使用5 µM钙离子成像探针在无血清培养基中对细胞内Ca²⁺进行染色。在避光环境中37 °C孵育20分钟。
   3. 移除染料，用HBSS洗涤细胞三次，然后在无血清培养基中去酯化30分钟。

4. 装置组装（图2）

1. 将培养皿转移至压力舱的中央窗口，然后移除培养基。
2. 将灭菌的垫圈放入培养皿中。
3. 将盖子对准培养皿与垫圈的叠层结构。
4. 对角拧紧螺丝，先用手拧至感到阻力，再使用扭矩控制螺丝刀额外拧紧1.5圈。
5. 将硅胶气体管连接到鲁尔锁接头，并向装置中注入混合气体以检查是否漏气。
6. 断开硅胶气体管，使用5 mL无菌注射器通过鲁尔锁接头向细胞培养皿中注入新鲜培养基。

5. 加压载荷与成像

1. 将硅胶气体管路（内径 4 mm）从硅胶垫片上的鲁尔锁端口连接至数字压力计和气体罐。
2. 将组装好的装置固定在显微镜载物台上。
3. 校准压力。
   1. 使用压力计验证 0–200 kPa 范围的稳定性。
      ​注意：HeLa 细胞培养使用含 75% 氮气、20% 氧气和 5% 二氧化碳的混合气体。MDA-MB-231 细胞培养使用含 80% 氮气和 20% 氧气的混合气体。压力加载实验中所用气体类型可根据细胞类型、培养基类型或特定实验需求进行替换。所有组件均无型号限制，压力检测模块及其进气管路的尺寸可根据需要选择。
4. 通过数字压力调节器设定目标压力（例如 100 kPa）。
5. 当达到目标压力后，开始成像。
6. 成像
   1. 调节载物台，确认成像区域，并确保细胞处于焦平面。
   2. 使用配备 20× 物镜的倒置荧光显微镜获取染色细胞的荧光图像，参数设置如下：曝光时间 400 ms，时间间隔 5 s，总成像时长 10 min（FITC 滤光片：激发/发射波长 = 490/525 nm，截止波长 = 515 nm）。
   3. 在无压力条件下成像 10 min，以确认系统正常运行并获取基线信号数据。
   4. 打开气体阀门施加压力后，重新调节载物台高度以确保细胞聚焦，然后开始动态钙信号成像。
   5. 根据培养皿底部厚度和物镜的工作距离选择合适的物镜。选择适当的曝光时间，以便在避免过度光漂白和光损伤的同时监测钙信号振荡。
   6. 观察其他动态信号时，应根据探针类型和实验要求调整参数。

6. 故障排除

1. 有关故障排除建议，请参阅表 1。

7. 统计分析

1. 所有数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。使用 GraphPad Prism 软件（USA）通过非配对 Student t 检验比较两组之间的结果。当 **p < 0.01、***p < 0.001 或 ****p < 0.0001 时，认为差异具有统计学显著性。

结果

为验证该静水压加载装置的实时成像功能，观察了施加静水压后肿瘤细胞内钙信号的动力学变化。将融合生长的 MDA-MB-231、HeLa 和 A549 细胞接种于 35 mm 培养皿中备用。经钙离子成像探针染色后，将无血清培养的细胞暴露于 40 kPa 的静水压下。施加静水压 10 分钟后，癌细胞内的总钙水平升高（图3A,B, 和 补充图 2A,B）。为诱导钙振荡，向无血清培养基中加入10% NCS。结果显示，40 kPa的静水压力增强了MDA-MB-231和HeLa细胞的钙振荡，表现为振荡细胞的比例更高（图3C, 视频 1, 视频 2, 视频 3，以及 视频 4）。热图显示，在静水压加载后，单个细胞的钙振荡增强（图4A,4B，以及 ...

讨论

本方案展示了一种具有广泛适用性的加压装置，可实现对可调静水压下力传导动态过程的实时观察。该系统通过将光学透明的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）盖板与精密加工的铝制底座相结合，克服了传统培养腔室只能进行终点分析的关键局限性。该加压装置与标准倒置显微镜配合使用，可通过延时成像提供动态信息。该装置兼容标准的35 mm培养皿，且组装过程简便，有利于其广泛推广和应用。

利用该设备实时观察机械压力下钙信号动态变化，为研究机械力与肿瘤病理生物学之间的分子关联提供了有力工具。机械压力是肿瘤微环境中实体应力的关键组成部分，正日益被视为调控恶性进展的重要因素。例如，实体瘤中的机械拥挤可触发异常的钙信号，通过CamK-A-PNCK轴激活NF-κB通路，从而促进乳腺肿瘤的生长²¹最近关于膀胱癌的研究表明，乳头状和原位癌的生长模式可能源于上皮过度生长所引发的不同力学屈曲失稳，其特定的形态学亚型由黏膜各层之间的刚度比决定。²²此外，机械限制已被证明可重塑染色质 通过 乙酰化微管-LINC复合物-HMG...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素-抗真菌素（100倍浓度）	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122	在完全培养基中配制成1%浓度
高压灭菌器	Panasonic, Japan	MLS-3751-PC	用于铝制底座和硅胶垫圈的灭菌
生物安全柜	Thermo Fisher Scientific, USA	1300 Series A2 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinets	为细胞操作提供无菌环境
Cal-520 AM，细胞渗透性钙离子荧光探针	AAT Bioquest, USA	21131	用于活细胞内钙离子浓度的动态检测
细胞培养皿（35 mm）	BIOFIL, China	TCD010035	标准35 mm培养皿，用于细胞接种
腔室底座（铝制）	Quanyi, China	/	定制设计，Ø 56 mm，高15 mm，中心窗口 Ø 40 mm
腔室盖（PMMA）	Quanyi,  China	/	定制设计，Ø 56 mm，带6× M3螺纹孔，Luer-lock气体接口
CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific, USA	HERAcell 3111	维持37°C培养环境，可选含或不含5% CO2
HBSS（Hanks平衡盐溶液）	Beyotime, China	C0219	用于染色前后的细胞洗涤
HeLa细胞系	中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所细胞资源中心	CRM-CCL-2	人宫颈癌细胞
倒置荧光显微镜	Nikon, Japan	Eclipse Ti2	用于荧光成像
Leibovitz L-15培养基	Thermo Fisher Scientific, USA	41300039	用于MDA-MB-231细胞培养
MDA-MB-231细胞系	中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所细胞资源中心	CRM-HTB-26	人乳腺癌细胞
新生牛血清（NCS）	Thermo Fisher Scientific, USA	16010142	在完全培养基中配制成10%浓度
压力调节器	Hongrun, China	DP20	量程：0–200 kPa
RPMI 1640培养基	Thermo Fisher Scientific, USA	31800022	用于MDA-MB-231细胞培养
无菌注射器（5 mL）	KDL, China	1101010198	通过Luer-lock接口注入培养基或试剂
胰蛋白酶（0.25%）	Thermo Fisher Scientific, USA	2520056	用于贴壁细胞传代时的消化解离