建立酸诱导的Het-1A细胞模型及miR-107/FGFRL1轴的功能分析

摘要

本文介绍一种利用 Het-1A 细胞建立 HCl 诱导的反流性食管炎细胞模型的实验方案，并通过分子与细胞实验研究 miR-107/FGFRL1 轴的作用。

摘要

大量证据表明，微小RNA（miRNA）在胃肠道病理生理过程中发挥关键作用。然而，其在反流性食管炎（RE）中的具体机制仍不清楚。本文介绍了一种建立酸诱导RE模型并利用分子与细胞实验研究miR-107/FGFRL1轴的实验方案。我们进行了临床样本分析，包括收集RE患者（n=94）和健康对照者（n=94）的血清样本，并通过RT-qPCR进行定量检测。在体外实验中，采用盐酸处理Het-1A细胞建立酸诱导损伤模型。此外，通过MTT细胞活力检测和双荧光素酶报告基因检测对细胞功能进行了验证。代表性结果表明，miR-107在RE患者血清及盐酸处理的Het-1A细胞中均呈下调表达。miR-107通过直接靶向FGFRL1，介导了盐酸诱导的Het-1A细胞活力变化和炎症水平变化，并通过靶向FGFRL1与细胞活力和炎症变化相关联。该方案可用于研究miR-107/FGFRL1在RE中的作用机制，为RE分子机制的研究提供了一个可重复的实验平台。

引言

反流性食管炎（RE）是一种消化系统疾病，其特征是胃酸和胃内容物反复反流入食管，导致食管黏膜发生炎症、糜烂甚至溃疡。病变的严重程度与反流物的性质、反流频率以及食管黏膜的抵抗力相关^1,2。作为胃食管反流病（GERD）中一种高发类型，RE的发病率持续上升，全球影响范围不断扩大³。RE临床表现缺乏特异性，常导致误诊或漏诊。此外，该病易反复发作，常进展为更严重的胃肠道并发症，给患者带来显著的生理负担和经济社会压力⁴。临床上对RE的标准治疗通常包括药物治疗（如质子泵抑制剂）、微创内镜治疗或手术治疗^5,6。然而，治疗效果常受限于药物相关不良反应及操作相关的并发症。由于目前对RE分子发病机制的认识尚不充分，深入阐明其潜在机制可能揭示新的治疗靶点，并为开发更有效、个体化的治疗策略提供依据。本实验方案旨在建立一种体外RE模型，并通过分子与细胞实验探讨miR-107/FGFRL1轴在其中的调控作用。

microRNA（miRNA）已被广泛证实通过序列特异性结合来调控mRNA的翻译，从而参与多种人类疾病的发病机制⁷。例如，miR-3682-3p通过调控FHL1的表达影响Wnt/β-catenin信号通路，进而促进食管癌的发展⁸。miR-21-5p和miR-223-3p通过介导下游靶基因的表达，影响嗜酸性食管炎（EOE）的病程⁹。miR-107是一种位于人类10号染色体上的miRNA，因其在多种肿瘤发生过程中的重要作用而受到广泛关注^10,11,12。现有证据表明，miR-107在胃癌和食管癌中是关键的调控分子^13,14，但其在非肿瘤性消化系统疾病中的病理生理功能及调控机制仍需深入研究。然而，目前可用于研究miR-107在反流性食管炎（RE）中功能的体外模型和整合分析方法仍然有限。

胃酸反流被广泛认为是反流性食管炎（RE）中导致食管黏膜损伤的主要致病因素¹⁵。近期研究表明，RE的致病机制并非胃液对黏膜的直接损伤，而是其刺激食管上皮细胞释放趋化因子，从而引发一系列由炎症介导的组织损伤级联反应¹⁶。为了探究这一过程背后的分子机制，我们采用盐酸处理Het-1A细胞，建立了一种体外酸损伤模型，以模拟酸反流引起的上皮损伤关键病理特征。该方法提供了一个可控且可重复的系统，用于在体外模拟酸诱导的上皮细胞损伤。我们系统地研究了miR-107在RE相关炎症与细胞凋亡中的调控作用及其诊断潜力。本实验方案可用于研究microRNA（miRNA）对食管上皮细胞中炎症和凋亡通路的调控机制。与传统的体内动物模型和原代细胞培养相比，HCl诱导的Het-1A细胞模型结合miR-107功能检测具有极高的稳定性、可控性和可重复性，特别适用于研究酸诱导的上皮损伤、miRNA介导的转录后调控以及食管细胞中的炎症反应¹⁷。该方法尤其适用于探究酸诱导上皮损伤及miRNA调控的分子机制。当与患者的临床分析相结合时，该方法可整合临床数据，为反流性食管炎的机制研究提供支持。

方案

1. 患者招募

1. 按照《赫尔辛基宣言》的规定开展本研究。
2. 获得青岛胶州中心医院伦理委员会对研究方案的批准（批准号：2023033-01）。
3. 确保所有受试者在研究开始前均已签署知情同意书。
4. 从青岛胶州中心医院招募94例反流性食管炎（RE）患者。
5. 纳入94名健康志愿者作为对照组。
6. 通过胃镜检查确诊所有RE患者的食管黏膜病变和糜烂，并依据洛杉矶分类标准¹⁸进行分组。
7. 纳入的RE患者需满足以下条件：消化系统不适症状持续超过3个月，无上消化道手术史，并已签署本研究的知情同意书。
8. 通过胃镜检查排除患有巴雷特食管、食管静脉曲张、食管狭窄、深大溃疡或恶性肿瘤病变的患者。

2. 血清样本采集

1. 在隔夜禁食至少8小时后，于上午8:00至10:00之间从每位参与者采集5 mL空腹静脉血。
2. 将采集的血液在4 °C条件下以3000 × g离心15分钟。
3. 离心后小心收集上清液。
4. 将分离出的血清置于-80 °C冰箱中保存，直至后续检测。
   注意：样品可在−80 °C长期保存，并在以后进行处理

3. 细胞培养

1. 从商业细胞库购买人食管鳞状细胞系 Het-1A。在 37 °C 水浴中快速解冻细胞，时间控制在 1–2 分钟内。
2. 复苏 Het-1A 细胞，并将其培养于添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 RPMI-1640 培养基中。
3. 将培养箱参数设置为 37°C 和 5% CO₂，用于细胞培养维持。
4. 每 2 天更换一次培养基，并在细胞融合度达到 80–90% 时使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行传代。

4. 细胞诱导

1. 将Het-1A细胞接种至6孔板中，调整细胞密度至2×10⁵⁵细胞·孔^-1 在2 mL完全培养基中。
2. 稀释 浓盐酸（HCl）与磷酸盐缓冲液（PBS）混合 调整 将 pH 调至 4.0。
   警告：盐酸具有腐蚀性和刺激性。操作盐酸时应佩戴适当的个人防护装备（包括护目镜、手套和实验服），并在化学通风橱中进行操作。
3. 添加 向每个孔中加入 2 mL 制备好的 HCl 溶液以诱导细胞。 
4. 弃去盐酸溶液，每次时间点检测前用预热的PBS洗涤细胞两次。
5. 使用 MTT 法在 0、10、20 和 30 分钟时检测细胞活力。

5. 实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

1. 使用苯酚-氯仿试剂从 Het-1A 细胞中提取总 RNA。
2. 使用 NanoDrop 分光光度计测定 RNA 的纯度和浓度，确认 A260/A280 比值在 1.8 至 2.0 之间。
3. 使用反转录试剂盒配置反转录扩增体系。
4. 在 PCR 仪中进行反转录反应，37°C 反应 15 分钟，85°C 反应 5 秒，然后置于 4°C 保存。
5. 通过反转录生成互补 DNA（cDNA）。
6. 使用 SYBR Green PCR 主混合液，在 20 µL 反应体积 中进行 RT-qPCR 反应。
7. 设置 PCR 扩增条件如下：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环为 95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 1 分钟。 
8. 以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和小核 RNA（U6）作为内参对照，用于 miR-107 和 FGFRL1 的检测。
9. 采用 2-ΔΔCt 法计算数据。
10. 通过 RT-qPCR 定量检测炎症因子（IL-6、IL-8）和凋亡相关调控分子（Fas、p53）的 mRNA 含量。

6. 细胞转染

1. 在6孔板中以2×10的密度静态培养Het-1A细胞⁵ 细胞·孔-1，直至其进入对数生长期。
2. 从商业供应商处获取合成寡核苷酸（miR-107 模拟物/ov-FGFRL1；50 nM）、下调质粒（miR-107 抑制剂；100 nM）及其相应的阴性对照片段。
3. 使用脂质体转染试剂将上述片段转染入细胞，孵育48 h。

7. 细胞活力

1. 种子 将Het-1A细胞接种至96孔板 密度为 5×10³ 细胞·孔^-1  每孔100 µL培养基 培养 过夜。
2. 加入甲基噻唑基四氮唑（MTT）溶液（20 µL，5 mg·mL⁻¹）^-1，终浓度 0.5 mg·mL⁻¹^-1)加入Het-1A细胞，37 °C孵育4 h。
3. 加入二甲基亚砜（DMSO，150 µL），涡旋混合10分钟。
4. 使用酶标仪测定各孔在490 nm处的吸光度值。
5. 每组设置3个复孔，并独立重复3次。

8. ELISA 检测

1. 按照制造商的标准操作程序，使用ELISA试剂盒检测细胞中的IL-6和IL-8。
2. 独立重复该实验三次。

9. 靶基因预测与荧光素酶活性检测

1. 利用 miRDB 和 ENCORI 数据库预测 miR-107 的潜在靶基因。鉴定重叠的靶基因并验证其互补结合位点。
2. 鉴定 miR-107 与 FGFRL1 之间的互补结合位点。
3. 克隆并获取包含 miR-107 结合位点的野生型 FGFRL1 3'UTR（wt-FGFRL1）。构建特异性结合位点突变体（mut-FGFRL1）。
4. 将 wt/mut-FGFRL1 与 miR-107 模拟物/抑制剂（或阴性对照）共同转染至 Het-1A 细胞中。
5. 使用 双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。

10. 统计分析

1. 使用 GraphPad Prism 输入表达数据，选择 ROC 曲线功能，进行 ROC 分析并导出结果。
2. 采用 Student t 检验（两组间比较）或单因素方差分析（ANOVA；多组间比较），随后进行 Tukey 事后检验，以评估组间差异。
3. 认为 p < 0.05 具有统计学显著性。
4. 原始数据的详细信息汇总于补充材料 表 1 中。

结果

患者招募与基线特征 这些结果描述了miR-107在RE患者中的表达水平及其诊断效能。表1记录了健康对照组和RE患者的一般特征。结果显示，两组在性别、年龄和基础病史方面均无统计学显著差异（p > 0.05），表明组间具有可比性。

血清miR-107表达水平及其诊断效能

RE 组的血清 miR-107 水平显著低于对照组（图 1A）。ROC 曲线分析显示，miR-107 能够区分 RE 患者与健康对照者（AUC = 0.895；图 1B）。此外，RE 患者血清中 IL-6 和 IL-8 的水平升高（图 2A-2B），且它们与 miR-107 的表达呈负相关（

讨论

反流性食管炎是一种由胃食管反流引起的食管黏膜炎症性疾病，临床症状多样，可能影响生活质量，并有发生严重并发症的风险¹⁹在正常生理条件下，胃凭借其固有的防御机制，能够抵御胃酸和胆汁的侵害。相比之下，食管缺乏强效的黏液屏障，因此更容易受到这些物质的损伤。²⁰因此，我们迫切希望通过探索反流性食管炎（RE）的病理机制，并检测无创标志物的表达，来评估RE的发生情况。本实验方案提供了一种可重复的体外RE建模方法，并可用于分析miRNA介导的调控机制。成功实施该方案的关键步骤包括精确控制盐酸浓度和作用时间、维持稳定的细胞培养条件，以及验证转染效率。常见的技术挑战包括酸处理后细胞活力的波动以及转染结果的不一致，这些问题可通过优化处理时间和试剂条件加以缓解。相较于 体内 该方法具有更好的可重复性和实验可控性，适用于高通量的机制研究。

miRNA 是主要存在于植物和动物中的小型非编码 RNA 分子²¹。已有大量研究致力于阐明 miRNA 的功能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
美国典型培养物保藏中心	美国马纳萨斯		商业细胞库
二甲基亚砜	德国Sigma公司	D4540
双荧光素酶报告基因检测试剂盒	美国Promega公司	E1910	双荧光素酶报告基因检测系统
FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒	德国Roche公司	4913850	SYBR Green PCR主混合液
胎牛血清	美国Gibco公司，纽约	10100147C
吉玛公司	中国上海
盐酸	美国Sigma-Aldrich公司，密苏里州	1099730001
IL-6 ELISA检测试剂盒	美国R&D Systems公司	D6050	ELISA检测试剂盒
IL-8 ELISA检测试剂盒	美国R&D Systems公司	D8000C	ELISA检测试剂盒
二氧化碳培养箱	美国Forma Scientific公司，马萨诸塞州	311 S/N29035
Lipofectamine 3000转染试剂	美国Invitrogen公司	L3000015	脂质体转染试剂
四甲基偶氮唑盐	德国Sigma公司	M5655
酶标仪	美国BioTek公司，佛蒙特州	ELx808
NanoDrop分光光度计	美国Thermo公司，马萨诸塞州	ND-1000
青霉素/链霉素	美国Gibco公司，纽约	15070063
PrimeScript反转录试剂盒	日本Takara公司	DRR047A	反转录试剂盒
TRIzol	美国Thermo公司，马萨诸塞州	10296010	苯酚-氯仿提取试剂
超低温冰箱	中国青岛海尔公司	DW-86W100