一种用于高分辨率Z轴层析成像的胶带固定方案 果蝇 复眼

摘要

本实验方案的主要目标是实现对果蝇复眼的无损成像和定量分析。该方法结合了胶带固定策略、体视显微镜下的Z轴层扫采集以及扩展焦深重建技术，以生成高分辨率、无伪影的图像。

摘要

本文介绍了一种用于果蝇复眼高分辨率表型分析的非破坏性固定与成像方案。由于果蝇复眼具有凸面几何结构且在操作过程中机械强度脆弱，其精确表型分析常受到限制。为解决这一问题，我们详细描述了一种通用且非侵入性的成像工作流程，可实现多视角的高分辨率可视化。该方案采用定制的粘附固定策略，将果蝇固定于倒置胶带平台上，通过身体和翅膀固定个体，而头部完全不受接触。关键的是，这种灵活的配置支持多种固定方向：侧向位置可用于捕捉单个复眼的完整凸面结构，正面位置则可用于评估整个头部的对称性。该方法还便于高密度样本阵列的排列，使每次实验可快速处理20–30个样本。通过结合反射光体视显微镜、Z轴层扫采集以及扩展景深（EDF）重建技术，该工作流程可生成均匀清晰、准三维的复合图像。该方法能够保持天然色素沉着，产生高保真、高对比度的图像，适用于定量的器官尺度表型分析。

引言

Drosophila melanogaster 的复眼是研究器官发育过程中生长、模式形成及稳定性的经典且强大的模型。果蝇复眼由约800个高度有序的小眼（ommatidia）组成，能够对影响细胞增殖、分化和组织结构的遗传扰动提供敏感且可量化的表型读出^1,2,3。历史上，对眼发育的遗传操控已揭示了多个保守信号通路的基本机制。开创性研究表明，转录因子 eyeless 的异位表达足以在非视网膜组织中诱导眼睛形成，确立了复眼作为器官特化与可塑性研究范式的地位⁴。后续研究发现，D. melanogaster 中的Hippo信号通路通过协调调控细胞增殖与凋亡，成为眼大小和细胞数量的核心调节者^5,6。与此同时，Hedgehog信号和BMP信号被证明可调控发育视网膜中的形态发生进程、生长精确性以及空间模式形成^7,8。

然而，由于成年复眼具有凸面半球形的几何结构，对其进行高保真成像面临着显著的光学挑战。传统的明场显微镜受限于较浅的景深，无法在单次曝光中同时清晰聚焦于复眼最背侧的顶点（极）和边缘区域（赤道）。⁹这一局限性常导致图像中视网膜表面的大部分区域模糊，阻碍了高分辨率图像分析和机器学习工具在量化多样化表型中的应用。为全面表征视网膜表面，必须在无光学伪影的情况下可视化整个曲面结构。因此，需要一种既能保持眼球天然形态，又能实现整个弯曲视网膜表面高分辨率成像的成像方法。

此外，传统的显微镜样品制备方法常常会破坏果蝇头部的结构完整性。常规封片技术通常依赖于可能遮蔽表面细节的粘合剂，或需要使用镊子对头部进行物理操作，从而对头壳施加压力。正如视网膜形态发生研究中所指出的，眼睛结构的完整性至关重要。直接施加压力或穿刺会导致血淋巴泄漏，引起内部压力丧失，进而造成眼表塌陷或"凹陷"。这些机械性假象可能模拟神经退行性表型或遗传缺陷，导致大规模筛选中出现假阳性结果。本实验方案的目标是提供一种非破坏性的封片与成像流程，以实现对完整黑腹果蝇（Drosophila）复眼的高分辨率可视化观察。

本文介绍了一种快速且可重复的成像工作流程，可在不直接接触果蝇头部的情况下，实现对完整的黑腹果蝇复眼及整个头部形态的高分辨率可视化。该方法采用一种灵活的粘附固定策略，将成年果蝇的身体和翅膀固定，从而在侧向位置（用于捕捉单个复眼的完整曲率）或正前方位置（用于评估整个头部的对称性及眼间特征）实现稳定成像。这种多功能的固定策略可最大限度地减少机械损伤，并在三维空间中保持复眼的天然几何结构。结合反射光体视显微镜、Z轴层扫采集以及扩展景深重构⁹，该方法能够从多个视角生成清晰均匀、高质量的图像，适用于定性观察和定量表型分析。该方法特别适用于黑腹果蝇（Drosophila）中基因扰动、发育表型以及复眼形态高通量筛选的研究。

方案

1. 样品采集与同步化

注意：为确保实验的可比性，必须严格控制羽化时间。在25 °C的标准培养条件下，羽化通常发生在产卵后10至12天。在此期间应密切观察蛹，因为蛹壳变暗表明即将羽化。

1. 直接敲击法（标准方法）
   1. 将标准的 24 x 95 mm 塑料 Drosophila 培养管（用泡沫塞密封）轻轻敲击软垫，使成虫聚集到管底。
   2. 迅速移除塞子，并将一个新鲜的收集管管口与培养管对齐。
   3. 将装置倒置，使培养管位于上方，轻轻敲击管壁，将果蝇转移至收集管中。
      注意：如果标准的玉米粉-琼脂培养基较湿润，不建议使用此方法，因为新羽化的果蝇容易被困住并死亡。为降低死亡率，可先将果蝇收集到一个空的 24 x 95 mm 管中。麻醉后（步骤 3），再将果蝇转移至含有新鲜培养基的 24 x 95 mm 管内壁上。
2. 负趋地性转移法（抗粘附法）
   1. 取下新鲜收集管的塞子，并将其倒置放在实验台上，防止散落的果蝇进入。
   2. 手持培养管，使管口朝下。果蝇会向上爬行，朝向食物一侧，远离管口。
   3. 当管口区域无果蝇时，迅速拔出培养管塞子，并将其与实验台上倒置的空 24 x 95 mm 收集管对齐。
   4. 轻轻敲击连接处至实验台面，使果蝇落入收集管中。
      注意：此方法可显著减少因粘附食物导致的死亡，但比直接敲击法更耗时。
3. CO₂ 麻醉法（高效方法）
   1. 将培养管倒置，使塞子朝下。
   2. 小心地将 CO₂ 麻醉枪的针头插入塞子与管壁之间。
   3. 轻柔踩下脚踏开关并打开手动阀门，以低而温和的流速释放 100% CO₂。
   4. 当果蝇被麻醉并落在塞子上后，将培养管水平放置。取下塞子，与一个空的收集管对齐，轻轻敲击培养管，将麻醉后的果蝇转移至收集管中。
      注意：过大的气流可能将果蝇吹到食物表面，导致粘附和死亡；必须严格保持温和的 CO₂ 气流，足以麻醉果蝇但不造成物理位移。应密切观察果蝇是否出现早期复苏迹象，例如翅膀或腿部的轻微抽动或移动。
4. 标记与维持
   1. 在收集管上标记性别、收集日期、羽化日期、基因型及培养条件。
   2. 性别分离：若需成像的果蝇年龄超过 10 天，应将雄性和雌性分别放入含有培养基的不同培养管中，以防止交配及 F2 代的出现，避免干扰实验环境。
      注意：果蝇可在原有培养条件下（例如 25 °C）的含食物培养管中继续维持，直至达到成像所需的年龄。

2. 装载板的制备

1. 取一块干净的标准玻璃载玻片。
2. 剪一条白色纸胶带，长度比载玻片长约2 cm左右。
3. 将胶带粘性面向上放置在载玻片上（非粘性面接触玻璃），确保胶带两端各超出载玻片约1 cm。
4. 用另外两条长约5 mm的胶带，将两端超出部分紧紧缠绕在载玻片背面，以固定胶带。
5. 确保粘性表面平整、绷紧且无皱褶。
6. 标记：在胶带非粘性端标注方向指示符（如 "Top/Up" 和 "Bottom/Down"）或样本标识，以便在显微镜下进行方向定位和样本追踪。
   注意：选择用于成像的果蝇时，应避免选择体型差异显著的个体。即使使用相同的放大倍数，体型差异也可能导致复眼表面积不可比。

3. 安乐死与固定

1. 安乐死
   1. 将果蝇转移至一个密封的空收集管中。
   2. 将密封的管子放入 -80 °C 冰箱中冷冻 15–20 分钟。
      ​注意：切勿使用精细镊子的尖端刺破或挤压果蝇。即使轻微的血淋巴泄漏也会迅速导致内部静水压丧失，从而立即造成复眼凹陷和不可逆塌陷，破坏成像质量。 
2. 侧视图固定（单个复眼）
   1. 定位：在标准体视显微镜（例如 Nikon SMZ745）下，使用精细镊子将已处死的果蝇调整为侧卧位。
   2. 转移：用精细镊子轻轻夹住果蝇的翅膀（保持侧卧姿势），将其转移至预先准备好的粘性固定板上。
   3. 固定：将果蝇身体的一侧粘附在胶带上。展开翅膀并将其平整地贴附在胶带上以增强稳定性。
   4. 附肢处理：在固定过程中，确保腿部不会遮挡复眼。如果前腿遮挡了视野，使用镊子小心地将其从眼睛处拉开，并牢固地粘附在胶带上（例如向下伸展或折叠至胸部下方）。
   5. 加固：倾斜镊子，使用镊尖侧面（而非尖锐的顶端）轻轻按压果蝇身体，以确保其牢固粘附。
   6. 精细调整：检查头部是否水平。如果复眼不在同一焦平面上，使用镊子微调身体角度。
3. 前视图固定（整个头部）
   1. 定位：在麻醉垫上，将果蝇调整为腹面朝下（俯卧）的位置。
   2. 转移：使用镊子夹住一侧翅膀并提起果蝇，将其转移至粘性固定板上。
   3. 初步固定：轻轻将两侧翅膀向外展开（左右方向），并用力压在粘性表面上以固定果蝇。
   4. 身体稳定：轻轻按压胸部，确保其与粘性板完全接触。用镊子轻夹腹部后端（尾部），轻轻拉直身体轴线，然后将腹部粘附在胶带上。
   5. 头部朝向：使用精细镊子调整头部角度，确保前平面（面部）与粘性表面平行。两个复眼应处于同一水平，并在同一焦平面上清晰可见。
4. 排列
   1. 在粘性表面上将多个果蝇以平行排或网格状阵列排列。确保个体之间不重叠，以避免Z堆栈干扰，但允许紧密排列以提高通量（例如每张载片 20–30 只果蝇）。所有果蝇的头部应朝向同一方向（如步骤 2.6 中的标签所示），以便系统性成像。
   2. 使用同一批次中不同个体的已处死果蝇，分别制备用于侧视和前视成像的独立样本阵列。一旦果蝇被粘附在胶带上，便无法在不造成严重机械损伤的情况下安全移除或重新定位；因此，无法对同一个体依次获取多种视角图像。
      注意：建议在处死和固定后立即进行成像，以防止组织脱水。

4. 图像采集

1. 电动体视显微镜成像系统的启动与初始化
   1. 依次打开电脑、显示器和显微镜主机的电源。
   2. 启动 LAS X 软件。
   3. 当出现"初始化/自检"提示时，确保物镜下方无任何障碍物，然后点击确认。让显微镜完成整个Z轴校准运动。
      注：以下步骤针对配备 LAS X 软件系统的体视显微镜进行了优化。
2. 样品放置与照明
   1. 将制备好的载样板转移至电动体视显微镜的底座平台上，手动调整位置，使阵列中的第一个样品位于数码相机物镜正下方的中心位置。
   2. 打开透射光源（底部）和入射光源（顶部）。对于复眼成像，主要使用反射光照明。调节光圈，确保照明均匀。
3. 软件配置
   1. 将采集模式设置为Z栈（Z-stack）。在项目设置中，将多维运动优先级设为“Z轴优先”，以确保电机驱动运行连续且稳定。
   2. 将成像模式设置为反射光。
   3. 启用扩展景深（EDF），以便合成全聚焦图像。
   4. 在图像高级设置中启用高动态范围（HDR）。强烈建议启用此功能，以减轻复眼高度反光的几丁质表面常导致的镜面高光和过曝现象。
4. 定位与白平衡
   1. 调节放大倍数旋钮至适当水平（例如，侧视单眼图像使用16倍变倍，正面全头图像使用12.5倍变倍），确保目标区域占据视野的1/2至2/3。
   2. 手动移动载样板，使果蝇的胸部位于视野中央。
   3. 使用胸部进行白平衡校准，以校正色温。
5. 曝光与成像参数（参考值）
   曝光时间：60–80 ms。
   增益：0–5（保持较低以最小化噪声）。
   光源强度：60%–80%。
   Z栈步长：标准为8–12 µm。
   注：对于表面平滑、健康的复眼（例如 w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4），步长可达15 µm即可满足需求，因其连续且规则的曲率所需光学切片较少。然而，对于具有突变拓扑结构的粗糙或不平整眼表型，需采用更小的步长（低至5 µm），以捕捉精细结构细节，并显著提高EDF重建的准确性。
6. Z栈定义与图像采集
   1. 对于侧视图：将Z栈范围设为从眼眶边缘（起始）到中心小眼（终止），步长为8–12 µm。
   2. 对于正面视图：调节焦距旋钮，直至复眼外轮廓刚好清晰对焦（起始）；再向相反方向调节焦距，直至头部顶端的中央单眼（黄色的小单眼）刚好清晰对焦（终止），然后点击设置终止。
   3. 点击停止实时预览以冻结当前画面。
   4. 点击开始采集。系统将自动捕获预设的焦平面，并合成一幅高分辨率、全聚焦的图像。
7. 文件保存：
   1. EDF重建完成后，点击软件界面中的保存图标（或进入文件 > 另存为）。
   2. 选择目标目录，输入指定的文件名，然后点击保存。
   3. 请注意，每次采集会生成三个不同的图像文件：a. 原始/通道图像（灰度）；b. 彩色预览图像；c. EDF合成图像（带有"_Composite"后缀）
      ​注：原始/通道图像和EDF合成图像均应保留，用于后续分析与归档

结果

从样本采集到图像获取的完整实验流程如图1所示。通过构建高密度样本阵列，验证了改进后实验方案的高效性。如图2A所示，可将20–30只麻醉后的果蝇排列在单个倒置胶带平台上，形成网格状结构。在胶带非黏性末端标记的方向指示符可确保果蝇头部朝向一致，从而在极少调整载物台的情况下实现快速、系统的成像。关键的是，该方法标准化了固定流程，能够快速制备高密度阵列，便于对野生型和突变型表型进行可重复的成像分析。成功的样本制备可在整个弯曲的视网膜表面获得均匀清晰的图像，无变形或光学模糊现象。

该策略可实现两种不同方向上的稳定固定。图2B展示了侧向固定构型，果蝇被侧向固定，暴露出复眼完整的半球形曲面。图2C展示了前向固定构型，果蝇腹面朝下固定，双翅展开，提供头部的对称视野。在这两种构型中，头部囊壳无任何物理约束（例如镊子压力），表明该方法能有效防止操作引起的机械损伤。相...

讨论

该 果蝇 复眼作为遗传筛选的强有力表型指标，可通过观察眼大小、粗糙度或色素沉积的变化^2,3,8通常表明Hippo等基本信号通路发生扰动^5,6 或 Hedgehog⁷然而，此类筛选的效率长期受限于传统成像工作流程的瓶颈。以往的固定技术通常依赖镊子手动定位或永久性胶合，不仅耗时费力，还容易损伤待分析的结构。为解决这些问题，我们开发了一种利用定制倒置胶带平台的通用型固定策略。该方法不仅能够在单次操作中快速固定多只果蝇，更重要的是，可实现多种方向上的稳定固定，从而从不同的解剖视角进行全面的表型评估^10,11成功实施本方案的关键步骤包括在固定果蝇时保持其方向一致，严...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二氧化碳（CO2）气瓶	本地供应商	不适用
CO2麻醉吹枪	T&L	DG-08
数码显微镜相机	Leica	DMC6200
精细镊子	VETUS	MOS-167B
泡沫塞	东鹏	不适用
图像采集软件（LAS X）	Leica	3.7.1
图像处理软件（FIJI/ImageJ）	NIH	开源
LED 圆顶照明器	Leica	LED5000 HDI
LED 鹅颈照明器	cossim	LG-10
电动体视显微镜	Leica	M205 FCA
物镜	Leica	1.0x PlanApo NA0.2
气动脚踏阀	德力西	FV-320
标准果蝇培养管	LAIBOER	2424951
标准果蝇培养基	不适用	玉米粉-琼脂-糖蜜
标准玻璃显微镜载玻片	Citotest	10127101P-G
标准体视显微镜	Nikon	SMZ745
白色纸胶带	UBWIN	25 mm 宽度