一种形态分析算法量化二维至三维细胞培养中的空间形态与微环境，实现表型的新型定量分析

摘要

本文介绍了如何利用线性化压缩极坐标（LCPC）变换来量化细胞和类器官中的新型形态学特征。LCPC是一种空间算法，能够捕捉传统指标（如面积、体积和表面积）无法反映的形态特性。文中还讨论了形状定向与对齐的最佳实践方法。

摘要

大量研究表明，细胞或类器官的形态表型与其对抗癌药物的敏感性相关。然而，传统的表型测量方法依赖于面积、体积、周长和信号强度等空间度量指标，这些方法虽可行但存在局限性。这些方法无法测量空间背景中的许多关键特征，例如手性（chirality），即左右不对称性。由于左鞋与右鞋具有相同的体积，因此体积无法用于表征手性。尽管手性、重力方向和极性轴等形式的空间背景对人类而言是直观可辨的，但迄今为止，细胞生物学家、病理学家、放射科医生以及机器学习研究者所使用的传统度量方法均无法捕捉这些基本概念。线性化压缩极坐标（LCPC）变换是一种全新的算法，能够以前所未有的方式捕捉空间背景信息。LCPC变换通过叠加一个网格系统来追踪轮廓与网格线的交点，将二维（2D）轮廓转化为离散的正弦波形。该方法将轮廓转换为一系列离散坐标对，其中自变量坐标（x坐标）对应于二维空间中的连续位置，每个因变量坐标（y坐标）则表示轮廓与网格线交点到网格系统原点或基线的距离。以离散正弦波的形式，随后对数据应用快速傅里叶变换（Fast Fourier Transform）。通过这种方式，二维和三维细胞培养中的细胞形态得以系统化、多维度地表征，从而实现稳健的定量分层分析，揭示治疗耐药性的深层机制。

引言

三维（3D）类器官培养在模拟方面已显示出优于二维（2D）细胞培养的特性 体内 生物学^1,2类器官在癌症研究中已成为不可或缺的工具，可用于筛选有效疗法以及深入探究疾病进展机制^3,4,5,6尽管在癌症生物学领域众所周知，形态学差异与细胞和组织的不同生物学行为相关，但该领域一直依赖于范围有限的传统形态学指标。本研究描述了一种新颖的空间算法，能够以前所未有的精度客观量化细微的形态学特征，超越了面积、体积和表面积等传统方法。

线性化压缩极坐标（LCPC）变换的提出旨在客观且定量地描述组织病理学中观察到的复杂形态，以提高结肠息肉的分级准确性⁷。随后，为了将该方法扩展应用于捕捉脑部病理中基于磁共振成像（MRI）的宏观空间特征（如双相情感障碍和阿尔茨海默病），研究者对该变换进行了进一步改进和增强。本研究详细描述了应用LCPC变换两种版本的逐步操作流程及最佳实践方法：平行网格系统和径向网格系统，这两种系统均配有开源脚本和教学视频。

除了传统的几何方法外，还存在多种抽象方法可用于测量细胞和器官的复杂形状。这些方法包括测量偏心率、偏度、对比度和峰度，以及利用Zernike矩来捕捉圆形度、不对称性、边缘不规则性和整体轮廓结构^8,9,10。分形分析也有助于将复杂的轮廓简化为标量值，例如分形维数（Fractal Dimension），用于衡量轮廓的不规则程度，以及空隙度（lacunarity），用于衡量轮廓中不规则空隙的异质性分布^11,12。在纹理测量方面，灰度共生矩阵（Gray Level Co-occurrence Matrix, GLCM）方法广泛用于评估对比度、能量、同质性、相关性和熵^13,14。尽管这些方法均具有优势，但它们均未设计用于捕捉空间上下文信息，例如重力方向、左右手性，或影响形态变化方向的中央支撑结构的位置。此外，其中许多方法仅生成单个标量值或少数几个标量值来表示空间信息，因此在引用的研究中常将多种方法结合使用，以全面评估复杂形状。

LCPC 变换旨在通过一次测量生成大量特征，并允许添加将空间上下文信息编码到形状中的空间标记，例如重力方向。与 LCPC 变换最接近的方法⁷是在一年后发表的¹⁵，两者共享相同的核心思想作为出发点：对细胞轮廓应用傅里叶变换，以频率谱的形式来测量形状。然而，LCPC 变换是独立开发的，可通过不同的网格系统进行应用，这些网格系统旨在结合被测形状之外的空间上下文知识使用。此外，LCPC 变换的发明者在本文中指出，所得到的频率谱包含大量隐藏的空间信息。补充文件 1 详细讨论了生物学中常被现有引用方法忽略的空间上下文，以及如何应用 LCPC 变换来捕捉此类上下文。对于那些发现对照组与实验组之间的形状数据无显著差异的读者——无论其肉眼是否能察觉形状上的差异——或其形状数据表现出的差异极小，但怀疑本应存在更大差异的研究者，建议尝试使用 LCPC 变换。

LCPC 变换在测量空间信息方面提供了前所未有的精确度，因为它以多维方式表示形状。与传统的面积和体积等方法不同，后者每个形状仅产生一个标量值（例如 25 cm²），LCPC 变换的结果可生成多个指数，每个指数与形状的不同形态特征相关（例如圆度与角的锐利程度、边缘的平滑性与锯齿状）。LCPC 变换通过在形状轮廓上叠加一组直线网格来描述二维形状。每个网格系统都有一个原点（图 1）或基准线（图 2），用于测量线性距离。参见 图 1B 和 2B 中简化的流程图以了解该算法的描述。检测网格线与形状轮廓之间的每一个交点。然后计算每个交点相对于基准线或原点的线性距离。通过这种方式，LCPC 变换将二维形状转换为一系列连续的 x-y 坐标对。x 坐标表示从零到无穷大的网格线位置，而 y 坐标表示交点到基准线或原点的距离。以这种离散正弦波形式，随后应用快速傅里叶变换（FFT），将数据从“位置域”转换到频率域。如果 x 坐标代表时间，则“位置域”在 FFT 的标准应用中相当于“时间域”。

径向网格系统测量每个交点到径向网格原点的距离（图1A），而平行网格系统始终以位于图形左侧的一条假想线为参考，测量各交点的距离（图2A）。该开源脚本通过寻找轮廓最左侧的像素，再向左移动10个像素，来确定这条假想线的位置。此处，该位置的x坐标即作为计算所有交点的参考线。这10个像素的规则是任意设定的，但正因如此，使用该开源脚本分析平行网格系统的所有轮廓，其四周必须至少保留15个像素的空白区域。

对于具有褶皱或多层结构的二维形状，网格线可能与轮廓相交多次。在这种情况下，同一条网格线上所有交点的距离将被累加为一个单一数值。因此，每条网格线仅对应一个x坐标和一个y坐标。这种累加操作在LCPC变换的名称中体现为“压缩”（compressed）一词。将非线性的二维形状转化为离散的正弦波形的过程，则对应算法名称中的“线性化”（linearized）一词。最后，算法名称中包含“极坐标”（polar coordinates），是因为最初构想的网格系统是基于极坐标系的180度径向网格⁷。尽管后来发现极坐标与直角坐标系可以相互替换，但该算法的名称仍被保留下来。致谢部分描述了推动LCPC变换发明与改进的个人动机。

方案1是获取图3B所示数据的流程，而方案2是获取图3C–D所示数据的流程。这些方案中的步骤已在GitHub代码仓库“Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform”中的独立Python脚本中实现¹⁶。方案1是预处理步骤的一个示例，用于推导“纯形状”，为LCPC变换做准备。方案2是预处理步骤的另一个示例，用于“按比例”测量形状，即相对于彼此在其原始尺度下进行测量。

分割可以在图像处理软件（如 Mac 的预览或 Microsoft 的画图）中手动完成，也可以使用基于阈值的方法进行。如果采用手动方式，应从以下四种颜色中选择一种：蓝色、绿色、品红/洋红色或红色。名为“Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform”的 GitHub 仓库¹⁶中包含一个名为“color extraction scripts”的文件夹，该文件夹包含四个 Jupyter Notebook 文件，其中的 Python 代码可提取上述四种颜色，并将其转换为白色背景上的蓝色掩膜。此过程也可以通过在 Fiji/ImageJ 等图像处理软件中对轮廓颜色进行阈值分割来实现。对于包含边界相接或边缘重叠的轮廓图像（例如维恩图），需要使用图像处理软件将它们分离，使其在包含多个类器官轮廓的复合掩膜图像中成为独立的对象。此步骤不适用于仅包含单个类器官，或多个互不接触的类器官的图像。

方案

本研究中使用的人体原代细胞是根据先前报道的伦理批准和知情同意程序获取并培养的¹⁷。本文展示的图像均来自经批准的细胞培养物，系首次发表。组织标本由布莱根妇女医院和加利福尼亚大学旧金山分校在机构审查委员会（IRB）批准的方案下收集，患者均已签署知情同意书，同意将其组织用于科研用途，具体方法如前所述¹⁷。本研究未进行任何额外的人体标本采集。

1. 为LCPC变换提取二维类器官轮廓的纯形状

1. 使用任意图像处理软件（如 Microsoft Paint、MacOS Preview 或 Fiji/ImageJ）对每个类器官的外边缘进行分割。
2. 提取类器官的轮廓，作为白色背景上的蓝色线条的开放掩膜。
3. 将每个蓝色轮廓单独提取到各自的白色画布上。
   注意：仅当图像包含多个轮廓时，此步骤才必要。
4. 将每个轮廓裁剪，使蓝色物体四周各保留一个像素的边距。
5. 在四边各添加100像素的白色空白区域以创建新的页边距。
6. 旋转物体，使其最长的内部长度呈水平方向。
   注意：此步骤将最长的内部线条转换为 将每个对象旋转至其宽度方向。为此提供两个脚本：对于闭合形状，使用名为“Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb”的Jupyter Notebook；对于开放形状或多部件形状，使用名为“Rotate Green Line_v3.ipynb”的Jupyter Notebook。“Rotate Green Line”工具配有视频教程，链接位于与该.ipynb文件同目录下的ReadMe文件中。
7. 将每张图像裁剪，使蓝色物体四周各保留一个像素的边距。
   注意：此步骤与步骤 1.4 相同。然而，此次裁剪的目的是，接下来的调整大小步骤将调整整个画布的尺寸，而不仅仅是画布中的蓝色对象。因此，通过使蓝色对象的宽度和高度接近画布本身，将画布调整为 400 像素宽的同时，也使该对象的宽度接近 400 像素。有一个名为“Trim margin to 1-pixel border.ipynb”的 Jupyter Notebook。
8. 将每张图像的画布宽度调整为 400 像素，同时保持宽高比不变。
   注意：此步骤可使每个对象具有相同的宽度。约束宽高比可防止在调整大小时扭曲对象。有一个名为“Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb”的 Jupyter Notebook。
9. 在四边各添加100像素的白色空白以创建新的页边距。
10. 将每张图像顺时针或逆时针旋转90度，使内部最长长度呈垂直方向，并对所有图像保持一致的旋转方向选择。
    注意：上述流程中，纯形状是通过依次执行步骤 1.6、1.7、1.8 和 1.9 获得的。在步骤 1.9 中添加边距空间是为了避免接下来进行 LCPC 变换脚本时出现错误，但该操作并不参与纯形状的提取。希望以实际比例测量形状的用户无需执行上述流程中的步骤 1.6、1.7 和 1.8，但仍应在应用 LCPC 变换前对掩膜图像进行预处理，以获得最佳朝向。
11. 对每条轮廓执行LCPC变换。使用提供的Python脚本进行径向网格法分析¹⁸ 或平行网格法¹⁹.

2. 提取二维类器官轮廓的大尺度形状以进行LCPC变换

注意：提取物体按比例形状的逐步方法与上述方案1中提取纯形状的方法类似 。两个方案中的步骤名称完全相同，以便于对照。请参阅方案1中各步骤的说明。纯形状与按比例形状的主要区别在于，按比例形状无需执行步骤1.6、1.7和1.8，即尺寸调整步骤。

1. 分割每个类器官的外边缘。可采用计算方法，或通过基础图像编辑软件（如 Microsoft Paint、MacOS Preview 或 Fiji/ImageJ）手动完成。
2. 将类器官的轮廓提取为开放的掩膜，表现为白色画布上的蓝色线条。使用 Fiji/ImageJ 或提供的 Python 脚本¹⁶提取掩膜。
3. 将每条蓝色轮廓单独分离至其对应的白色画布上。使用 Fiji/ImageJ 或提供的 Python 脚本¹⁶提取掩膜。
4. 裁剪每条轮廓，使蓝色对象在四边均保留一个像素的边距。使用 Fiji/ImageJ 或提供的 Python 脚本¹⁶。
5. 在四边各添加 100 像素的白色空间，以创建新的边距。使用 Fiji/ImageJ 或提供的 Python 脚本¹⁶。
6. 旋转每条轮廓，使其最长的内部线段呈垂直方向。使用 Fiji/ImageJ 或提供的 Python 脚本¹⁶。
7. 对每条轮廓执行 LCPC 变换。使用提供的 Python 脚本进行径向网格法¹⁸或平行网格法¹⁹。

结果

应用于乳腺癌类器官的径向网格LCPC变换

三维类器官和肿瘤可呈现出多种形态，其中一些形态即使通过传统度量方法得到的差异在统计学上不显著，人眼仍能明显区分。另一方面，类器官也可能表现出在人眼看来具有异质性因而不显著的形态，从而掩盖了代表不同亚型的反复出现的细微形态特征。本研究中的人类原代乳腺类器官取自患者，并按照先前发表的方案在三维条件下进行培养^17,20,21。图3A展示了通过视觉观察可区分的三种形态类别：囊状表型、多囊表型和致密多囊表型。图3B显示，这些类器官的外轮廓被手动分割，并提取其纯形态，从而消除了尺寸对其形态的影响。由于轮廓本质上呈近似圆形，因此对纯形态应用了径向网格LCPC变换，随后进行主成分分析（PCA）。请注意，叠加在

讨论

与任何计算工具一样，输出结果的质量取决于输入是否符合该工具设计时所依据的预期规则。在使用所提供的 Python 脚本时，应遵循以下规则，并将其作为质量控制检查。第一，确保开放掩膜为白色背景上的蓝色线条。选择蓝色是任意决定，无特殊意义，但执行 LCPC 变换的脚本被编写为在白色背景上搜索蓝色像素。第二，不要在图像四边白色区域少于 10 像素的情况下运行 LCPC 变换脚本。有关原因，请参见此视频：“The Margin Thickness Parameter - How to Prepare Shape Outlines”³³。第三，该脚本假设对象轮廓为白色背景上的蓝色像素，线条厚度应在 5–10 像素之间。有关原因，请参见此视频：“The Line Thickness Parameter - How to Prepare Shape Outlines”³⁴。第四，不要在空白图像上运行 LCPC 变换脚本，否则将导致脚本出错。第五，不要在仅包含微小杂质斑点的图像上运行 LCPC 变换脚本，因为网格系统可能无法检测到该斑点，从而尝试分析空白图像，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Add 100 pixels to margins.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	使用sklearn.neighbors包中的NearestNeighbors函数
BLUE_Color Extraction.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	使用scipy.spatial包中的cKDTree函数
Cliff's Delta	组织空间几何实验室	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	通过Python语言创建了Cliff's Delta的实现
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Flip images VERTically.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
GREEN_Color Extraction.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
MacOS Preview Version 11.0	苹果公司	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Microsoft Paint	微软	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	被提及为手动分割的潜在有用工具，但在本研究中未使用
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	微软	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	使用sklearn.decomposition包中的PCA函数
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
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Rotate images 90CCW.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Rotate images 90CW.ipynb	组织空间几何实验室	GitHub仓库名称：Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub仓库地址：https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Jupyter Notebook中的Python脚本
Thicken Blue Lines.ipynb	组织空间几何