基于HEK-293细胞系统的STING分选机制研究中无细胞COPII小泡重建方案的建立

摘要

本方案描述了一种优化的无细胞系统，用于重建STING蛋白向COPII囊泡的整合过程，从而实现对内质网输出过程中货物分选的可控生化分析。

摘要

cGAS–STING 通路是先天免疫系统的核心组成部分。激活后，内质网（ER）驻留蛋白 STING 会被分选至 COPII 小泡，并转运至高尔基体以启动下游信号传导。尽管该过程至关重要，但调控 STING 进入 COPII 小泡的分子机制尚未完全阐明。本文介绍了一种优化的实验流程，用于 体外 通过重建COPII囊泡，实现对货物蛋白分选的可控分析。本文描述了一种可扩展的方法，用于从HEK-293F悬浮细胞中制备高浓度细胞质提取物（30–40 mg/mL），并结合一种简便的流程，生成半通透化的HEK-293T细胞，作为明确的膜来源。与传统的贴壁细胞系统相比，该方法提高了可扩展性，降低了成本，并增强了实验的可重复性。以STING为模型货物蛋白，通过Western blot分析验证了COPII囊泡的出芽过程及货物蛋白的包载，结果表明在特定条件下基础包装效率约为20%。该系统允许对生化参数进行可控调控，包括核苷酸刺激，以评估其对货物蛋白包载的影响。本实验方案为研究COPII介导的货物分选提供了一个稳健且可灵活调整的平台，并可进一步拓展用于研究其他跨膜蛋白及参与内质网输出的调控因子。

引言

cGAS-STING 信号通路是先天免疫系统的基本机制，可感知细胞质中的双链 DNA（dsDNA），从而启动抗病毒反应。当检测到 dsDNA 时，酶 cGAS 会生成环状二核苷酸 cGAMP，后者作为第二信使与 STING^1,2 结合。关键的是，在稳态条件下，STING 以非活性二聚体形式存在于内质网（ER）中³。其活化需要从内质网快速且高度调控地转运至高尔基体。正是在高尔基体上，STING 招募并激活下游激酶 TBK1 和 IRF3，进而诱导 I 型干扰素和促炎性细胞因子的产生⁴。

STING 的转运由 COPII 包被小泡介导，后者是蛋白质从内质网输出的通用载体⁵COPII 包被的组装——包括小GTP酶Sar1、内层包被Sec23/24复合物和外层包被Sec13/31复合物——负责将内质网膜变形为囊泡，同时选择性地招募货物^6,7Sec22b 被分选至 COPII 小泡中 通过 COPII的Sec23/24复合物识别的结构表位⁸其他货物蛋白包括p24家族和ERGIC标志物ERGIC-53，二者均依赖C末端的双疏水性φC基序进行分选⁹相比之下，某些内质网锚定蛋白（如核糖体蛋白I（RPN1））则局限于内质网内，可作为完整内质网结构的标志物，因其不会被转运 通过 COPII 小泡¹⁰因此，在无细胞COPII囊泡重建实验中，Sec22b和p24通常被视为COPII运输的货物蛋白，而核糖体结合蛋白（ribophorin）则作为监测囊泡制备过程中内质网污染的标志物。尽管COPII转运的基本机制已较为明确，但触发活化STING选择性进入这些囊泡的特异性分子信号仍不清楚。阐明这些分选机制至关重要，因为STING转运的失调与多种自身免疫性和自身炎症性疾病相关，例如婴儿期发病的STING相关性血管病变（SAVI）和COPA综合征。¹¹然而，在完整细胞中研究这些瞬时且高度动态的事件在技术上仍然具有挑战性。

为了解决这些挑战，已开发出一种优化的无细胞重建系统，用于探究COPII介导的货物分选所需的分子条件。尽管 体外 芽殖实验长期以来一直是细胞生物学研究的重要组成部分¹²，其广泛应用通常受限于制备高质量组分所需的高昂成本和复杂性。本研究介绍了一种简化的操作流程，该流程利用HEK-293F悬浮细胞作为经济的活性胞质溶胶来源，并以半透化的HEK-293T细胞作为稳定的膜供体。无细胞COPII小泡重建系统的整体操作流程如图所示 图1. 在此系统中，以 Sec22b 作为阳性对照，用于确认货物蛋白被整合入囊泡；以 RPN1 作为阴性对照，用于监测并排除内质网膜污染。本研究以 STING 作为概念验证的货物蛋白，证明该系统能够有效模拟 STING 分选过程中的关键生化特征。该平台提供了一种多功能且可扩展的工具，可用于鉴定调控 STING 分选的胞质因子和膜信号，未来有望应用于研究多种其他囊泡运输通路。 关键词：Sec22b，RPN1，STING，囊泡运输，分选机制，内质网膜污染，胞质因子，膜信号

方案

HEK-293F（RRID: CVCL_6642）和 HEK-293T（RRID: CVCL_0063）细胞系购自北京协和医学院细胞资源中心。两种细胞系均通过短串联重复序列（STR）分型进行鉴定，并确认无支原体污染。所用试剂与设备详见材料表。

本研究未涉及人类参与者或脊椎动物。因此，无需伦理审批。所有实验操作均按照机构生物安全指南进行。

1. HEK-293F 细胞胞质溶胶的制备

1. 将HEK-293F细胞以1 × 10⁶ 个细胞/mL的密度接种于100 mL添加了1%青霉素-链霉素的限定性哺乳动物培养基中。将细胞培养于500 mL锥形瓶中。
2. 将悬浮培养物置于37 °C、5% CO₂条件下，在摇床培养箱中孵育60小时。
3. 在4 °C下以300 × g离心5分钟收集细胞。使用自动细胞计数仪测定总细胞数。
4. 用50 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀。在4 °C下以300 × g离心5分钟。
5. 将细胞沉淀重悬于等体积的预冷B88缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.3；250 mM山梨醇；150 mM醋酸钾；5 mM醋酸镁）中。
6. 在冰上通过装有22号针头的5 mL注射器反复吹打悬液超过100次，使细胞裂解。
7. 通过光学显微镜检查细胞裂解情况。在4 °C下以20,000 × g离心10分钟，去除细胞碎片。
8. 将上清液转移至超速离心管中。在4 °C下以100,000 × g离心1小时。
   注意：确保超速离心管正确平衡，以防止设备损坏和安全风险。
9. 收集澄清的上清液。使用截留分子量为3 kDa的超滤装置，在4 °C下以4,000 × g浓缩样品。
10. 采用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。将浓度调整至30–40 mg/mL。
    注意：操作液氮时应佩戴适当的防护装备，避免冻伤。
11. 将细胞质提取物分装。用液氮速冻分装样品，并于−80 °C保存（图2A）
    注意：避免反复冻融超过两次。分装样品可在−80 °C保存长达6个月。

2. 半透性 HEK-293T 细胞的制备

1. 将表达全长人源 STING 的 HEK-293T 细胞以每 15 cm 培养皿 3 × 10⁶ 个细胞的密度接种于 15 mL DMEM 培养基中，培养基中添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 48 小时。
2. 在细胞融合度约为 60% 时收获细胞。
3. 吸除培养基，并用 10 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞两次。
4. 加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。室温孵育 2–3 分钟以使细胞脱落。
5. 加入 200 µL 大豆胰蛋白酶抑制剂（1 mg/mL）以终止消化反应。将细胞重悬于 10 mL 冰冷的 KHM 缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.2；110 mM 醋酸钾；2 mM 醋酸镁）中。
6. 在 250 × g 条件下离心 3 分钟收集细胞沉淀，弃去上清液。
   注意：皂苷（Digitonin）具有毒性，需在通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备。
7. 将细胞沉淀重悬于 6 mL 冰冷的 KHM 缓冲液中，加入 6 µL 皂苷储备液（40 mg/mL，溶于 DMSO）。
8. 轻轻颠倒混匀，冰上孵育 5 分钟。
9. 加入 8 mL KHM 缓冲液以稀释皂苷。在 250 × g 条件下离心 3 分钟，收集透化后的细胞。
10. 将沉淀重悬于 14 mL 冰冷的 HEPES 缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.3；90 mM 醋酸钾）中，冰上孵育 10 分钟。
11. 在 250 × g 条件下离心 3 分钟，将沉淀重悬于 1 mL 冰冷的 KHM·Cl 缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.3；110 mM KCl；2 mM MgCl₂）中。
12. 在 10,000 × g 条件下离心 15 秒，弃去上清液。
13. 将沉淀重悬于 50 µL KHM·Cl 缓冲液中，使用 BCA 法测定蛋白浓度，并调整至 5–7 mg/mL。

3. 无细胞 COPII 小泡重建实验

1. 准备 材料表 中列出的所有试剂。分装后于 −80 °C 保存。
2. 配制 50 µL 反应混合液，其中包含 110 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.2）、2 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂混合物（1×）、0.2 mM GTP 和 ATP 再生系统（40 mM 磷酸肌酸、0.2 mg/mL 肌酸磷酸激酶、1 mM ATP）。
3. 加入 cGAMP 至终浓度为 10 µM。在室温下孵育反应体系 15 分钟。
4. 加入 50 µg 半通透化的 HEK-293T 细胞。轻轻混匀。
5. 加入 80 µg HEK-293F 细胞质提取物以启动囊泡形成。在 37 °C 下孵育 45 分钟。
6. 将反应体系置于冰上以终止出芽过程。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 20 分钟。
7. 收集含有囊泡的上清液。保留含有细胞器的沉淀。
8. 将上清液在 4 °C 下以 100,000 × g 超速离心 1 小时。将囊泡沉淀重悬于 30 µL 蛋白上样缓冲液中。
9. 在 95 °C 加热样品 5 分钟。在 20,000 × g 离心 5 分钟以去除沉淀物。
10. 进行 SDS-PAGE 电泳并将蛋白质转移至 PVDF 膜。使用针对 Sec22b、STING 和 RPN1 的抗体进行免疫印迹检测。

结果

在制备HEK-293F细胞胞质溶胶过程中，评估了两个参数以确定胞质溶胶的质量。HEK-293F细胞在高密度条件下培养，获得了蛋白质浓度较高的胞质提取物。此外，通过光学显微镜评估基于注射器裂解后的细胞破碎程度，结果证实在此实验条件下细胞裂解效率较高（图2B）。

为制备半透性的HEK-293T细胞，细胞在培养至约60%汇合度时收获。在此阶段，显微镜观察显示细胞内细胞器分布均匀且形态完整，可作为囊泡重建实验的合适膜来源（图3）。

利用这一优化系统，研究了STING信号通路与囊泡运输之间的偶联关系。如本实验流程所述，样品被分离为全细胞裂解物、细胞器、囊泡和上清液组分，用于后续分析（图4A，B）。在无细胞COPII囊泡重建后，样品通过SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜进行Western blot分析。共分析了三种COPI...

讨论

重建关键生化反应 体外 为无细胞系统奠定了基础，这些系统在众多里程碑式的发现中发挥了关键作用，包括鉴定出cGAS是一种细胞质DNA感受器^14,15，细胞色素c在细胞凋亡中作用的阐明，以及首个组蛋白去甲基化酶JHDM1的发现^16,17此类明确的生化方法在解析STING转运过程中紧密偶联的步骤方面尤为强大，从其离开内质网（ER）到抵达高尔基体的过程，这一过程对天然免疫信号传导至关重要。

本研究利用 STING 作为模式货物，建立并验证了一种优化的无细胞 COPII 小泡重建系统。该实验流程解决了研究 STING 内质网输出过程中存在的若干挑战。首先，采用源自 HEK-293F 悬浮细胞的细胞质提取物，可提供可扩展且可重复的 COPII 组分来源。这一点对 STING 的研究尤为重要，因为 HEK-293 细胞是 cGAS–STING 信...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL 无菌注射器	WEGO	V526273	用于机械细胞裂解
腺苷 5′-三磷酸（ATP）	MCE	HY-B2176	100 mM 水溶液储备液，pH 7.3，保存于 −80 °C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	用于创建概念图示和示意图
ATP 再生系统（10×）	—	—	含磷酸肌酸、肌酸激酶和 ATP 的能量再生混合物
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher	23227	比色法蛋白测定
BioRender	BioRender	SCR_018361	用于创建概念图示和示意图
BSA	Biorigin	BN20815	封闭试剂
二氧化碳振荡培养箱	智楚	ZCZY-CS8	为悬浮培养提供恒温、CO2浓度及振荡条件
CO2 培养箱	Thermo Fisher	3110	为贴壁培养提供恒温及 CO2 环境
普通显微镜	Olympus	CX43	用于评估细胞裂解和形态
肌酸激酶	Roche	CKRO	20 mg/mL 缓冲液储备液，保存于 −80 °C
磷酸肌酸	Roche	CRPHO-RO	ATP 再生系统的组分
台式离心机	Eppendorf	5810R	用于低速离心
皂苷	Sigma	D5628	40 mg/mL DMSO 储备液，保存于 −20 °C
DMEM	Corning	10-013-CMR	HEK-293T 细胞的生长培养基
D-山梨醇	生工	A100691	1 M 水溶液储备液，4 °C 保存
ECL 检测试剂	Biorigin	BN16009	化学发光底物
电泳槽	Bio-Rad	1658001	用于 SDS-PAGE 的装置
胎牛血清（FBS）	Corning	35-015-CV	血清补充剂
固定角转子（TFT 80.2）	Thermo Fisher	54456	用于超速离心的转子
FreeStyle 293-F 细胞	Thermo Fisher	R79007	用于细胞质组分的制备
山羊抗小鼠 IgG（H+L）	Invitrogen	31430	HRP 标记的二抗
山羊抗兔 IgG（H+L）	Invitrogen	31460	HRP 标记的二抗
GraphPad Prism	GraphPad Software	SCR_002798	用于进行统计分析（单因素方差分析）并生成图 4D 中的定量柱状图
鸟苷 5′-三磷酸（GTP）	MCE	HY-113225	10 mM 水溶液储备液，pH 7.3，保存于 −80 °C
表达人源 STING 的 HEK-293T 细胞	—	—	实验室自制；用作膜来源
HEPES 缓冲液（1 M，pH 7.3）	碧云天	C0215	溶液配制用缓冲液组分
成像系统	Bio-Rad	12003153	用于信号检测
四水合乙酸镁	Hampton Research	HR2-561	B88 溶液配制用缓冲液组分
六水合氯化镁	Hampton Research	HR2-559	缓冲液组分
微量离心机	Eppendorf	5420R	用于中速离心
微量离心机	Eppendorf	5420	用于常规离心
NanoDrop 分光光度计	Thermo Fisher	840-317400	用于蛋白质定量
OPM-CD Trans293 培养基	OPM	P82019	无血清培养基，用于 HEK-293F 悬浮培养
青霉素–链霉素（100×）	Servicebio	G4003	细胞培养用抗生素补充剂
苯甲基磺酰氟（PMSF）	生工	A610425	蛋白酶抑制剂
磷酸酶抑制剂	乐百	C0104	防止蛋白质去磷酸化
磷酸盐缓冲液（PBS）	Servicebio	G4202	用于洗涤细胞的缓冲液
乙酸钾	Sigma	236497	1 M 水溶液储备液，4 °C 保存
电源	Bio-Rad	1645052	为电泳提供电压
蛋白酶抑制剂混合物（无 EDTA）	Roche	4693132001	广谱蛋白酶抑制剂混合物
PVDF 膜	Millipore	ISEQ00010	用于 Western 印迹的膜
RPN1 抗体（兔单克隆抗体）	Abcam	ab197888	内质网标记物
SDS-PAGE 凝胶（4–20%）	—	—	用于蛋白质分离
SDS-PAGE 上样缓冲液（5×）	Solarbio	P1040	蛋白质样品制备缓冲液
Sec22b 抗体（兔单克隆抗体）	Abcam	ab181076	COPII 货物标记物
大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）	Sigma	T9128	1 mg/mL PBS 储备液，保存于 −20 °C
STING 抗体（兔单克隆抗体）	CST	13647	一抗
TBST 缓冲液	Servicebio	G0004	免疫印迹洗涤缓冲液
热循环仪	Bio-Rad	186-1096	用于加热和孵育
恒温金属浴	DLAB	5062102100	维持恒定温度
转膜槽	Bio-Rad	1703930	用于蛋白质转膜
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Servicebio	G4011	用于细胞解离
超速离心机	Thermo Fisher	75000100	用于高速离心
超速离心管（2 mL）	Thermo Fisher	54460	适用于超速离心的离心管
超滤管（4 mL，10 kDa 截留分子量）	Millipore	UFC8010	用于细胞质组分的浓缩