综述文章

腺相关病毒（AAV）载体分析表征的标准化

DOI：

10.3791/71152

⸱

2026年7月10日

 ,  , 
1Trellis Research Group, Department of Cellular and Molecular Medicine, Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KU Leuven, 2Virus-Host Interactions & Therapeutic Approaches Research Group, Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KU Leuven

本文内容

摘要

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腺相关病毒（AAV）基因治疗需要经过充分表征的参考标准物质（RSM），以确保在不同实验室内部及实验室之间进行准确且可重复的分析测量。本文综述了参考标准物质的关键需求，评估了现有的商业和药典标准，并提供了内部开发参考标准物质的实用策略，以推动安全有效的腺相关病毒治疗药物的发展。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腺相关病毒（AAV）已成为体内基因治疗的主要载体，目前已有八种产品获得上市许可。随着该领域快速发展，对用于表征关键质量属性（CQAs）的可靠分析方法的需求持续增长，这些属性包括衣壳滴度、基因组滴度、衣壳含量（空/满比）、身份鉴定和纯度。参考标准物质（RSMs）通过提供经过充分表征的、标准化的AAV批次，作为通用基准，在此过程中发挥着关键作用。RSMs有助于验证新兴分析技术，确保常规检测的准确性和可重复性，并实现不同实验室之间的数据可比性。然而，由于AAV复杂的生物学特性、血清型的多样性、载体基因组以及工程化衣壳变体的存在，通用AAV RSMs的开发受到根本性限制，因而需要针对特定血清型和特定应用的标准物质。近年来取得了一些重要进展，例如药典发布的AAV8参考标准品，其经过多种正交方法表征，推动了测量方法的标准化。本文综述了AAV基因治疗中对RSMs的迫切需求，评估了当前可用的药典级和商业化标准品，并提出了内部RSM开发的实用策略。建立可靠的、血清型特异性的AAV RSMs以及标准化的操作规程（SOPs），对于推进AAV基因治疗的发展，并确保在研究、开发和临床生产中实现准确性、可重复性和安全性至关重要。

引言

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基因治疗通过将功能性遗传物质递送至患者细胞，以纠正或调控基因表达，为治疗遗传性和获得性疾病提供了一种变革性的策略。在众多载体中，腺相关病毒（AAV）因其不同血清型具有广泛的组织嗜性，以及能够在体内实现持久的附加体形式的外源基因表达，而在体内应用中尤为突出1。​

腺相关病毒（AAV）是细小病毒科（Parvoviridae）依赖细小病毒属（Dependoparvovirus）中的一种微小（直径约25 nm）DNA病毒。这类病毒无致病性且复制缺陷，其复制需要腺病毒或单纯疱疹病毒等辅助病毒提供帮助2。AAV基因组包含两个基因——rep 和 cap，两侧由两段145个碱基对组成的回文重复序列包围，该序列称为反向末端重复序列（inverted terminal repeats, ITRs）3。重组腺相关病毒（rAAV）载体通过将病毒编码序列替换为包含启动子、目的基因和调控元件的治疗表达盒（两侧由ITR包围）而构建。在生产过程中，rep 和 cap 基因以反式提供，从而促进治疗表达盒的复制及其包装进病毒衣壳，最终产生不具备整合能力、无法复制但具有高效转导能力的病毒颗粒，同时避免野生型病毒的复制4。截至目前，已有八种基于rAAV的基因疗法获得欧洲药品管理局（EMA）或美国食品药品监督管理局（FDA）的上市许可，且使用AAV的临床试验数量持续增长。截至2025年1月，全球登记的AAV临床试验达343项，相比2022年年中时的255项增长了34%5。这一快速发展的临床应用进一步凸显了建立严格质量控制体系以保障患者安全的重要性6。

确保重组腺相关病毒（rAAV）产品在人体使用中的安全性和有效性，需要对关键质量属性（CQAs）进行充分表征，包括数量、效力、纯度、身份、安全性及稳定性。然而，由于这些载体结构复杂，AAV的表征本身仍具有挑战性。AAV是二十面体颗粒，由三种病毒衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3）组成，其组装比例约为1:1:10，而蛋白组装的变异可能影响转导效率7。治疗性DNA载荷必须高保真地包装进衣壳中；在rAAV生产过程中会天然产生异质性的衣壳群体，包括含有完整基因组的衣壳（完整衣壳）、含有部分基因组的衣壳（部分填充衣壳）以及不含遗传物质的衣壳（空衣壳）。此外，不同AAV血清型表现出不同的包装效率、组织嗜性和免疫学特征，因此需要针对特定血清型开发相应的检测方法。除了这些生物学挑战外，测量方式本身也存在一个关键问题。不同实验室采用不同的检测方法、实验方案和数据分析方法来测量相同的CQA，导致相同样品在不同机构报告的结果可能相差数个数量级8。即使在同一实验室内部，试剂、仪器、操作人员或分析设置随时间发生的变化也可能导致同一批次样品的结果出现偏移9。当测量结果无法相互比较时，建立CQAs与临床前或临床结果之间的可靠关联将变得困难，从而增加监管决策的复杂性10,11。​

标准化旨在通过确保测量结果的可比性来解决这一问题。在药物分析领域，标准化包含两个关键方面：使用共同的物理参考标准物质（RSMs）以及遵循协调一致的详细书面标准操作程序（SOPs），从而确保不同实验室在滴度、身份、质量、效价和纯度等指标上的测量结果具有一致性12。参考标准物质是经过充分表征的样品，可作为测量的基准。通过使用相同的参考标准物质对检测方法进行验证，各实验室可将自身的测量结果锚定于一个共同的参考点上，从而减少实验室间的变异，并使得来自不同研究、产品和生产场地的结果能够被可靠地比较13。此外，参考标准物质还可作为实验室内部对照，用于监控检测性能以及长期的一致性14。标准操作程序进一步确保分析方法在不同实验室中以一致的方式执行，最大限度地减少因样品预处理、仪器设备、校准策略、数据处理和操作人员操作差异所带来的变异8,9,12。这两者共同构成了稳健分析标准化体系的基础。

本文系统地探讨了腺相关病毒（AAV）分析中标准化的关键方面。我们考察了参考标准物质（RSM）的类型及其分析应用，评估了当前可用的AAV特异性RSM在适用性方面的表现，并为实验室内部RSM的制备、纯化、表征和储存提供了整合的实用指导。我们进一步指出了当前生产过程中存在的主要挑战以及分析技术的局限性。鉴于RSM本身尚不足够，我们还讨论了标准化操作程序（SOP）作为互补且同等重要的标准化组成部分的作用。本综述旨在为致力于推进检测结果一致性并支持基于科学的AAV基因治疗监管决策的分析科学家、质量专业人员和制造商提供实用参考。

综述与观点

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1. 响应面法：定义与需求

参考标准物质（RSM）按层级结构组织，分为两类主要类型：一级RSM和二级RSM。根据ISO指南30，一级标准被定义为“在特定范围内被指定或广泛认可为具有最高计量学质量的标准，其量值无需参照同种量的其他标准而被接受”。例如，美国药典（USP）、欧洲药典（Ph. Eur.）、英国药典（BP）等来源的参考标准物质，若已通过多实验室研究进行了充分表征，则可作为一级RSM。各生产商随后使用这些一级RSM来校准和确认其专有的工作用参考物质，后者即作为日常质量控制检测中的二级RSM12,15。因此，ISO将二级RSM定义为“通过与同种量的一级标准相比较而赋值的标准”。这种层级结构确保了量值的可追溯性：企业内部的测量结果可追溯至一级标准，而一级标准本身则通过最先进的分析方法进行表征16。使用RSM提供了共同的基准，使生产商能够将分析方法校准并验证至同一参考点，从而实现更准确的测量。因此，监管机构鼓励使用一级RSM来校准企业内部的RSM并验证检测方法，以提高腺相关病毒（AAV）生产的整体一致性17,18。这有助于在不同分析技术之间实现标准化，从而更有效地比较不同实验室和不同产品的重组腺相关病毒（rAAV）表征结果17,19。改进后的可比性有助于深入理解与高剂量或产品相关杂质（如空壳和部分填充的衣壳）潜在相关的安全性风险。最终，这些科学认知可为基于科学证据的监管政策制定提供依据，例如设定完整衣壳的最低阈值，类似于体细胞治疗中≥70%活细胞的标准，从而推动更安全、更可靠的基因治疗产品的发展13,20,21。​

对于重组腺相关病毒（rAAV），多个关键质量属性（CQA）明确表明了标准化的必要性。载体基因组滴度直接决定患者的给药剂量；滴度测定不准确可能导致剂量不足或过量。定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）被广泛用于滴度检测，但如果使用不同的内部标准曲线校准物或实验方案，同一样本的检测结果可能不同11。衣壳含量（即完整、部分填充和空衣壳的比例）是另一个关键的CQA，因为空衣壳和部分填充衣壳可能增加免疫原性或降低疗效6。目前有十余种不同技术用于测定衣壳含量，包括分析型超速离心（AUC）、尺寸排阻色谱联用多角度光散射（SEC-MALS）、质量光度法（MP）、电荷检测质谱（CDMS）、电子显微镜（EM）、阴离子交换（AEX）色谱、毛细管等电聚焦（cIEF）、紫外-可见光谱（UV/Vis）等。此外，衣壳含量还常通过载体基因组滴度与病毒颗粒滴度的比值间接估算，前者由qPCR或dPCR测定，后者由ELISA测定（即PCR/ELISA）22。每种技术测量的是不同的物理特性，因此对同一样本可能报告不同的衣壳含量结果。近期美国国家标准与技术研究院（NIST）开展的一项实验室间比对研究，比较了UV/Vis、AUC、SEC-MALS和PCR/ELISA方法，结果显示不同方法之间及不同实验室之间存在显著差异，其中PCR/ELISA重复性特别差，而尽管AUC被广泛视为参考方法，其在不同实验室间的测定结果仍存在明显偏差8。这些发现表明，降低AAV分析中的变异性需要共享的参考标准物质（RSMs）以及统一的分析流程，详见第5节讨论。

2. rAAV RSM 景观

建立AAV参考标准物质（RSM）的努力已催生出两个提供AAV主要参考标准物质的主要来源。在药典来源中，目前仅美国药典委员会（USP）提供AAV主要参考标准物质。除USP外，美国典型培养物保藏中心（ATCC）也提供AAV主要参考标准物质。此外，市场上还可获得越来越多针对多种血清型的商业次要参考标准物质，这反映了科学界持续致力于解决AAV表征过程中固有的缺乏标准化问题。表1总结了目前可用的AAV参考标准物质及其关键特性。

  1. ATCC 标准
    针对重组腺相关病毒（rAAV）建立参考标准物质（RSM）的首次国际努力始于2010年，当时腺相关病毒参考标准工作组（AAVRSWG）制备了rAAV2的初级RSM，随后于2014年制备了rAAV8。该志愿者组织成员来自五家工业机构、13所大学、美国食品药品监督管理局（FDA）、美国国立卫生研究院（NIH）以及威廉斯堡生物工艺基金会（WilBio），代表了美国、法国、德国和日本四个国家。这些初级RSM旨在作为全行业通用标准，促进非临床和临床研究中不同实验室之间的剂量比较。研究人员在发表成果或将数据提交给监管机构时，应参照此初级RSM报告滴度。生产目标为达到每毫升1 × 1012 拷贝载体基因组（vg·mL-1）的最终滴度，并产出约5,000–10,000支、每支含0.5 mL的样品19。通过一项涉及全球16个实验室的多中心研究，对材料进行了全面表征，包括载体基因组滴度（qPCR）、颗粒滴度（ELISA）、转导滴度（荧光显微镜）、感染性颗粒滴度（TCID50）、纯度（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE））以及载体身份鉴定（凝胶电泳）。此外，还评估了支原体、生物负载、无菌性和内毒素，以确保产品安全性23,24,25。第4节将详细介绍AAV分析表征，包括关键检测方法及其所提供的信息。
    尽管ATCC RSM是AAV领域具有开创性的材料，但其应用受到一定限制，因为这些材料是在十多年前生产的，早于当前许多AAV表征分析方法的广泛应用。例如，原始表征未包含空/满衣壳比例分析，这限制了其在标准化衣壳含量分析中的直接适用性，而衣壳含量现已被视为rAAV的重要质量属性（CQA）。此外，尽管使用了共享的实验方案和试剂，不同实验室在载体基因组滴度、衣壳滴度和感染性滴度方面仍报告了显著的变异性，这表明仅靠共用材料并不能确保测量结果的一致性，成熟且具有详细标准操作程序（SOP）的检测方法同样重要。根据当前供应商信息，这些材料的供应也受到限制，可能进一步阻碍其广泛使用11。根据当前供应商产品信息，AAV2（ATCC VR-1616）每位客户每年仅限领取3支，且供应状态标注为待补充；AAV8（ATCC VR-1816）每位客户每年限领12支。这些限制必然影响这些材料作为全行业通用RSM的广泛和常规使用26,27。
  2. USP 标准
    在药典倡议方面，目前仅有美国药典委员会（USP）生产了AAV的初级RSM。以下表征数据基于USP应用说明28,29,30。2025年，USP发布了针对AAV8满/空衣壳的RSM，旨在标准化衣壳含量分析。为此，USP建立了高浓度（> 3.0E+12 病毒颗粒滴度每毫升（vp·mL-1））和较大体积（300 µL）的RSM，使其适用于多种衣壳含量分析方法。为全面评估USP AAV RSM并确保测量的准确性和精密度，开展了一项涵盖五个独立实验室的多中心协作研究，采用了多种衣壳含量分析技术：分析型超速离心（AUC）、尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）、电荷检测质谱（CD-MS）、显微成像颗粒分析（MP）和紫外/可见光吸收（UV/Vis）。此外，还对AAV样品应用了其他生物物理表征方法，包括肽图分析、下一代测序（NGS）、数字PCR（dPCR）和毛细管凝胶电泳（CGE），以提供更全面的颗粒表征数据28。
    此外，USP开发了一种基于AAV5的定量PCR对照，包含巨细胞病毒（CMV）增强子、鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子、绿色荧光蛋白（GFP）和猴病毒40（SV40）多聚腺苷酸化信号，可用于基因组滴度测定中的标准曲线校准或检测对照。衣壳含量通过SEC-MALS测定，而病毒基因组滴度则通过靶向多个序列的dPCR进行定量。一项包含4个实验室的多中心dPCR研究表明，靶向SV40的检测结果在实验室间变异性较低（CV 11.2%），而靶向ITR的检测变异性较高（CV 36.1%），这可能是由于ITR二级结构干扰所致。因此，指定的参考值基于SV40靶向滴度，为7 x 1010 vg·mL-1,32。在衣壳滴度检测参考物质方面，USP提供了AAV1、AAV5、AAV8和AAV9的衣壳滴度参考材料。这些材料通过SEC-MALS进行绝对衣壳颗粒定量，滴度范围为1x1011至1x1012 vg·mL-1，可作为衣壳滴度检测中的标准曲线校准物或阳性对照30。
  3. 商业标准
    多家商业公司为多种血清型提供AAV满/空RSM，例如PROGEN、AAVnergene和Revvity；以下表征数据和产品规格基于供应商提供的信息，包括产品说明书和应用说明31,32,33,34,35。作为二级RSM，这些材料通常以ATCC RSM为基准进行比对。与药典RSM相比，这些RSM覆盖更广泛的血清型，部分供应商可提供AAV1–13及工程化变体。商业RSM通常针对基本质量属性进行表征，如衣壳滴度（通过ELISA或SEC-MALS）、载体基因组滴度（通过qPCR或dPCR）和衣壳含量（通常仅使用一种分析方法）。
    然而，部分商业材料仅提供小批量，限制了其在多种检测方法开发或跨机构研究中的应用。此外，缺乏通过多中心协作研究、采用多种正交技术（包括稳定性评估）进行的全面表征，从而降低了对指定值的可信度及跨实验室适用性。尽管存在这些局限性，商业RSM在检测方法开发、验证和工艺优化中仍发挥重要作用，当特定血清型缺乏初级RSM时，可作为临时参考标准。
    部分供应商正在致力于更严格的表征流程和更高的透明度，以提升其RSM产品的实用性36,37。
  4. 内部标准
    各实验室也可自行开发内部RSM，这一策略常用于独特的AAV产品，例如衣壳工程化血清型或特定病毒基因组构建体。由于初级和商业二级参考物质价格较高，内部RSM也可能被优先选择以降低成本。在条件允许的情况下，这些内部RSM应与初级RSM进行比对，随后可用于检测方法开发、验证、生产过程中的常规检测或质量控制。使用内部RSM时需考虑若干重要因素：应对其进行全面表征，保留足够数量的样品，并建立监测其长期稳定性的规程。此外，新批次RSM的生产规划至关重要，包括保留足够前一批次材料以实现测量桥接，确保产品开发全过程的连续性20。第3节将详细介绍内部RSM生产的策略，涵盖上游和下游工艺以及分析表征。这些方法共同为内部RSM的制备提供了实用框架。

3. RSM 制造策略：

制备高纯度AAV RSM存在固有挑战。获得100%空衣壳制备物的难点在于以下事实： "空" 衣壳可能含有残留的遗传物质。同样，获得纯净的完整衣壳制备物也十分困难，因为空衣壳和部分填充衣壳具有相似的物理特性，在分离过程中会与完整衣壳共同纯化。10尽管存在这些挑战，生产技术的显著进步现已能够实现对 predominantly full 或 predominantly empty 衣壳群体的有效富集。下文将全面概述当前可用于生产、表征和储存 AAV RSMs 的生产与分离技术、表征方法以及制剂条件。

  1. 上游加工
    与其它生物治疗产品类似，重组腺相关病毒（rAAV）必须在活细胞中生产，最常用的方法是瞬时转染或基于病毒感染的生产平台。目前用于临床级材料的主流方法是在HEK293悬浮细胞中进行三质粒瞬时转染，分别使用三个独立的质粒携带ITR侧翼的转基因、rep/cap 基因以及辅助功能基因；这种灵活且无需辅助病毒的系统支持快速更换血清型和转基因，已被广泛应用于大多数临床项目和已获批产品38。然而，随着生产规模扩大，质粒DNA成本显著上升，成为一大劣势。为降低原材料成本，生产系统已从三质粒简化为两质粒（rep/cap/辅助基因位于同一质粒，转基因位于另一质粒）或单质粒系统（所有基因整合于单一质粒）39,40。HEK293细胞可在贴壁或悬浮条件下培养，两者生产能力相近，但悬浮培养因其更易放大而更受青睐41。
    替代性生产平台包括在Sf9或其他昆虫细胞中使用的杆状病毒表达载体系统（BEVS）、稳定生产细胞系、基于单纯疱疹病毒的系统以及可诱导表达系统。值得注意的是，即使针对相同血清型，不同生产平台所得的空/满衣壳比例可能存在显著差异，文献报道的满衣壳百分比（%full）范围可从8%至超过39%，具体取决于所用平台及特定AAV血清型42​
    选择合适的生产平台并优化上游条件以生成参考标准物质（RSM），需仔细考虑目标衣壳群体的特性。对于目前临床材料和现有RSM最广泛使用的HEK293瞬时转染系统（表1），可通过优化多种工艺参数来提高产量和空/满衣壳比。针对满衣壳RSM，上游工艺优化旨在最大化产量和基因组包装效率，以尽量减少部分填充或空衣壳的形成，因为粗裂解液中的初始空/满比会直接影响下游产物的空/满比。关键参数包括转染时的细胞密度、质粒摩尔比、转染试剂与DNA的比例、收获时间、小分子添加剂（如细胞周期阻滞剂）以及转基因表达盒设计40,43,44,45,46。
    空衣壳RSM通常通过在转染过程中省略转基因质粒来制备，从而阻止衣壳组装后的DNA包装。然而在实际操作中，这些“空”制剂仍常含有污染性DNA，导致其组成异质性，凸显了对其进行充分分析表征的必要性47,48。
  2. 下游加工
    下游工艺（DSP）包括收获、澄清和纯化步骤，旨在获得高纯度的AAV载体产品，同时确保高载体收率和理想的空/满衣壳比例。下游加工通常在转染后72小时开始，通过细胞裂解释放胞内rAAV49。尽管不同血清型的病毒释放方式存在差异，但细胞裂解可确保完全回收胞内rAAV50。裂解可通过冻融循环实现机械裂解，或使用去垢剂缓冲液（如Triton X-100、Tween-20/80、CHAPS）进行化学裂解，其中化学方法因更易于放大而更受青睐49,51。在裂解过程中加入核酸酶处理（如Benzonase），可降解未被包装的载体基因组和残留质粒DNA，避免基因组滴度测定偏差，并降低DNA黏度以利于后续DSP步骤。一种常用于HEK293来源rAAV的裂解缓冲液为50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、0.1% Triton X-100，含Benzonase 25–50 U·mL-1,51。随后通过深层过滤或离心对裂解液进行澄清以去除细胞碎片。切向流过滤（TFF）用于浓缩收获液并置换缓冲液以进行后续纯化，但如果下游纯化步骤能够处理大体积样品，则此步骤可省略。进一步纯化主要采用超速离心（UC）或基于层析的方法52。

    密度梯度超速离心，最常见的是通过氯化铯（CsCl）梯度或碘克沙醇梯度，传统上被用于rAAV纯化，可实现高收率，并有效将满衣壳与工艺相关及产品相关杂质分离53。尽管UC具有不受血清型限制和高纯度的优点，但也存在明显缺陷，包括需手动操作、难以大规模处理大体积样品以及劳动强度高。柱层析技术作为替代方案逐渐成为首选，因其具备可放大性、处理速度快和可自动化等优势，已成功应用于临床级rAAV及rAAV参考标准物质（RSM）的生产。rAAV的柱层析通常分为两个连续步骤：捕获和精制52,54。

    亲和层析作为主要的捕获步骤，利用固定化配体与树脂结合AAV衣壳，同时去除大部分工艺相关杂质。近年来，单域抗体片段（VHH）因其在多种血清型中的通用性和高特异性，已成为首选配体。常用的抗体基质层析柱包括POROS CaptureSelect AAVX、AVB Sepharose High Performance和Capto AVB51。其中POROS CaptureSelect AAVX具有最广泛的特异性，可结合AAV1–9、rAAV-10及工程化变体，适用于不依赖血清型的纯化55​，目前已被广泛用于大多数商业化rAAV RSM的纯化（表1）。由于亲和层析无法区分满衣壳与空衣壳（因两种变体均含有相同的表位），因此需要进一步的精制步骤。精制步骤通常采用阴离子交换层析（AEX）来分离满衣壳与空衣壳。该方法利用满衣壳（pI ~5.9）与空衣壳（pI ~6.3）之间微小的等电点差异52。目前市场上有三种固定相形式：填充树脂、整体柱和膜柱53。针对AAV在这三种形式之间的性能比较数据尚有限。然而，整体柱和膜柱支持更高的对流驱动流速，因此在需要缩短处理时间的大规模生产中更具优势。填充树脂依赖扩散限制的质量传递且背压较高，限制了流速56,57。Jungbauer等人的一篇综述中列出了多种市售AEX层析柱51。在洗脱方面，逐步盐梯度正逐渐取代平缓连续盐梯度，因为固定盐阶对仪器差异（如泵混合、流速）的敏感性较低，相比连续变化的梯度更有利于提高重现性并减少缓冲液消耗52。优化后的AEX方案可在多种血清型中实现>90%的满衣壳纯度58。然而，与UC不同，AEX尚未能可靠地分离部分填充的衣壳，且每种血清型均需单独优化，因其电荷谱随血清型而异51。值得注意的是，大多数商业化RSM纯化工艺将亲和捕获层析与超速离心（碘克沙醇或CsCl）结合使用，即在初步去除杂质后利用UC实现高纯度精制（表1）。
  3. 制剂
    AAV制剂的优化对于确保RSM的稳定性及其保质期至关重要。制剂设计涉及辅料选择、渗透压调节、缓冲体系、表面活性剂选择以及离子强度控制，以最小化聚集。最常见的缓冲体系包括磷酸盐、Tris、乙酸盐、柠檬酸盐和乳酸盐，通常在不同血清型中维持pH值在7.4 ± 0.3范围内。辅料是AAV制剂中常见的稳定剂，包括NaCl、KCl、泊洛沙姆188（Px188）、MgCl₂、CaCl₂、蔗糖、PS20、山梨醇、甘露醇、甘油和人血清白蛋白。通常在约0.001%浓度下使用Px188，以减少界面和机械应力，从而在操作和冻融过程中限制衣壳破裂和滴度损失59。渗透压是人体给药时的重要考量因素，但对于研究级RSM而言重要性较低60。大多数商业化RSM采用基于PBS的缓冲液，有时额外添加盐类。供应商建议在-80 °C下储存，并避免多次冻融循环，因为这可能导致冰-水界面处衣壳破裂，进而引起滴度下降34,61。

4. 分析表征：定义标准

在参考标准物质（RSM）制备、纯化和制剂完成后，需进行全面的分析表征。该步骤可确保RSM的质量及其作为不同分析方法间参考物质的适用性。建议采用正交分析技术来评估相同的质量属性，这对于确保分析结果的稳健性尤为重要。腺相关病毒（AAV）RSM的关键质量属性可具体分为三类：滴度、鉴别和纯度，如表2所列。

  1. 滴度
    RSM 表征包括测量滴度，即载体基因组滴度和衣壳颗粒滴度，用以提供有关存在的载体基因组和衣壳数量的信息。基因组滴度通常通过靶向目的基因、ITR 或其他表达盒元件的定量 PCR（qPCR）或数字 PCR（dPCR）进行测定，其中检测设计及引物/探针的位置对结果有显著影响。基于 ITR 的检测方法不受血清型限制且适用范围广，但 ITR 的发夹结构可能阻碍引物结合，且当部分填充但仍保留 ITR 序列的衣壳存在时，此类检测可能高估滴度；已有研究表明，与靶向表达盒的检测相比，ITR 靶向 qPCR 对 AAV2 和 AAV8 RSM 的基因组滴度存在高估现象11。qPCR 的另一个偏差来源是使用双链质粒 DNA 作为校准物，其扩增动力学与单链 rAAV 基因组不同29。
    dPCR 通过泊松统计实现绝对定量，克服了上述两个局限，无需依赖标准曲线，且已被证明受 ITR 二级结构干扰的影响较小62。值得注意的是，当使用基于 rAAV 而非质粒的校准物进行校准时，qPCR 可达到相当的准确性，是一种更具成本效益的替代方案63。适当的样品预处理同样重要。DNase 处理可去除外部 DNA，确保仅对包裹在衣壳内的基因组进行定量，且必须在衣壳裂解前通过蛋白酶 K 或加热处理使 DNase 失活64,65,66。我们研究团队已发表了一种针对纯化载体样品的优化且经过验证的 ddPCR 基因组定量方案67。
    衣壳颗粒滴度通常通过 ELISA 或 SEC-MALS 测定。ELISA 具有高特异性和抗基质干扰能力强的优点，但具有血清型特异性、依赖标准曲线且操作繁琐。SEC-MALS 不受血清型限制且速度更快，但需要专用仪器设备22。
  2. 同一性
    同一性评估旨在确认所生产的 AAV 符合预期的血清型和基因组序列，排除蛋白和 DNA 水平上的非预期改变。衣壳蛋白的同一性指血清型鉴定。常用方法包括使用血清型特异性抗体的 ELISA 和蛋白质印迹（WB）。近年来，高效液相色谱联用质谱（LC-MS）作为一种高阶、互补的方法，在血清型鉴定和衣壳组成分析方面因其高重复性、准确性和稳健性而受到关注，尽管其通常不用于常规的内部 RSM 表征6,22。载体基因组的同一性可通过测序方法（如纳米孔测序）进行评估。该方法可对完整的 AAV 基因组进行长读长覆盖，从而准确确定序列同一性22。
  3. 纯度
    AAV RSM 的第三个重要质量参数是纯度，包括蛋白纯度、衣壳和基因组完整性、衣壳内容物及聚集情况。衣壳完整性通过验证 VP 摩尔比（VP1:VP2:VP3 ≈ 1:1:10）进行评估，常用方法包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS）或 WB，其中 WB 还可同时提供衣壳蛋白同一性的确认22。
    基因组完整性（即目的基因是否完整或截短）可通过琼脂糖凝胶电泳（AGE）、多重 ddPCR 或基于测序的方法（如纳米孔测序）进行评估。AGE 方法简单，但分辨率和特异性有限。多重 ddPCR 可提供凝胶方法无法实现的定量、区域特异性数据，但需要更复杂的检测开发22,68。
    衣壳内容物通常通过将基因组滴度除以衣壳滴度进行估算；然而，该方法依赖于两个独立的检测，可能引入额外变异性，因此不推荐用于 RSM 表征。对于该属性，变异度更低的更合适技术包括分析型超速离心（AUC）、SEC-MALS、显微成像颗粒分析（MP）、电荷检测质谱（CD-MS）和紫外/可见光吸收光谱（UV/Vis）8,69,70,71,72,73。近年来的发展进一步提升了 AUC 和 SEC-MALS 作为多属性检测方法的价值。特别是多波长 AUC（MWL-AUC），不仅能区分空衣壳、部分填充衣壳和完整衣壳，还可评估基因组滴度、衣壳滴度及聚集情况71,74。类似地，SEC-MALS 可在单次检测中提供衣壳滴度、基因组滴度、纯度、聚集情况以及完整/空衣壳比例的信息73,75。聚集情况也可通过动态光散射（DLS）进行监测。传统上，只有 AUC、MP 和 CDMS 能够提供足够分辨率以定量部分填充的衣壳。然而，最近已开发出一种增强型透射电子显微镜（TEM）方法，其在定量部分填充衣壳方面的准确性可与沉降速度 AUC（SV-AUC）和 MP 相媲美76。由于目前尚无单一方法被确立为衣壳内容物检测的金标准，且这些技术基于不同的分析原理，建议采用多种互补方法以获得对整体纯度的全面评估10。
  4. 稳定性
    长期稳定性对 RSM 至关重要，因为参考值必须保持恒定，以确保随时间推移的可靠校准。AAV RSM 通常储存于 ≤ -70 °C 以维持衣壳和基因组的完整性。一项针对 AAV8 RSM（ATCC VR-1816）的多实验室稳定性研究表明，在 < -70 °C 条件下，载体基因组滴度、感染性滴度和衣壳滴度至少两年内保持稳定77。稳定性测试程序可遵循 ICH Q1A 指南，在规定时间点进行关键属性评估：第一年每 3 个月一次，第二年每 6 个月一次，之后每年一次78。在加速储存条件（2–8 °C）下的短期稳定性通常在 1、2 和 4 周进行评估79。关键的稳定性指示性属性包括基因组滴度、衣壳滴度、衣壳内容物、衣壳蛋白完整性和聚集情况。RSM 还应评估其对冻融循环的敏感性80。

5. 统一的标准操作程序作为 AAV 分析标准化的第二根支柱

除了需要提供特征明确的参考标准物质（RSM）外，AAV分析中的有意义标准化还需要统一且足够详细的标准化操作程序（SOP）。即使采用相同的分析方法，由于样品预处理、仪器设置、校准策略、数据处理和结果判读标准等方面的差异，不同实验室之间的结果仍可能存在显著差异，这些因素已被证明会独立于分析平台本身而导致实验室间变异8,9。

这一点在一项由美国国家标准与技术研究院（NIST）、国家生物制药制造创新研究院（NIIMBL）和美国药典委员会（USP）联合开展的多实验室研究中得到了体现，六家实验室采用四种方法对相同的AAV5和AAV8样品进行了衣壳含量检测。光学方法（包括SEC-MALS和紫外/可见光谱法）显示出最佳的实验室间一致性，而PCR-ELISA重复性较差，被认为在缺乏进一步标准化的情况下不适用于定量分析。尽管沉降速度分析超速离心法（SV-AUC）被广泛视为金标准方法，但其在不同实验室间的变异性却高于SEC-MALS，因此后续开发标准化SV-AUC操作流程已被确定为重要的下一步工作8,81。

在使用数字PCR（dPCR）进行基因组滴度测定时，也得出了类似的结论：样品预处理、提取策略、仪器平台、稀释条件、衣壳裂解时机以及冻融历史等因素均可能影响报告结果。重要的是，更严格的实验流程控制已被证明可显著降低变异性，进一步凸显了标准化操作程序（SOP）统一化的重要价值9。

因此，参考标准物质（RSMs）和标准操作程序（SOPs）应被视为腺相关病毒（AAV）分析标准化的两个相辅相成的支柱。RSMs 提供了实现可追溯性和校准所需的测量基准，而 SOPs 则可降低操作过程中的变异性，并有助于确保在不同操作人员、仪器和实验室之间一致地复现赋值结果。

结论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重组腺相关病毒（rAAV）基因治疗的发展速度已超过该领域对质量属性进行一致表征的能力。本综述表明，阻碍AAV表征结果可比性的主要障碍并非分析工具的缺乏，而是缺少共享的测量基准和标准化的操作流程。参考标准物质（RSMs）通过将依赖于方法的测量结果转化为可追溯、可比较的数值，解决了这一挑战。RSMs能够支持方法学验证，提高实验室间的可重复性，并提供持续的质量监控以检测检测方法的漂移。然而，由于难以获得高纯度的空壳与全壳衣壳样品、需要全面的正交表征手段，以及必须在明确的储存条件下保持长期稳定性，制备高质量AAV RSMs在技术上仍具挑战性。近年来在生产和纯化技术方面的进展，已实现主要为空壳或全壳衣壳的样品制备，可用于内部RSMs的建立；同时，药典机构（USP）、协作联盟（ATCC）及商业供应商当前提供的RSMs产品也标志着显著进展。然而，不同血清型、载体基因组以及日益增多的工程化衣壳变体的多样性，从根本上限制了通用型AAV RSMs的开发。与单克隆抗体不同，AAV的高度异质性要求针对特定血清型和特定应用开发专用的RSMs。这一复杂性因杂交或工程化衣壳的出现而进一步加剧，迫使研发者维持专有的内部一级参考标准，从而导致测量体系的碎片化。此外，其他质量属性如翻译后修饰（PTM）已被视为潜在的关键质量属性（CQA），但目前仍缺乏针对PTMs的充分表征的RSMs，造成对该类载体属性认知上的关键空白。除了RSMs的可获得性外，标准化操作程序（SOPs）的统一同样至关重要。该领域亟需由药典机构发布的标准详细检测方法（即通则方法），以确保所有实验室对AAV关键质量属性执行一致且受控的检测。针对常用方法撰写的最佳实践指南文件将进一步减少实验室间的差异，并推动分析流程的标准化。通过建立可追溯的AAV测量RSMs，并实施一致且准确的表征实践，科学界将能够加强关键质量属性与安全性和有效性之间关联的科学基础，支持监管决策的信心，并最终向患者提供更安全、更可靠的基因治疗产品。

表1：目前可用的rAAV RSM及其特性

本表格总结了现有的重组腺相关病毒（rAAV）参考标准物质及其关键特性。请点击此处下载该表格。

表2：实验室内部RSM表征推荐的分析方法组合

本表格总结了推荐用于实验室内部RSM表征的分析方法。请点击此处下载该表格。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该项目获得了欧盟研究与创新框架计划“地平线欧洲”（Horizon Europe）的资助，资助协议编号为101119880。本项目还获得了比利时弗拉芒政府提供的“弗拉芒韧性”（Flanders Resilience）补贴，该补贴来源于“欧洲复苏与韧性基金”（RRF）（VV021/13）。

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