多能干细胞向原始生殖细胞样细胞分化的实验方案

摘要

一种利用基底膜提取物覆盖的二维单层培养方法，从人诱导性多能干细胞稳健地生成原始生殖细胞样细胞的逐步操作指南。

摘要

利用人类多能干细胞分化 体外 显著拓宽了对早期发育过程中谱系特化事件的理解 体内，这一时期极难进行研究。在人类胚胎中，最早被确定的胚胎谱系之一是生殖细胞谱系，其标志是始祖生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）的诱导。PGCs 是个体生命后期配子的唯一前体细胞群体，其特化是实现生物体生育能力的关键第一步。本文介绍了一种从人诱导性多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）高效生成类始祖生殖细胞（PGC-like cells, PGCLCs）的稳健方案，首先对hiPSCs的多能性状态及细胞特性进行评估，以确保其具备有效的PGCLC分化潜能。为此，本文讨论了不同细胞密度、培养板包被材料以及所用hiPSCs品系对PGCLC分化的影响。最后，提供了利用免疫荧光染色和流式细胞术对hPGCLCs进行鉴定与定量分析的工作流程。该分化方案聚焦于大多数实验室易于建立和验证的实验条件，并可根据需要进行调整。此外，该方案操作快速，可及时判断特定hiPSCs是否适用于PGCLC分化。本方案旨在提升不同hiPSCs品系和培养平台之间hPGCLC分化结果的一致性与可比性，确保获得稳定且充足的细胞产量，以支持后续分化步骤的可靠鉴定与进一步优化，从而最终实现 体外 人类配子发生

引言

人类生殖系发育是一个高度协调的过程，始于胚胎发育早期，最初为原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）的特化，这类细胞最终将发育为卵细胞和精子细胞¹。In vivo条件下，PGC的特化发生在胚胎着床后不久^2,3，由邻近细胞提供的诱导信号所触发^4,5。PGC的发育过程在啮齿类动物中已得到广泛研究，尤其是通过遗传学研究揭示了BMP、WNT和TGFβ等信号通路的参与^6,7,8,9。在特化之后，PGC经历表观遗传重编程，其特征为全基因组范围的DNA去甲基化和染色质重塑，从而最终建立（性别特异性的）生殖系身份^{10,11,12,13,14}。

在哺乳动物中，原始生殖细胞（PGC）的特化由多种信号通路之间的协调相互作用所驱动，某些方面在人类、非人灵长类、猪和小鼠之间具有进化上的保守性，包括多能性因子 POU5F1 和 NANOG 的参与^{9,15,16,17,18}。尽管存在共有的特征，不同物种在 PGC 分化机制和基因调控网络上的特异性差异限制了从动物模型到人类的直接转化应用^9,19,20,21。

为了理解人类的配子发生过程，必须开展使用人类材料的研究，但由于难以获得早期人类胚胎，此类研究仍然面临挑战。近年来，体外（in vitro）从人类多能干细胞（如诱导性多能干细胞，hiPSCs）分化产生人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）的技术不断取得进展，这减少了对人类性腺组织的依赖，同时实现了规模化培养和遗传学研究^18,22。目前大多数成熟的hPGCLC分化策略依赖于三维（3D）细胞聚集体或类胚体¹⁸。利用这些平台，多项研究已表明，hPGCLCs能够重现早期人类原始生殖细胞（PGCs）的关键表观遗传特征，包括生殖系特异的转录程序^23,24以及全基因组范围的DNA甲基化重编程过程²⁵。总体而言，这些体外（in vitro）模型显著推动了人类原始生殖细胞生物学的研究，包括谱系特化和表观遗传重置机制的解析。然而，基于细胞聚集的hPGCLC分化方案仍存在挑战，其过程耗时较长，且获得的hPGCLC总量有限，难以满足可靠的表观遗传学分析、进一步的分化实验或高通量实验应用的需求。

最近，一种基于二维单层、无饲养层的方法被证明相对容易在组织培养板中扩大规模，并在较短的分化周期（5天）内实现较高的分化效率（约55%）²⁶。该方法使用稀释的基底膜提取物（BMEx）并结合低浓度BMP4，以诱导hiPSCs分化为hPGCLCs。与其他需要在诱导前进行Activin A预处理、并使用较高浓度BMP4（40–50 ng/mL）的二维系统相比^27,28，该BMEx方法无需预诱导步骤，且仅需较低浓度的BMP4（10 ng/mL），同时保持了相当的分化效率和更优的可扩展性。

本文提供了一种详细的二维人原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）BMEx分化方案的逐步操作指南，首先从人诱导多能干细胞（hiPSC）培养的初始评估开始，包括多能性及细胞特征的鉴定，随后测试不同hiPSC培养板包被材料和细胞密度对hPGCLC分化的影响。此外，还描述了通过流式细胞术分析和免疫荧光进行的下游表征方法。文中提供了关键操作要点及故障排除建议，以减少实验偏差，帮助研究人员在该二维体系中稳定重复hPGCLC的分化过程。

方案

本方案遵循莱顿大学医学中心（LUMC）及LUMC生物样本库的指南与规定 & 生物材料（TCBio）以及莱顿大学医学中心莱顿hiPSC中心（编号BB24.037）提供。本方案中使用的所有材料及对照男性（XY）hiPSC细胞系（M54和M199）均列于下文 材料表所有组织培养操作均在专用的生物安全二级组织培养室中进行，配备有加湿的常氧培养箱（37 °C，5% CO₂）₂多功能台式离心机（摆动吊篮转子）和配备体视显微镜的II级生物安全柜。

注意：并非所有 hiPSC 细胞系都能分化为 hPGCLC^26,29。然而，若使用其他 hiPSC 进行 PGCLC 分化并观察到 PGCLC 的生成，则本文所述方法（图 1A）可实现 hPGCLC 产量的扩增。

1. 人诱导多能干细胞培养用组织培养板的包被

本方案描述了使用稀释的BMEx和玻连蛋白包被组织培养板的方法。

1. 基底膜提取物（BMEx）包被
   1. 将一份BMEx在冰上解冻。可以使用Geltrex、Cultrex或Matrigel。
   2. 用冷的DMEM/F12将BMEx等分试样稀释至终浓度为1%（v/v），并轻轻重悬。
   3. 每孔加入1 mL稀释后的BMEx，包被6孔板中所需数量的孔。
   4. 将包被好的培养板在37 °C孵育至少30分钟。
      注意：包被好的培养板可在2–8 °C保存最多1周。使用在2–8 °C保存的包被板时，使用前需在37 °C孵育至少10分钟。
2. 玻璃粘连蛋白（vitronectin）包被
   1. 在室温（RT）下解冻一份玻璃粘连蛋白10–15分钟。
   2. 用不含钙和镁的DPBS（DPBS -/-）将玻璃粘连蛋白稀释至终浓度为5 µg/mL，并轻轻重悬。
   3. 每孔加入1 mL稀释后的玻璃粘连蛋白，包被6孔板中所需数量的孔。
   4. 将包被好的6孔板在室温（RT）下孵育1小时。

2. hiPSCs 维持传代

1. 准备培养基：使用无血清细胞培养基 mTeSR Plus，并添加支原体污染预防溶液（MycoZap（1:1000））。
2. 吸除准备传代的细胞中的培养基。
3. 向每个孔中加入 0.5 mL 人多能干细胞选择与传代试剂（ReLeSR），作用 1 分钟内吸除，确保细胞表面仅残留极薄一层。
4. 将细胞在 37 °C 条件下孵育 6 分钟。
5. 轻轻敲击 6 孔板的侧壁数次。
6. 使用 1 mL 培养基，用 p1000 移液器反复吹打，小心地将细胞吹下，并定期检查集落片段的大小，确保其大小维持在 50–200 µm 之间。
7. 取出预先包被的 6 孔板，吸除包被溶液（步骤 1）。
8. 向每个孔中加入 2 mL 培养基。
9. 将含有已解离的 hiPSC 集落片段的培养基按所需比例转移至新孔中。
   注意：hiPSC 集落片段的最佳传代比例为 1:6–1:50，可实现每 4–7 天传代一次。
10. 将含有传代后 hiPSC 集落片段的细胞培养板置于加湿的常氧培养箱中（37 °C，5% CO₂）。
11. 每隔一天更换一次培养基，每次加入 2 mL 新鲜培养基，直至 hiPSC 再次达到传代条件。
    注意：为避免周末更换培养基，每个 6 孔板可加入 4 mL 培养基代替 2 mL。
    警告：当细胞融合度过低时不得进行传代；当细胞融合度过高时应弃去培养物，以维持健康的 hiPSC 培养状态并防止自发分化。

3. hPGCLC 分化

1. hPGCLC 分化前的准备（第 0 天）。
   1. 在开始 hiPSCs 向 hPGCLC 分化前 1 小时更换培养基。
   2. 配制包被液：将1% BMEx溶液用冷的DMEM/F12按体积比稀释。
   3. 用0.5 mL包被液包被12孔板中所需数量的孔。
   4. 将包被好的培养板在37 °C孵育至少30分钟，然后再开始诱导分化。
   5. 制备包被培养基：将2%（v/v）BMEx溶液加入冷的培养基中，并添加解冻后复苏培养基（RevitaCell），终浓度为1:100。
      ​注意：在人诱导多能干细胞（hiPSCs）的制备和接种过程中，需将铺板培养基置于冰上保存。
2. 用于hPGCLC分化的hiPSC铺板（第0天）
   1. 从六孔板中移除用于hPGCLC分化的hiPSC培养基。起始使用的hiPSC应为高质量状态，细胞融合度为50–80%，且无自发分化迹象。
   2. 每孔加入 1 mL 胰蛋白酶溶液（TrypLE）。
   3. 将hiPSCs在37 °C下孵育5分钟。
   4. 用移液器轻轻重悬hiPSC集落2–3次，制备单细胞悬液。
   5. 在倒置显微镜下检查是否已获得单细胞悬液。若未获得，使用p1000移液器将hiPSC集落重新吹打1–2次。
   6. 将hiPSC细胞悬液转移至15 mL离心管中。
   7. 向15 mL离心管中加入4 mL DMEM-F12培养基。
   8. 将 hiPSC 细胞悬液在 200 x g 5 分钟。
   9. 吸弃上清液，并用0.5–1.0 mL铺板培养基小心重悬hiPSC细胞。
   10. 使用细胞计数器或血细胞计数板对hiPSCs进行计数，并计算每孔用于hPGCLC分化的hiPSCs所需数量。
       注意：作为起始点，建议接种密度为 40–80K 个细胞/cm²² 可使用。然而，针对每种细胞系及每一代次，建议优化铺板密度以获得最佳产量。此处，hiPSCs 的铺板密度为每平方厘米 10K 至 100K 个细胞².
   11. 将所需数量的hiPSCs用适量铺板培养基重悬（每12孔板孔加1 mL），使用p1000移液器确保获得均匀的细胞悬液。
   12. 从培养箱中取出包被的12孔板，并移除包被液。
   13. 向12孔板的每个孔中加入1 mL细胞悬液。
   14. 轻轻振荡培养板，确保细胞在孔中均匀分布。
   15. 将12孔板置于加湿、常氧培养箱（37 °C，5% CO₂）中₂16–24 小时
3. hPGCLC 分化（第1–2天）
   1. 制备RB27基础培养基：将Advanced RPMI1640与B-27（1:100）、1×氨基酸替代物（Glutamax）、1×MEM非必需氨基酸和支原体污染预防溶液（1:1000）混合。
   2. 制备分化培养基：将2%（v/v）BMEx溶液加入冷的RB27基础培养基中，并添加BMP4至终浓度为10 ng/mL。基底膜提取物对于诱导管腔形成及启动原始生殖细胞样细胞（PGCLC）特化是必需的。 体内.
      注意：将诱导分化培养基置于冰上或4 °C保存。诱导分化培养基可提前配制，用于分化程序的第1天和第2天。
   3. 第1天（接种 hiPSCs 后16–24小时），从培养箱中取出培养板，弃去接种培养基。
   4. 每孔加入 0.5 mL RB27 基础培养基洗涤孔内。
   5. 吸去 RB27 基础培养基，每孔加入 1 mL 分化培养基。
   6. 将培养板连同细胞放回加湿的常氧培养箱（37 °C，5% CO₂）中₂).
   7. 在分化第2天，每孔加入1 mL分化培养基更换培养液。
4. hPGCLC 分化（第 3–5 天）
   1. 制备转换培养基：在RB27基础培养基中添加BMP4（10 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、SCF（50 ng/mL）和EGF（50 ng/mL）。转换培养基模拟 体内 从人原始生殖细胞（hPGC）特化转变为细胞存活与增殖阶段。由于管腔形成已不再必要，故省略BMEx。
   2. 第3天和第4天，每孔更换1 mL转换培养基。
   3. 在分化第5天，可使用免疫荧光或流式细胞术对hPGCLCs进行表征。

通过免疫荧光和流式细胞术对人原始生殖细胞样细胞进行表征

1. 通过免疫荧光进行表征。
   1. 配制透化溶液：将 0.3% Triton X-100 溶于 PBS 中。
   2. 配制洗涤溶液：将 0.05% Tween 20 溶于 PBS 中（PBST）。
   3. 配制封闭溶液：将 1% 牛血清白蛋白（BSA）溶于 PBST 中。
   4. 移除用于 hPGCLC 分化的孔板中的换液培养基。
   5. 每孔加入 1 mL DPBS (-/-) 洗涤细胞。
   6. 每孔加入 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液，室温固定 15 分钟。
   7. 使用 1 mL/孔的 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
      注意：此时可将培养板在 4 °C 下保存，待后续进行免疫荧光染色。
   8. 每孔加入 1 mL 透化溶液，室温透化 15 分钟。
   9. 使用 1 mL/孔的洗涤溶液洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
   10. 每孔加入 1 mL 封闭溶液，室温封闭 1 小时。
   11. 配制一抗溶液：将目标一抗用封闭溶液稀释。
       注意：此处使用了以下两种 PGC 标志物抗体组合：山羊抗 SOX17 与兔抗 TFAP2C，以及山羊抗 SOX17 与小鼠抗 POU5F1（材料表）。
   12. 移除封闭液，每孔加入 0.4 mL 一抗溶液，4 °C 孵育过夜。
       注意：为评估非特异性抗体结合，必须设置阴性对照。具体操作为：保留一孔仅加入封闭液（不加一抗），后续仍使用二抗溶液进行染色。
   13. 次日，移除一抗溶液，使用 PBST 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
   14. 配制二抗溶液：将目标二抗（材料表）与 DAPI（1:500）用封闭溶液稀释。
       注意：二抗溶液对光敏感，应避光保存。
   15. 移除 PBST，每孔加入 0.4 mL 二抗溶液，室温避光孵育 1 小时。
   16. 使用 1 mL/孔的 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
   17. 对细胞进行成像（使用 20 倍物镜）。
       注意：免疫荧光图像使用 Airyscan 显微镜上的 20 倍物镜采集，明场图像则使用 EVOS 显微镜上的 4 倍和 10 倍物镜采集。
2. 通过流式细胞术进行表征
   1. 配制 FACS 缓冲液：将 0.5% BSA 溶于 DPBS (-/-) 中。
   2. 移除含有 hPGCLC 的孔板中的培养基。
   3. 每孔加入 1 mL DPBS (-/-) 洗涤细胞。
   4. 每孔加入 0.5 mL 预热的 Accutase，37 °C 孵育 15 分钟。由于 hPGCLC 对解离过程高度敏感，推荐使用 Accutase 而非胰蛋白酶溶液进行细胞解离。
   5. 使用 p1000 移液器轻柔吹打细胞 2–3 次，制成单细胞悬液。
   6. 在倒置显微镜下检查是否获得单细胞悬液。若未完全解离，再用 p1000 移液器吹打 1–2 次。
   7. 将细胞悬液通过 40 µm 滤网过滤至 15 mL 离心管中。
   8. 用 5 mL FACS 缓冲液冲洗 40 µm 滤网。
   9. 将细胞悬液在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
   10. 移除上清液。
   11. 将细胞沉淀重悬于 1.5 mL 管中的 0.3 mL FACS 缓冲液中。
       注意：可选择使用细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数。若进行计数，预期每孔 12 孔板可获得约 100 万个细胞。
   12. 为流式细胞术准备适当的对照样本（未染色对照和单染对照）。将 15–30 µL 细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中，并用 FACS 缓冲液补足至 100 µL。
       注意：本研究中制备了 3 种单染对照：EPCAM-PEcy7（1:200）、ITGA6-BV421（1:200）和 7AAD（1:200）。含偶联抗体和 7AAD 的溶液对光敏感，应避光保存。
   13. 将目标偶联抗体直接加入细胞悬液中，达到适当稀释比例。此处联合使用了以下针对 PGC 标志物的偶联抗体：EPCAM-PEcy7（1:200）和 ITGA6-BV421（1:200）（材料表）。
   14. 将细胞与偶联抗体在冰上避光孵育 30 分钟。
   15. 向样本、未染色对照及单抗体对照中各加入 1 mL FACS 缓冲液，在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
   16. 移除上清液。
   17. 将样本重悬于 0.5 mL、对照样本重悬于 0.2 mL 含 1 mM EDTA 的 FACS 缓冲液中，以防止细胞聚集。
   18. 将样本和对照加入带滤网帽的 5 mL 流式管中，通过滤网过滤。
   19. 在上机检测前数分钟，直接向各样本中加入 7AAD。
   20. 使用流式细胞仪检测样本。本实验使用基于荧光的细胞分析仪进行检测，数据通过 FACSDiva 软件（v9.0）采集，并使用 FlowJo 软件（v10.10.0）进行数据分析。
   21. 利用对照样本（未染色和单抗体对照）设置门控策略，并在必要时进行补偿调节。
   22. 上机前将样本涡旋混匀。
   23. 首先根据前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）设定门控，从所有事件中提取细胞群体。
   24. 从该细胞群体中，根据细胞大小（FSC-W 和 FSC-H）和颗粒度（SSC-W 和 SSC-H）进一步筛选单细胞。
   25. 通过设定 7AAD 阴性门控排除死细胞，用于后续分析。
   26. 使用样本检查门控设置是否恰当，并在必要时进行调整。
   27. 从该活细胞群体中分析目标标志物。此处，同时表达 EPCAM 和 ITGA6 的门控细胞即为 hPGCLC。

结果

hiPSCs 的质量和稳定状态对于后续分化至关重要
在进行分化实验和分析之前，hiPSCs 需在6孔板中至少传代3次（使用不同的包被条件）。当细胞集落达到70–80%融合度时进行传代（图1B），此融合度也是启动hPGCLC分化的最佳hiPSC融合度。健康的hiPSC培养物表现出均一的集落形态，无暗区或分化区域，在明场图像中清晰可见（图1B）。然而，当hiPSC集落未维持在最佳融合度或出现分化迹象时，其质量会受到影响（图1B）。在低融合度下，hiPSC会持续增殖，需要更长时间形成集落，直至融合度适合传代或分化实验；在高融合度下，hiPSC会相互堆叠生长，并出现分化区域。hiPSC的多能性状态通过检测SOX2和POU5F1的表达来确认，这两种转录因子对维持hiPSC的多能性和自我更新至关重要³⁰，尤其重要的是，hPGCLC不表达SOX2³¹。使用鬼笔环肽（Phalloidin）染色评估细胞骨架组织和集落形态，以反映hiPSC的质量。请注意，细胞形态的差异与SOX2或POU5F1表达的减少相关（图1B）。

hiPSC 维持基质对 hPGCLC 分化的影响
为了评估在不同包被基质上维持 hiPSC 是否会影响其向 hPGCLC 的分化能力，将 hiPSC 培养在不同基质（Geltrex、Matrigel、Cultrex 和纤连蛋白）上（图 2）。在所有基质上，hiPSC 均表现出强而均匀的核内 SOX2 或 POU5F1 水平，表明其处于多能状态。在 Geltrex、Matrigel 和 Cultrex 上维持的 hiPSC 克隆形态相似，均具有清晰的克隆边界和不规则的整体形状，而纤连蛋白上的克隆则呈圆形（图 2）。当 hiPSC 达到 70–80% 汇合度时，以 40K 细胞/cm² 的密度接种，并在 Geltrex 上诱导分化为 hPGCLC²⁶。在第 5 天，明场图像显示在所有条件下均出现典型的 hPGCLC 克隆（图 3）。此外，在所有条件下均检测到三重阳性 SOX17/TFAP2C/PDPN 或双重阳性 SOX17/POU5F1 的 hPGCLC（图 3）。这表明该分化方案可用于在不同培养条件下维持的 hiPSC。

初始hiPSC细胞密度对hPGCLC分化的影响
由于不同hiPSC系的增殖速率存在差异，因此在Geltrex基质上确定最佳接种密度以实现高效的hPGCLC分化至关重要。此外，若随着hiPSC连续传代导致hPGCLC分化效率下降，建议调整hiPSC的接种细胞密度。为评估接种密度对hPGCLC分化效率的影响，将hiPSC以10K至100K个细胞/cm²的不同密度进行接种（图4A）。在第5天，通过流式细胞术检测hPGCLC的比例，使用两种针对人原始生殖细胞标志物的偶联抗体：EPCAM和整合素α6（ITGA6）³²。流式细胞术分析采用标准的逐级设门策略，以在40K个细胞/cm²密度下接种的M199 hiPSC为例进行展示（图4B）。简而言之，首先对总细胞群体（所有事件）设门以排除碎片（颗粒面积），然后根据细胞大小（FSC）和颗粒度（SSC）筛选单细胞，最后根据7AAD染色排除死细胞。随后，利用染色与未染色样本设定用于定量表达EPCAM-cy7和ITGA6-BV421细胞的门（图4B）。

通过比较不同接种细胞密度以及在不同基质上培养的hiPSC在hPGCLC分化效率上的差异，结果显示存在密度依赖性趋势（图4C）。在接种密度为20–40K个细胞/cm²时，M54和M199 hiPSCs产生的EPCAM+/ITGA6+双阳性hPGCLCs比例最高，这些hiPSCs是在Geltrex和Cultrex基质上维持培养的。有趣的是，较高的细胞密度导致分化效率降低。利用PGC标志物SOX17/TFAP2C/PDPN或SOX17/POUF51对hPGCLCs进行免疫荧光染色，结果验证了流式细胞术的分析结果（图4D）。这些结果表明，针对特定的hiPSC系优化接种密度对于获得最佳分化效率至关重要。结合免疫荧光染色与流式细胞术可增强hPGCLC分化检测的可靠性。

图 1：hPGCLC 分化流程及 hiPSCs 的质量评估。（A）本研究所采用的实验流程示意图。hiPSCs 在培养基中维持培养，并在分化当天（第 0 天，D0）达到 60–80% 汇合度。在 D0，将 hiPSCs 解离为单细胞，并以所需的接种密度接种（接种培养基）。次日，细胞用分化培养基处理（D1–D3），随后更换为转换培养基（D3–D5）。在 D5，hPGCLCs 用于免疫荧光或流式细胞术分析。（B）明场图像（上排，4 倍放大）；SOX2、PHALLOIDIN 染色和 DAPI 染色的免疫荧光图像（中排）；以及 POU5F1、PHALLOIDIN 染色和 DAPI 染色的免疫荧光图像（下排），显示不同汇合度下的 hiPSCs。比例尺 = 50 µm。图 1A 中的示意图由作者使用 Adobe Illustrator 中的基础绘图工具绘制；未使用任何付费软件或工具，因此无需版权许可。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：不同包被基质在 hiPSC 培养过程中的影响。明场图像（第一行）；SOX2、PHALLOIDIN 染色和 DAPI 染色的免疫荧光图像（第二行）；以及 POU5F1、PHALLOIDIN 染色和 DAPI 染色的免疫荧光图像（第三行），显示在不同包被基质上培养的 hiPSC。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：hiPSC 培养过程中不同包被基质对 hPGCLC 分化的影响。明场图像（第一行，10 倍放大）；hPGCLC 分化第 5 天的 SOX17、TFAP2C、PDPN 免疫荧光染色及 DAPI 染色图像（第二行）；以及 POU5F1、SOX17 免疫荧光染色和 DAPI 染色图像（第三行），hiPSCs 起始培养于不同包被基质，分化过程使用 Geltrex。黄色虚线标示含有 hPGCLC 的区域。比例尺 = 25 µm（第一行）和 50 µm（第二、三行）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4hiPSC接种密度对hPGCLCs分化的影响 (A不同hiPSC接种密度（40K细胞/cm²）下hPGCLC分化第1天（D1）和第3天（D3）的明场图像²，60K 细胞/cm²，80K 细胞/cm²）。比例尺 = 250 µm。4倍放大。（B代表性流式细胞术图显示用于定量 EPCAM+/ITGA6+ hPGCLCs 比例的设门策略。实验中使用在 Geltrex 上培养的 M199 hiPSCs，接种密度为 40K 细胞/cm²². (C) 柱状图显示使用在不同包被材料上培养并以不同密度接种的hiPSCs（M199和M54）诱导5天后EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLCs的百分比。DSOX17、TFAP2C、PDPN 免疫荧光染色及 DAPI 染色（左图）；SOX17、POU5F1 免疫荧光染色及 DAPI 染色（右图），使用 hiPSCs（M199 和 M54，接种于 Geltrex 基质）在 40K 和 80K 个细胞/cm² 密度下诱导 hPGCLCs 分化第 5 天（D5）的结果。比例尺 = 50 µm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

体外配子发生构成了一个强大的实验平台，可用于在受控培养条件下以及基于患者特异性研究人类生殖系发育、生殖毒性和不孕症。尽管已有多种将hiPSCs分化为hPGCLCs的方案被报道¹⁸，但由于缺乏在不同实验室之间标准化、可扩展且可重复的方法，该领域的发展一直受到限制。近期研究报道了简化且高效的hPGCLC诱导方法，包括基于BMP4的微图案化分化²⁷、可在3.5天内实现hPGCLC生成的快速二维单层培养平台²⁸，以及可模拟着床前后发育和旁分泌微环境信号的三维培养系统³³。尽管这些方案能有效支持hPGCLC的分化，但仍缺乏作为高通量研究平台的能力。为了使基于hPGCLC的研究具有广泛适用性，特别是用于生殖毒理学筛查，相关方案必须具备高度稳健性、技术上的可操作性，并与下游定量检测方法兼容。本文详细阐述了hPGCLCs BMEx分化方案的逐步分析过程，重点强调决定其可重复性和性能的关键技术参数。

决定分化成功与否的一个主要因素是 hiPSCs 的初始多能性状态。传代次数、细胞健康状况、细胞系特异性特征以及分化前的培养条件均可能影响 hPGCLC 的分化结果。在 hiPSCs 的维持培养初期，需关注包被基质、接种细胞密度和培养板规格，这些因素共同决定了 hPGCLC 分化起始时的克隆结构和信号微环境。本研究展示了在不同包被基质和不同接种密度下培养的 hiPSCs 对 hPGCLC 分化（在 Geltrex 上）的影响。本实验中测试的两个 hiPSC 细胞系在接种密度为 20,000–40,000 个细胞/cm² 时均表现出最高的分化效率。这强调了在引入新细胞系、经历长期传代或改变实验设计或培养板规格时，确定最佳接种密度的重要性。即使表面积与体积比或生长动力学的微小变化，也可能需要优化以维持高效的分化能力。因此，建议使用者首先进行小规模预实验，以确定 hPGCLC 分化的最佳条件。

尽管该方法具有较强的稳健性，但仍存在一些局限性需要指出。虽然该方法适用于多种包被材料和密度，但分化效率仍受hiPSC内在特性的影响，包括表观遗传状态和传代历史，而这些因素无法完全控制。若干测试的hiPSC系似乎无法有效分化为hPGCLCs²⁶。尤为重要的是，与成分完全明确的纤连蛋白（vitronectin）不同，BMEx是一种来源于动物的产品，存在批次间差异，可能影响实验的可重复性。尽管先前已测试了多个批次的Matrigel、Cultrex和Geltrex，并获得了稳定一致的结果²⁶，但这一问题仍需关注；为确保未来实验的可重复性和可转移性，应考虑使用成分完全明确的BMEx替代物。本研究中使用了两个男性（XY）hiPSC细胞系，但该方案此前已在女性（XX）和男性（XY）细胞系中均经过验证²⁶。最后，尽管本方案成功获得了hPGCLCs，且已有研究表明这些细胞在转录谱上与hPGCs相似，并具备进一步发育的潜能^26,34，但本研究并未涉及向更晚期生殖细胞阶段的进一步成熟。尽管该方法已证明可用于高通量筛选类应用，但若能进一步实现基于自动化的流程优化，并在更多hiPSC细胞系中开展跨实验室验证，将有助于提升其转化应用价值。

与现有的hPGCLC分化策略相比，该方案具有多项优势。不同于高度特化或受限于基质的方法，本方案适用于常用的hiPSC维持基质和培养板格式，从而降低了技术门槛。此外，方案强调细胞密度优化和早期质量控制，进一步提高了可重复性，而可重复性一直是该领域长期存在的挑战 体外 配子发生

此处描述的方法学框架对于生殖毒理学、不孕症建模以及发育生物学研究具有重要意义。该框架可兼容可扩展的实验体系，适用于中至高通量的化合物筛选，同时其良好的可重复性有助于跨研究的数据比较及多中心协作。更广泛而言，通过在不同实验室间系统性地标准化人源原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）诱导方案，并对细胞特征鉴定和功能终点进行比较^18,35对于推动发展至关重要 体外 配子发生向可预测的人类相关平台发展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7AAD 活性染色液	BioLegend	420403	稀释比例 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 培养基	Gibco	12633012
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG	Invitrogen	A21202	稀释比例 1:500
Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG	Invitrogen	A21207	稀释比例 1:500
Alexa Fluor 647 驴抗山羊 IgG	Invitrogen	A21447	稀释比例 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	稀释比例 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	稀释比例 1:400
抗体 anti-CD49f (ITGA6)，Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	稀释比例 1:200
抗体 anti-CD326 (EPCAM1)，PE/Cyanine7	Biolegend	324222	稀释比例 1:200
抗体 anti-SOX2，兔多克隆	Merck	ab5603	稀释比例 1:200
抗体 anti-SOX17，山羊多克隆	R&D Systems	AF1924	稀释比例 1:500
抗体 anti-OCT3/4 (POU5F1)，小鼠单克隆	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	稀释比例 1:200
抗体 anti-Podoplanin (PDPN)，小鼠单克隆	Abcam	ab256561	稀释比例 1:200
抗体 anti-AP-2γ (TFAP2C)，兔多克隆	Cell Signaling Technology	2320S	稀释比例 1:300
B-27 添加剂，无血清	Gibco	17504044	稀释比例 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		流式细胞仪设备
BD FACSDiva 软件版本 9.0	BD Biosciences		软件
牛血清白蛋白 (BSA)，V 组分	Roche	10735086001	溶于 PBST
CELLSTAR 12 孔细胞培养板	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL 离心管	Greiner	188271
CELLSTAR 6 孔细胞培养板	Greiner	657160
Corning 40 µm 细胞筛	Corning	431750
Cultrex 干细胞认证、低生长因子基底膜基质	R&D systems	3434-101-02	用冷 DMEM-F12 稀释
DAPI (4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)	Invitrogen	D3571	稀释比例 1:500
DMEM:F12，含 GlutaMAX 添加剂	Gibco	31331028
不含钙、镁的 DPBS	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		成像设备
EVOS M5000 软件版本 1.3.660.548	Invitrogen		软件
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞筛 snap cap	Corning	352235
FlowJo 软件版本 10.10.0	BD Biosciences		软件
Geltrex 低生长因子基底膜基质，无 LDEV，干细胞认证	Gibco	A1413302	用冷 DMEM-F12 稀释
GlutaMAX 添加剂	Gibco	35050061	稀释比例 1:100
FlowJo 软件版本 10.10.0	BD Biosciences		软件
Geltrex 低生长因子基底膜基质，无 LDEV，干细胞认证	Gibco	A1413302	用冷 DMEM-F12 稀释
GlutaMAX 添加剂	Gibco	35050061	稀释比例 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC 核心设施	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs 可根据请求附 MTA 分发
hiPSCs M199	LUMC hiPSC 核心设施	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs 可根据请求附 MTA 分发
LUNA-II 自动细胞计数器	Logos Biosystems		细胞计数设备
LUNA-II 软件版本 2.3.5	Logos Biosystems		软件
Matrigel hESC 认证基质，无 LDEV	Corning	354277	用冷 DMEM-F12 稀释
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140050	稀释比例 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	稀释比例 1:1000
多聚甲醛 (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	先溶于水配制成 8% PFA；再用 0.2 M 磷酸盐缓冲液稀释至 4% (1:1)
PIPETMAN P1000，100–1000 µL，金属弹射头	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200，20–200 µL，金属弹射头	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10，1–10 µL，金属弹射头	Gilson	F144055M
重组人 BMP4，CF	R&D Systems	314-BP-050	储存浓度为 100 µg/mL，溶于含 0.1% BSA 的 4 mM HCl
重组人 EGF，CF	R&D Systems	236-EG-200	储存浓度为 50 µg/mL，溶于 PBS
重组人 LIF	Gibco	300-05	储存浓度为 100 µg/mL，溶于 0.1% BSA
重组人 SCF，CF	R&D Systems	11010-SC-100	储存浓度为 100 µg/mL，溶于 PBS
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872
RevitaCell 添加剂	Gibco	A26445-01	稀释比例 1:100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	用 PBS 稀释成 0.3% 溶液
TrypLE Express 酶	Gibco	12604021
1.5 mL 离心管	Eppendorf	05-402-27
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	822184	用 PBS 稀释成 0.5% 溶液
UltraPure 0.5M EDTA	Invitrogen	15575020	用 FACS 缓冲液稀释 1:500
Vitronectin	Gibco	A14700	用 DPBS -/- 稀释至 5 µg/mL
Zeiss ZEN 软件版本 3.12.107.04000	Carl Zeiss Microscopy GmbH		软件
Zeiss LSM980 AiryScan 2	Carl Zeiss Microscopy GmbH		成像设备