用于小鼠皮层深部经颅成像的头戴式光学透明颅窗（HOTS）

摘要

本方案描述了一种基于优化的两步法颅骨透明化处理的头戴式光学透明颅骨（HOTS）窗口。该方法可获得高度透明的颅骨，从而实现对成年小鼠大脑皮层深度达约800 µm的双光子成像。

摘要

成年小鼠大脑皮层的高分辨率双光子成像受到颅骨光散射的严重限制，这种散射会衰减信号并限制活体内的成像深度。in vivo。尽管已开发出颅骨透明化方法，以实现通过完整颅骨对皮层进行光学访问，但其实际应用受限于较短的透明化时间以及不够理想的透明化试剂组合。本文详细介绍了一种头戴式光学透明颅骨（HOTS）窗口的实施方案。该方法采用头戴式帽装置，将透明化溶液持续维持在颅骨表面，从而避免长时间麻醉或物理束缚，实现在清醒、自由活动的小鼠中进行长时间（数小时）的颅骨透明化处理。此外，通过系统的化学筛选优化了两步透明化流程所用的试剂（HOTS-S1：10% wt/v EDTA、15% wt/v D-甘露醇、10% wt/v 磺酰烷、0.5% wt/v Tween 20；HOTS-S2：70% wt/v D-甘露醇、5% wt/v 磺酰烷、0.5% wt/v Tween 20）。我们提供了一步一步的操作流程，包括颅骨暴露与固定、头戴式帽的制备与安装、透明化试剂的递送与更换，以及后续成像前准备。在6周龄小鼠（约20 g）中，HOTS方案通常可获得高度透明的颅骨，支持对皮层结构进行双光子成像，成像深度可达软脑膜下约800 µm，接近开颅窗口的成像性能。HOTS窗口可用于Thy1-GFP-M小鼠的结构成像以及Thy1-GCaMP6s小鼠的功能性钙成像。我们认为，作为一种便捷且微创的方法，HOTS窗口将显著促进活体中深层经颅成像以及光遗传学、光药理学和其他基于光的操控技术的应用。in vivo

引言

皮层神经元的活体监测对于理解脑结构与功能至关重要¹双光子显微镜（TPM）是此类研究的关键工具 体内 研究^2,3然而，由于覆盖在大脑皮层上方的不透明颅骨会产生强烈的光散射，其成像质量和成像深度受到严重限制^4,5.

开颅窗⁶和磨薄颅骨窗^7,8显著改善了对大脑皮层的光学通路，且已被广泛应用，但这两种方法均存在固有的局限性。开颅窗可能引发急性脑损伤和炎症反应^9,10，而颅骨磨薄技术难度较高，且难以实现厚度的均匀一致^11,12。

体内颅骨光学透明技术提供了一种微创替代方案，可在成年小鼠中实现轴突分辨率的双光子成像。然而，可达到的成像深度仍然有限（通常在软脑膜下 150–400 µm）^12,13,14,15。在实际操作中，颅骨透明通常仅限于在麻醉和头部刚性固定条件下进行的短期实验，且针对颅骨成分系统优化透明试剂组合的研究仍较为不足^12,13,14,15。

为克服这些局限，我们先前开发了一种头戴式光学透明颅窗（HOTS），可在自由活动的小鼠中实现长期、离体的颅骨透明化图1A)¹⁶该方法采用两步透明化流程，使用了两种试剂（S1 和 S2），这些试剂是通过我们先前工作中系统的化学筛选优化而得。¹⁶清除试剂的系统优化及其清除效果、可逆性、生物安全性表征和 体内 HOTS 窗口的成像性能已在我们先前的研究中报道过¹⁶，该结果也显示HOTS处理后具有良好的星形胶质细胞反应。本文中，我们提供了一种建立HOTS窗口的逐步操作方案，以实现成年小鼠深部经颅双光子成像。在代表性制备样本中，成像深度可达软脑膜下约800 µm，几乎与开颅窗口所能达到的深度相当。HOTS窗口可在Thy1-GFP-M小鼠中实现深部结构成像，并可在清醒的Thy1-GCaMP6s小鼠中进行功能性钙成像。

方案

所有动物护理和实验程序均经广东省动物护理与使用委员会批准，并遵循中国科学院深圳先进技术研究院动物实验伦理委员会的指南进行。本方案中使用的试剂和设备列于材料表中。

注意：本方案针对6周龄小鼠（体重约20 g）优化，其颅骨厚度约为100 µm。

1. 颅骨透明化溶液的制备

1. 配制颅骨透明化溶液 S1（10% wt/v EDTA、15% wt/v D-甘露糖、10% wt/v 磺酰胺、0.5% wt/v Tween 20；折射率：1.38；终末 pH：7.0–7.4）
   1. 称取 0.35 g 氢氧化钠（NaOH），加入盛有 20 mL 去离子水的烧杯中，搅拌至完全溶解。此步骤可提高溶液 pH，有助于后续 EDTA 的溶解。
      ​注意：NaOH 具有腐蚀性，操作时需佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服、护目镜），并在化学通风橱中进行。
   2. 将 4 g 乙二胺四乙酸（EDTA）加入 NaOH 溶液中，将烧杯置于 40 °C 水浴中，持续搅拌直至 EDTA 完全溶解。
   3. 将混合物冷却至室温，加入 6 g D-甘露糖、4 g 磺酰胺和 0.2 g Tween 20，室温下搅拌至所有组分完全溶解。
   4. 加入去离子水定容至终体积 40 mL，充分混匀，得到溶液 S1。
      注意：S1 可在室温下保存数月。
2. 配制颅骨透明化溶液 S2（70% wt/v D-甘露糖、5% wt/v 磺酰胺、0.5% wt/v Tween 20；终末折射率：1.44；终末 pH：7.0–7.4）
   1. 称取 28 g D-甘露糖、2 g 磺酰胺和 0.2 g Tween 20，转移至洁净烧杯中。
   2. 加入去离子水至约 30 mL，室温下搅拌至所有组分完全溶解。
   3. 加入去离子水定容至终体积 40 mL，充分混匀，得到溶液 S2。
      ​注意：轻微加热（25–30 °C）并持续搅拌可加速 D-甘露糖的溶解。S2 可在室温下保存数月。

2. 手术准备

1. 将所有手术器械进行高压灭菌，并使用75%酒精彻底消毒操作区域。
2. 通过腹腔注射1%（w/v）戊巴比妥钠（每20 g体重150–200 µL）对小鼠进行麻醉。
   注意：其他可逆性麻醉剂可作为戊巴比妥钠的替代品。
3. 使用脚趾夹捏反射测试监测麻醉深度，并确保小鼠在开始手术前已完全麻醉。
4. 将小鼠固定于立体定位仪中，并用耳杆固定头部。
5. 使用加热垫维持小鼠体温在37 °C。
6. 在双眼涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。
   注意：密切监测呼吸和反射，避免麻醉过量及呼吸抑制。

3. 手术与头固定板的安装

1. 颅骨暴露与清洁（图 1Ba）
   1. 使用精细镊子和手术剪刀去除覆盖整个颅骨背侧表面的头皮。向侧方修剪皮肤，以暴露颞肌边缘，向后方修剪至颈部肌肉区域。
   2. 使用精细镊子轻柔地从颅骨表面去除骨膜。
   3. 用湿润的棉签清洁颅骨表面，并用轻柔的气流吹干颅骨。
   4. 若需精确定位大脑皮层的功能区域，可使用立体定位仪在颅骨表面标记间距为 1 mm 的参考点。
2. 牙科水泥与头固定板的安装（图 1Bb）
   1. 按照制造商说明配制牙科水泥。建议选用粘附性强、耐久性好的牙科水泥，以确保长期固定时的稳定连接。
   2. 在暴露的颅骨表面及周围组织上涂抹一层薄薄的牙科水泥以提供保护，但预留用于开窗的区域不得涂覆水泥。
      注意：将牙科水泥的粉剂与液体按 1:1 体积比混合后，等待约 10 秒，待其粘稠至可附着于牙签尖端时再进行涂抹，此举可降低流动性并改善操作性。涂抹时应从周围区域向预定的开窗区推进，确保开窗区域完全无水泥覆盖。开窗区域由牙科封闭剂（牙科水泥与软衬材料）在颅骨表面形成的边界所界定，因此其大小可调节，但受限于颅缝或帽状结构的尺寸。通常在单侧半球应用时，开窗区域直径约为 ~3–5 mm。
   3. 使用牙科水泥将一小块钛制头固定板（用于在后续成像过程中将头部固定于定制夹具）牢固地固定在颅骨上。
      注意：可采用不同设计的头固定板实现头部固定。本研究中，商业可得的头固定板以及定制的双孔钛板均成功应用。无论采用何种设计，头固定板均应为后续成像提供足够的机械稳定性，且不得遮挡预定的开窗/成像区域。

4. 创建高阶思维技能窗口

1. 使用自凝牙科软衬材料密封颅骨（图1Bc）
   1. 待牙科水泥完全固化约5分钟后，将自凝牙科软衬材料以薄层覆盖于水泥层表面（清除窗口区域除外），在颅骨上形成连续密封。
      ​注意：软衬材料可增强密封效果，减少在长期接触透明试剂过程中发生泄漏的风险。
   2. 沿预定清除窗口边缘平滑地塑形自凝牙科软衬材料，为盖帽形成平整的密封表面。
2. 安装盖帽（图1Bd）
   1. 剪下一次性塑料移液器头端（聚乙烯，PE），制成一个顶部封闭、底部开口的小圆柱形盖帽。PE具有良好的化学稳定性，在透明过程中与S1或S2透明溶液接触时无明显降解或反应。
      注意：通常从1 mL移液器吸头剪下的盖帽直径约为12 mm，高度为10–14 mm。
   2. 将盖帽置于指定的清除窗口区域上方，并轻轻压入软衬材料中。
      ​注意：盖帽尺寸大于透明区域，盖帽下方未用于透明的部分颅骨可涂抹牙科密封剂，以保护颅骨免受透明溶液影响。
   3. 在盖帽基部周围使用额外的软衬材料将其固定，确保盖帽与颅骨之间的连接处完全密封。
   4. 使用带26 G针头的1 mL注射器在盖帽侧壁刺出一个或多个小孔，作为注入和抽出透明溶液的通道。
   5. 等待软衬材料完全固化，确认盖帽牢固附着，且接口处无可见缝隙。
   6. 将小鼠从立体定位仪上取下，放入保温笼中直至从麻醉中完全恢复。
      注意：此处为合适的暂停点。可在牙科水泥和软衬材料完全固化后进行颅骨透明操作。在我们的操作实践中，HOTS窗口可在下午安装，待小鼠术后完全恢复后，次日早晨再进行颅骨透明；也可在HOTS窗口安装约15分钟后开始颅骨透明。在HOTS窗口安装过程中，颅骨结构保持完整，仅去除骨膜。

5. 清醒自由活动小鼠的颅骨透明化

注意：在透明化阶段，小鼠保持清醒状态，并在其家笼中自由活动。仅在通过头部安装的帽进行溶液注射和更换时，使用短暂的异氟烷麻醉。

1. S1 的初始加载
   1. 将小鼠放入诱导室中，使用 3–4% 异氟烷（溶于空气）以 300–500 mL/min 的流速诱导短暂麻醉，直至小鼠不再活动。无需维持麻醉。
   2. 轻柔固定小鼠，并用手稳定头部安装的帽状装置。
   3. 使用带 26 G 针头的 1 mL 注射器，缓慢向头部帽状装置中注入约 1 mL 的 S1 溶液。
   4. 将小鼠放回饲养笼，使 S1 在颅骨上作用 2 小时。
      ​注意：在 S1 和 S2 孵育期间，应将小鼠单独饲养于标准笼具中。
2. S1 的更换
   1. 在初次加载 S1 后 2 小时，再次使用异氟烷对小鼠进行短暂麻醉。
   2. 使用 1 mL 注射器从帽状装置中吸出 S1 溶液。
   3. 使用 1 mL 注射器向帽状装置中重新注入新鲜的 S1 溶液。
   4. 将小鼠放回笼中，继续使 S1 作用 2 小时。
   5. 在初次加载后 4 小时重复步骤 5.2.1–5.2.4，进行第二次 S1 更换。
   6. 第二次更换后，继续使 S1 作用，直至总暴露时间达到 6 小时。
      ​注意：本方案（1 mL S1 作用 6 小时）已针对 6 周龄小鼠（约 20 g）优化。对于颅骨较厚的老龄动物，可逐步延长 S1 孵育时间。任何调整均需密切监测动物福利状况及最终成像质量，以避免颅骨过度软化。
3. S2 的应用
   1. 在 S1 处理 6 小时后，使用异氟烷对小鼠进行短暂麻醉。
   2. 使用 1 mL 注射器从帽状装置中吸出 S1，并替换为 0.7 mL 的 S2 溶液。
   3. 将小鼠放回笼中，使 S2 在颅骨上作用 1 小时，以进一步提高透明度并实现折射率匹配。
      注意：在此条件下，S1 与 S2 联合的透明化阶段通常在 7 小时内完成（6 小时 S1 + 1 小时 S2）。透明化成功的标志是颅骨表面明显透明且无出血。透明化后颅骨可能略有软化；用精细镊子轻触时应表现出轻微顺应性，但仍保持结构完整。避免对颅骨表面施加过大压力。

6. 成像准备

1. 成像前的麻醉与头部固定
   1. S2 孵育结束后，通过腹腔注射 1% (w/v) 戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，剂量为每 20 g 体重 150–200 µL。
   2. 通过夹趾反射测试确认麻醉深度是否充分。
   3. 将钛制头固定板拧紧至自行设计的头部固定装置上，以固定小鼠头部。
   4. 在双眼涂抹眼用软膏，防止成像过程中角膜干燥。
   5. 使用加热垫维持小鼠体温在约 37 °C。
2. 暴露透明化颅骨表面（图 1Be,Bf）
   1. 用注射器从帽状结构中吸除 S2 溶液。
   2. 使用精细剪刀小心剪开塑料帽，再用镊子将其移除，注意避免对颅骨施加过大压力。
   3. 轻柔剥离围绕透明窗口的软质内衬材料，充分暴露已透明化的颅骨区域。
   4. 在透明化颅骨表面直接滴加少量 S2 溶液，作为成像时的折射率匹配浸没介质。
      注意：本研究中使用了标准的水浸物镜，包括 16×/NA 0.8 物镜（N16XLWD-PF，Nikon）和 25×/NA 1.1 物镜（N25X-APO-MP，Nikon）。当使用 S2 作为浸没介质时，若物镜具备校正环，应将其调节至与 S2 折射率相匹配的适当位置，以减少球面像差。在本实验中，透明化颅骨在约 2 小时的双光子成像过程中保持了足够的光学清晰度，在树突棘观察期间未见明显的图像质量下降。约 2 天后，如需进一步成像，则需重新进行透明化处理，且再透明化所需时间显著短于初次透明化，从而实现对同一只动物的高效重复成像。
3. 清醒状态下头部固定成像（可选）
   ​注意：若进行清醒状态成像，应在实验前使小鼠适应头部固定操作。短暂使用异氟烷麻醉小鼠后，将其植入的头固定板固定于支架上，每次固定 15–30 分钟，连续重复 2–3 天。
   1. 使用短暂的异氟烷麻醉以方便操作。仅将植入的头固定板固定于支架上，使小鼠身体可在跑步轮或平台上自由活动。
   2. 按照步骤 6.2.1–6.2.4 操作，暴露透明化颅骨表面，并在成像前滴加 S2 溶液。

7. 恢复

1. 成像后，轻柔地吸除颅骨表面残留的S2溶液。
2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）多次冲洗透明化处理的颅骨区域，以促进颅骨逐渐恢复原有的不透明状态。
3. 使用无菌棉签轻柔擦干颅骨及周围组织上的残留液体，避免对骨组织造成机械损伤。
4. 若动物需存活以进行后续实验，应在颅窗区域覆盖一层生物相容性密封剂Kwik-Cast（WPI），以保护颅骨在存活期间不受损伤。
5. 让保护层完全固化。
6. 将小鼠从头部固定装置上取下，并置于温暖的笼子中。密切监测动物直至其从麻醉中完全恢复，然后将其放回原饲养笼中。

结果

按照该方案，头戴式光学透明颅骨（HOTS）窗口可在保持颅骨完整性的前提下，实现成年小鼠深层经颅双光子成像。成功的制备可通过两个关键结果来判断：（1）颅骨透明化后，皮层血管结构可清晰可见（图1Bf）；（2）透明化后的颅骨在轻微压力下出现轻微凹陷，表明脱钙和胶原松解效果良好。HOTS窗口必须置于完整的颅骨区域，并避开骨缝，以防止毛细血管出血——这是导致HOTS窗口失败的常见原因。另一种常见的失败情况是，盖帽与软衬材料界面密封不当，导致透明试剂泄漏，从而造成透明不完全。

为了评估光学透明化效果，我们观察了透明度的逐步改善情况 离体 和 体内. 离体 将颅骨碎片置于分辨率测试目标上进行成像，结果显示经S1和S2处理后清晰度逐步提高（图 2A). 体内 明场成像通过透明化颅骨揭示软脑膜血管结构图2B）。通过HO...

讨论

HOTS 方法利用一种头戴式光学透明颅骨（HOTS）窗口，该窗口结合了含有透明试剂的帽状装置和两步颅骨透明化处理，可在保持成年小鼠颅骨完整性的前提下增强其透明度。在标准方案下（6 周龄小鼠在 S1 中处理 6 小时，随后在 S2 中处理 1 小时），所形成的窗口可稳定支持深部经颅双光子成像，能够清晰观察到软脑膜下约 800 µm 深处的结构。

获得稳定且透明的窗口需要多个关键操作步骤。颅骨必须保持清洁和干燥，需仔细去除头皮和骨膜，以确保牙科水泥能够牢固地黏附于骨面，并在后续成像过程中稳固固定头板。水泥层应覆盖暴露的骨组织及周围组织，以提供坚固的基础。随后在牙科水泥表面及窗口区域周围涂布一层薄薄的自固化牙科软衬材料，以防止后续透明化试剂发生泄漏。HOTS窗口应尽可能避开颅骨缝，因为在骨缝上方直接进行透明化处理可能引起毛细血管出血，并常导致窗口失败。若窗口必须靠近骨缝，可用软衬材料封闭缝线以降低该风险。成像过程中，使用S2作为浸没介质和折射率匹配介质；如有配备，应调节物镜的校正环以补偿折射率不匹配。

此处使用的透明化参数针对颅骨厚...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 一次性移液管	Beijing Biotopped  Science  & Technology  Co., Ltd.	N/A
牙科水泥	上海荣祥齿科材料有限公司	N/A
D-甘露糖	Macklin	D813082
EDTA	Aladdin	El 16428
异氟烷	RWD	N/A
Kwik-Cast	WPI	N/A	一种生物相容性密封剂
NaOH	Macklin	S832169
自凝    牙科     软衬材料	杨马湖生物科技（鹤壁）有限公司	N/A
戊巴比妥钠	Biopike	N/A
立体定位仪	RWD	N/A
无菌一次性注射器	Minank	N/A	1 mL；26 G 针头
环丁砜	Macklin	S817950
Thy1-GFP-M 小鼠		N/A	由 Yang Zhan 教授提供
Thyl-GCaMP6s  小鼠	Jackson Laboratory
Tween 20	Sigma-Vetec	V900548
水浸物镜	Nikon	N25X-APO-MP	25×/NA 1.1 物镜
水浸物镜	Nikon	N16XLWD-PF	16×/NA 0.8 物镜