整合生物信息学分析人类转录组数据鉴定出肺腺癌中三个关键的诊断和预后生物标志物

摘要

本研究利用TCGA-LUAD和GEO GSE115002转录组数据，鉴定了肺腺癌的诊断和预后生物标志物。B3GNT3、FERMT1和SPP1在肿瘤组织中表达上调，可有效区分肿瘤与正常组织。这些基因与上皮-间质转化及免疫抑制相关。结合基因表达与TNM分期构建的列线图显示出可靠的预测价值。

摘要

肺腺癌（LUAD）是全球癌症相关死亡的首要原因。尽管在手术、靶向治疗和免疫治疗方面取得了进展，晚期LUAD的5年生存率仍低于20%，表明迫切需要可靠的分子生物标志物用于早期检测和预后评估。在本研究中，作者假设三个持续上调的基因可作为LUAD有效的诊断和预后生物标志物。作者分析了来自两个独立队列的转录组数据：TCGA-LUAD（535个肿瘤样本，59个正常样本）和GSE115002（52个肿瘤样本，52个配对正常样本），以筛选差异表达基因。三个核心基因——B3GNT3、FERMT1 和 SPP1——在两个数据集中均在LUAD肿瘤中持续高表达。这些基因表现出优异的诊断性能，在TCGA-LUAD中的AUC值超过0.95，在GSE115002中也具有高准确性。生存分析显示，每个基因的高表达均显著与较短的总生存期和无病生存期相关，多变量Cox回归分析证实了它们独立的预后价值。功能富集分析表明，这三个基因参与上皮-间质转化、细胞外基质重塑和免疫抑制，这些过程均与LUAD的侵袭和转移密切相关。作者进一步构建了一个结合这三个基因与TNM分期的预后列线图，其一致性指数达到0.743，显示出良好的预测性能。这些发现证实B3GNT3、FERMT1 和 SPP1 是LUAD有前景的诊断和预后生物标志物，支持其在风险分层和临床管理中的应用。

引言

肺癌是全球癌症死亡的首要原因，2020年约导致180万人死亡¹。肺腺癌（LUAD）约占所有肺癌病例的40%²。尽管在手术、靶向治疗和免疫治疗方面取得了进展，晚期肺腺癌的5年生存率仍低于20%^3,4。目前迫切需要可靠的分子生物标志物用于早期检测和精准预后评估。高通量测序及公共数据库（如癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达综合数据库（GEO））使得对癌症进行系统的转录组学分析成为可能^5,6。整合跨队列的生物信息学分析可提高候选生物标志物发现的可靠性⁵。

许多基因和通路已被证实与肺腺癌（LUAD）相关，包括细胞增殖、EGFR信号通路以及免疫逃逸⁷。然而，其中仅有少数被成功转化为临床应用。结合基因特征与临床病理特征（尤其是列线图）的风险预测模型可提高LUAD的预后判断准确性⁸。尽管B3GNT3、FERMT1和SPP1各自已被报道与癌症进展相关，但它们在LUAD中联合应用的诊断价值、预后意义及对免疫微环境的调控作用尚未在独立队列中得到系统验证。本研究首次对这三个基因作为统一的生物标志物组合在LUAD中的作用进行了跨平台整合分析，并构建了具有临床应用价值的预后列线图。

B3GNT3 编码一种糖基转移酶，可稳定 PD-L1 并促进免疫逃逸^9,10。FERMT1（kindlin-1）调控整合素活化，并在非小细胞肺癌（NSCLC）中驱动转移^11,12。SPP1（骨桥蛋白）介导细胞外基质重塑、上皮-间质转化（EMT）以及化疗耐药^13,14,15。昼夜节律相关基因也被证实可用于预测肺腺癌（LUAD）的预后和诊断¹⁶，而通过多组学整合的蛋白质信号网络已揭示LUAD中的性别差异¹⁷。B3GNT3 和 SPP1 为分泌型或膜定位蛋白，支持其作为微创生物标志物的潜在应用。有效的LUAD分类和生物标志物识别也可通过重叠特征选择方法实现¹⁸，多组学相互作用在肺癌进展中发挥重要的功能作用¹⁹。通过全面的多组学整合鉴定出的线粒体基因特征，对LUAD的预后评估和个体化治疗也具有价值²⁰。B3GNT3 和 SPP1 为分泌型或膜定位蛋白，支持其作为微创生物标志物的潜在应用。本研究旨在利用整合生物信息学方法鉴定可靠的LUAD生物标志物，评估其诊断和预后性能，探索其生物学功能及与免疫的相关性，并构建具有临床应用价值的预后列线图。

方案

1. 数据来源与预处理

1. 在 R（版本 4.1.3；Windows 10 Pro）中处理原始数据。
2. 对于 GSE115002，使用 limma（版本 3.52.3）进行分位数归一化。
3. 对 TCGA 数据过滤低表达基因：保留在 ≥50% 样本中 CPM > 0.5 的基因。
4. 对 GSE115002 数据过滤低表达基因：保留平均信号值 >50 的基因。
5. 对表达值进行 log₂ 转换，并添加 +1 的伪计数。
   注：肺腺癌（LUAD）的基因表达数据和临床数据来自 TCGA-LUAD（版本 33.0，GDC 数据门户，2025 年 8 月 7 日下载）和 GSE115002（Agilent 芯片，GEO 数据库，2025 年 8 月 7 日下载）。TCGA-LUAD 包含 535 个肿瘤样本和 59 个正常样本。GSE115002 包含 52 个肿瘤样本和 52 个配对正常样本。

2. 差异表达基因的鉴定

1. 使用 DESeq2（版本 1.36.0）对 TCGA RNA-seq 数据进行差异表达分析，使用 limma（版本 3.52.3）对 GSE115002 数据进行差异表达分析。采用 Benjamini–Hochberg 方法计算校正后的 P 值（FDR）。
2. 为确保跨数据集的可比性，两个队列均统一采用 |log₂FC| ≥ 1.0 的筛选标准。差异表达基因（DEGs）定义为 FDR < 0.05 且 |log₂FC| ≥ 1.0。使用 VennDiagram（版本 1.7.3）鉴定重叠的差异表达基因。B3GNT3、FERMT1 和 SPP1 被选为在多个数据集中一致上调且具有已知癌症相关性的候选基因。

3. 诊断价值的评估

1. 为每个候选基因构建 ROC 曲线。
2. 使用约登指数确定最佳截断值。
3. 计算每个基因的 AUC、敏感性和特异性。
4. 使用多元逻辑回归构建联合诊断组合。
   注意：ROC 分析采用 pROC 软件包 v1.18.0；诊断模型构建采用 glm 函数并设定二项分布族。

4. 生存分析

1. 使用中位表达量将患者分为高表达组和低表达组。
2. 为每个基因生成Kaplan–Meier生存曲线。
3. 进行log-rank检验以比较生存差异。
4. 进行单变量Cox回归分析。
5. 进行多变量Cox回归分析。
6. 在回归模型中纳入临床协变量。
7. 使用Schoenfeld残差验证比例风险假设。
8. 计算三基因风险评分。
   注：使用了Survival v3.3.1和survminer v0.4.9软件包。协变量包括年龄、性别、T分期、N分期和M分期。风险评分计算公式如下：
   风险评分 = (0.328 × B3GNT3) + (0.331 × FERMT1) + (0.321 × SPP1)。(1)

5. 基因集富集与功能注释

1. 使用差异表达基因（DEGs）进行基因本体（GO）富集分析。
2. 使用差异表达基因（DEGs）进行KEGG通路富集分析。
3. 进行基因集富集分析（GSEA）。
4. 根据基因与候选基因表达的皮尔逊相关性对基因进行排序。
5. 使用校正后 P 值 < 0.05 筛选显著性富集项。
   注意：GO 和 KEGG 分析使用 clusterProfiler v4.6.2，GSEA 使用 FGSEA v1.22.0 和 MSigDB Hallmark v7.5。

6. 相关性与网络分析

注：对于符合正态分布的基因表达数据，采用皮尔逊相关性分析；对于免疫细胞比例数据，采用斯皮尔曼相关性分析。蛋白质相互作用网络使用 STRING 数据库（版本 11.5，置信度 > 0.7）生成，并在 Cytoscape（版本 3.9.1）中进行可视化。免疫细胞浸润程度通过 CIBERSORT（绝对模式，100 次置换检验）进行估算。单细胞 RNA 测序已被证明可揭示非小细胞肺癌微环境中细胞生态位的转变，这与免疫浸润分析密切相关^21,22，而整合性单细胞分析可进一步解析免疫细胞（如 CD8+ 记忆细胞）在肺腺癌（LUAD）中的作用^23,24,25。

7. 列线图的构建与验证

注意：列线图的变量选择基于多变量Cox分析的显著性（P < 0.05）：T分期、N分期、B3GNT3、FERMT1 和 SPP1。列线图使用rms（版本6.5.0）构建。内部验证采用1000次含重复抽样的自助法重采样。校准曲线和决策曲线分析（DCA）使用rmda（版本1.7）完成。计算环境包括R 4.1.3、Windows 10 Pro和Bioconductor 3.15。分析脚本可在合理要求下通过 https://github.com/[redacted]/LUAD‑biomarker-2025 获取。

8. 统计分析

注意：所有统计检验均为双侧检验；P < 0.05 被认为具有显著性。

结果

肺腺癌中全局基因表达的改变

肺腺癌组织与正常肺组织之间的转录组比较揭示了广泛的基因表达变化。 图1A 显示了TCGA-LUAD数据集中差异表达基因的火山图，图1B显示了GSE115002数据集中的差异表达基因火山图。在TCGA-LUAD队列中（图1A），1865 个基因显著上调，1247 个基因下调。在 GSE115002 队列中（图1B），645 个基因表达上调，609 个基因表达下调。共有 421 个基因在两组数据集中均一致上调。在这些重叠的基因中 B3GNT3, FERMT1，以及 SPP1 被标记在 图1A 和 图1B 在肿瘤样本中显著高表达。在TCGA-LU...

讨论

该列线图基于TCGA-LUAD队列，通过多变量Cox回归分析构建。预测因子包括病理T分期、病理N分期以及B3GNT3、FERMT1和SPP1的基因表达状态（根据中位表达水平分为高表达与低表达）。对于每位患者，各变量的个体评分相加得到“总分”值，该值对应于1年、2年和3年总体生存概率的估计值。总分越高，表明死亡风险越高。该工具可提供个体化的生存预测，有助于LUAD的风险分层。机器学习已被用于揭示LUAD预后与治疗中多种细胞死亡模式^21,22,23，这些发现可进一步优化我们的列线图模型。

本研究通过整合生物信息学分析，确定B3GNT3、FERMT1和SPP1为肺腺癌（LUAD）中可靠的诊断和预后生物标志物。这三个基因在肿瘤中均持续高表达，能够以高准确性区分肿瘤与正常组织，预测不良生存，并调控与上...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
公开可用的数据集	TCGA-LUAD 数据集	癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）；535例肺腺癌肿瘤样本，59例癌旁正常肺组织样本（RNA测序计数/FPKM值 + 临床数据：生存信息、TNM分期）	差异表达、生存分析和列线图分析的转录组学与临床数据；主要研究队列
	GSE115002 数据集	基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE115002）；Agilent 芯片，52 例肺腺癌肿瘤组织，52 例配对的相邻正常肺组织（未经治疗）ï原发性肿瘤	用于差异表达、诊断效能及免疫浸润分析的独立验证队列
生物信息学软件 &与编程环境	R 编程语言	版本 4.1	所有转录组学、统计学及图形分析的核心平台
	R 软件包（差异表达）	DESeq2，limma	DESeq2：TCGA RNA-seq原始计数差异表达分析；limma：GSE115002芯片数据标准化及差异表达分析（Benjamini–Hochberg FDR 校正
	R 包（诊断分析）	pROC	ROC曲线的构建、AUC（95% CI）的计算、最佳截断值的确定（Youden指数）’用于诊断性能评估的 s 指数
	R 包（生存分析）	生存，survminer	Kaplan–生成Kaplan-Meier生存曲线，进行log-rank检验，单变量/多变量Cox比例风险回归分析（HR + 95% CI）；根据基因表达中位数对患者进行分层
	R 包（功能富集）	clusterProfiler, fgsea	clusterProfiler：GO（BP/CC/MF）和 KEGG 通路富集分析（校正 P 值 < 0.05）；fgsea：用于 MSigDB Hallmark/KEGG 基因集的 GSEA（FDR < 0.25)
	R 软件包（列线图构建） &和验证）	均方根	预后列线图的开发（基因表达与TNM分期的整合）；Harrell’C指数计算、Bootstrap重采样（1000次重复）用于偏倚校正、校准图生成
	R 软件包（统计学） &和可视化	ggplot2，ComplexHeatmap，corrplot	生成火山图、气泡图（富集分析）、热图（免疫浸润相关性）、散点图（基因共表达）；Pearson/Spearman 相关性分析
生物信息学数据库 &与工具（网络/免疫分析）	STRING数据库	置信度评分 > 0.7	蛋白质的构建–B3GNT3/FERMT1/SPP1 及其直接相互作用蛋白的蛋白质相互作用（PPI）网络
	Cytoscape	-	PPI 及基因共表达网络的可视化（根据相关性强度对边进行加权，中心基因识别）
	免疫去卷积算法	CIBERSORT	免疫细胞浸润丰度估算（M2 巨噬细胞，CD8）+ 肺腺癌样本中的T细胞、中性粒细胞、NK细胞等；与候选基因表达的相关性
其他工具	Microsoft Office/LaTeX	-	稿件撰写、图表整合与表格排版；统计结果汇编