外源性线粒体转移至分化中的棕色脂肪细胞及AGPAT2缺陷型前脂肪细胞

摘要

来源于人类和小鼠的外源性线粒体可被正在分化的前脂肪细胞摄取，并可通过成像和遗传学工具在脂肪生成分化过程中进行追踪。尽管这些线粒体与内源性线粒体网络发生物理相互作用，但它们并不增加与成熟棕色脂肪细胞相关标志物的表达水平。

摘要

线粒体是关键的信号枢纽；然而，线粒体质量扩增是否在机制上为细胞分化所必需，目前仍是一个未解的问题。AGPAT2 催化溶血磷脂酸转化为磷脂酸，其缺乏会导致脂肪组织缺失以及与线粒体质量减少相关的脂肪生成障碍。通过将外源性线粒体转入正在分化的棕色脂肪细胞，评估了线粒体质量扩增对脂肪生成的影响。同时研究了线粒体转移是否能够挽救 AGPAT2 缺陷细胞中受损的脂肪生成过程。人源和鼠源线粒体被成功转入并整合到正在分化的鼠前脂肪细胞内源性线粒体网络中，并在整个棕色脂肪生成过程中持续存在。脂肪细胞分化是保留转入线粒体的前提条件。线粒体转移并未改变成熟棕色脂肪细胞分子标志物的表达水平或脂滴含量，尽管其以物种依赖的方式影响了脂滴大小的相对分布。在 Agpat2^-/- 前脂肪细胞中，线粒体转移未能恢复脂肪生成，表明在此模型中，仅线粒体质量的扩增不足以逆转导致脂肪营养不良的机制。这些结果表明，尽管外源性的人源和鼠源线粒体可以整合到正在分化的脂肪细胞的线粒体网络中，但它们并不直接影响脂肪生成程序。

引言

除了其主要的生物能量功能外，线粒体还在多种细胞过程中充当信号传导中心，包括细胞分化^1,2,3,4。棕色脂肪组织（BAT）具有显著较高的线粒体质量，以支持其产热活性，凸显了其在全身能量平衡以及肥胖发病机制中的作用⁵。尽管线粒体质量受线粒体生物发生与线粒体自噬之间平衡的调控，但在棕色脂肪细胞分化过程中线粒体质量的增加究竟是脂肪生成所必需的功能性需求，还是仅仅是该过程的伴随现象，目前尚不明确。

细胞间生理性线粒体转移已有报道 体外 和 体内，在病理性条件下促进组织适应，包括与肥胖和胰岛素抵抗相关的脂肪组织功能障碍^6,7此外，人工线粒体转移 体外 已被证明可增强受体细胞的呼吸能力⁸这些研究结果共同支持了线粒体转移能够改变细胞代谢功能，并可能在生物能量应激条件下促进组织适应的观点。^9,10,11与通过激活细胞核和线粒体转录程序来刺激内源性线粒体生物发生的药理学或遗传学策略相比，线粒体转移可直接将细胞器递送至受体细胞，从而在不依赖转录调控的情况下快速改变线粒体数量^12,13该方法对于校正线粒体疾病的缺陷至关重要，同时也能够在不产生药物或遗传学方法潜在脱靶效应的情况下研究线粒体功能。¹⁴.

在本研究中，我们探讨了通过外源性线粒体转移人为增加线粒体数量对分化中的棕色脂肪细胞的影响。该方法可直接评估线粒体数量对脂肪生成程序的作用。为实现这一目标，我们对最初为间充质干细胞开发的线粒体转移方案进行了改进¹⁵，并分别采用人肝细胞和小鼠前脂肪细胞作为线粒体供体。我们结合遗传工具与成像技术，建立了在分化中的小鼠细胞中追踪人源线粒体的方法，结果表明，无论来源如何，线粒体均能整合至内源性线粒体网络中，并在整个脂肪生成分化过程中持续存在。

为了模拟与线粒体质量减少相关的脂肪生成障碍，本研究采用了源自1-酰基甘油-3-磷酸-O-酰基转移酶2（AGPAT2）缺陷型（Agpat2^-/-）小鼠的分化中棕色脂肪细胞。AGPAT2在脂肪组织中高表达，可催化甘油酯生物合成途径中磷脂酸的生成。AGPAT2缺陷在人类和小鼠中均会导致严重的脂肪营养不良，并伴随线粒体质量减少，从而损害白色和棕色脂肪细胞模型中的脂肪生成^16,17,18。将外源性线粒体导入正在分化的前脂肪细胞后，脂滴大小分布仅有轻微改变，但并未提高成熟棕色脂肪细胞标志物的表达水平，也未能挽救Agpat2^-/-前脂肪细胞的脂肪生成缺陷。

方案

动物实验已获得智利天主教大学机构动物护理与使用委员会批准，方案编号210609003。本研究使用了野生型和Agpat2^-/- P0.5新生小鼠，两性均有，其遗传背景为混合的C57BL/6J与129J品系。个人防护装备（PPE）：穿戴实验服、护目镜和丁腈手套。有关本实验方案的更多细节，请参见补充文件1；本方案所需缓冲液见表1。

在电子显微镜样品制备、多聚甲醛固定以及核酸提取过程中产生的所有有毒化学废弃物，必须严格按照机构环境健康与安全（EHS）规定，严格分隔并投入有明确标识的指定废弃物通道。任何情况下，均不得将这些试剂排入实验室水槽或公共污水系统。所有产生的危险化学废弃物必须根据机构EHS的分类要求进行分隔处理。

1. 细胞培养

1. 原代棕色脂肪细胞（iBAT）的分离、分化与培养
   注意：参见 补充文件 1 简要描述操作步骤及 表1 所需溶液的配制方法。我们对这些溶液的组成进行了完整且详细的说明。 体外 棕色脂肪成脂分化方案可参见Figueroa等人的研究。¹⁹.
   1. 从新生小鼠（P0.5）肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）中分离前脂肪细胞，操作步骤参照Figueroa等所述的手术及酶消化方法。¹⁹.
   2. 根据分化诱导剂配方和培养基更换时间表，对棕色脂肪细胞进行诱导分化并维持培养。
      注意：要成功实现脂肪向分化，细胞培养物在启动脂肪向诱导前达到90–100%汇合度至关重要。
2. HepG2 细胞培养
   1. 在添加了10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL 链霉素，以及 0.25 µg/mL 两性霉素 B。将细胞维持在 37 °在含5% CO₂的湿润化培养箱中₂.
      注意：这些细胞以簇状生长，由于呈多层生长，即使密度较高，也可能呈现亚融合状态。

2. 线粒体的分离与转移

1. 线粒体分离
   注意：所有步骤均须在生物安全柜中于 4 °C 或冰上进行。制备后须在 2 小时内使用。
   1. 将 2 × 10⁶ 个供体细胞（HepG2 或前脂肪细胞）接种于 100 mm 培养皿中。培养细胞至达到 80%（HepG2）或 100%（前脂肪细胞）汇合度。
   2. 在 5% CO₂ 培养箱中，用含 100 nM MitoTracker Deep Red FM 的无 FBS 培养基对供体细胞染色 30 分钟，温度为 37 °C。
   3. 用生长培养基洗涤细胞 2 次，以去除过量染料。
   4. 使用胰蛋白酶消化使细胞脱落，收集细胞悬液，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
   5. 将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 BSA、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的线粒体分离缓冲液（MIB）中。通过结核菌素注射器反复吹打 5 次以破坏细胞膜。再用胰岛素注射器反复吹打至少 10 次，直至溶液呈浅棕色且无可见团块。
      注意：如需进行 Western 印迹分析，可将 50 µL 总裂解液分装后于 -20 °C 保存。
2. 在 4 °C 下以 900 × g 离心匀浆 11 分钟。
   注意：若 900 × g 离心后的上清液不浑浊，则细胞裂解可能不完全。
   1. 收集上清液，并在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟以沉淀线粒体。用含 BSA 的 MIB 洗涤线粒体沉淀 3 次。
   2. 最后重悬于 100 µL 不含 BSA 的 MIB 中。使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。
3. 前脂肪细胞中的线粒体转移实验（MTA）
   1. 在实验前 24 小时，将受体前脂肪细胞以每孔 5 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 12 孔板中（如需显微镜观察，需放置 18 mm 盖玻片）。
   2. 将分离的供体线粒体直接加入受体培养基中，加入量为每 10⁵ 个细胞 10 µg 线粒体蛋白。轻轻摇动培养板使线粒体均匀分布。在分析前，于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 24–120 小时（对应分化第 1、3 和 5 天）。

3. 线粒体耗氧量与 MTA 效率

1. 线粒体呼吸测定
   1. 将外部循环水浴设置为 25 °C，并在开始任何测量之前确保腔室夹套内达到稳定的热平衡。
   2. 使用仪器的采集软件执行两点液相校准。
      1. 空气饱和校准（高点）：加入 500 µ向 chamber 中加入空气饱和的去离子水 L。将磁力搅拌器设定为 60 rpm，并记录信号直至其稳定于平台期（>1,500 mV
      2. 零氧校准（低点）：向 chamber 中加入少量（直径约 3 mm）亚硫酸钠，以置换残留空气。持续记录，直至信号下降至稳定基线平台期（约为基础信号的 1%，约 20 mV）。
   3. 启动实时记录（总运行时间：约10分钟）。
   4. 记录3分钟，直至获得稳定的线性读数。
   5. 将分离的线粒体重悬于 200 µ线粒体检测缓冲液（MAS）的升数²⁰ 添加 5 mM 谷氨酸和 2.5 mM 苹果酸。
      注意：本实验中，总线粒体沉淀物提取自两块100 mm的细胞培养板。
   6. 将悬液转移至氧电极室，紧密关闭室盖密封活塞，确保无气泡残留。
   7. 记录耗氧量持续 3 分钟。
   8. 加入150 µM ADP 以启动线粒体偶联呼吸，并测量 ATP 合成偶联呼吸持续 3 分钟。
   9. 手动定义与每个呼吸阶段相对应的稳定线性片段。提取软件自动计算的斜率值，以 nmol 为单位表示的氧气消耗速率∙mL^-1∙分钟^-1.
      注意：进行板间室清洁时，用1 mL去离子水冲洗腔室2次，并确保内部完全干燥。加入100 µ在进行下一块培养板操作之前，向腔室中加入 PBS 至指定体积。
2. 流式细胞术
   注意：整个操作过程中所有样品均需置于冰上，以保持细胞和生物能量学的完整性。
   1. 分离线粒体并进行线粒体转移实验（MTA），具体步骤分别如第2.1和2.2节所述，在35 mm培养皿中使用先前用MitoTracker Deep Red FM标记的供体细胞。
   2. 吸弃培养基，用1 mL无菌PBS将细胞单层洗涤一次。
   3. 加入500 µ0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，37℃孵育培养皿 °在显微镜下观察到细胞完全脱落时为止。
   4. 通过加入1 mL完全培养基（含10% FBS的DMEM）中和胰蛋白酶。将全部液体转移至15 mL锥形离心管中，在300 × g条件下离心 × g 4℃下5分钟 °C.
   5. 吸除上清液，保留细胞沉淀。将沉淀重悬于 500 µ用移液器轻轻吹打，加入冰冻的 PBS 液体 L。
   6. 使用配备640 nm激光的流式细胞仪分析样品（参见 补充文件 1 有关流式细胞术数据采集与分析的详细信息）。
      1. 使用前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图定义细胞群体，并应用设门策略排除碎片和细胞双联体。
      2. 使用远红通道（670/30 nm 发射滤光片）定量荧光强度，以检测被内化的 MitoTracker 标记的线粒体。
      3. 使用 Floreada.io 进行分析（参见 补充文件 1 有关门控方案的详细信息）。
         注意：设置阴性对照（未添加MTA的受体细胞），以确定背景自发荧光的基线水平。
3. 共聚焦显微镜与电子显微镜
   1. 活细胞成像实验
      1. 将来自P0.5新生小鼠的原代前脂肪细胞接种至含18 mm盖玻片的12孔板中，细胞密度和培养基要求详见第1节。
      2. 分离线粒体，并使用先前用 MitoTracker Deep Red FM 标记的供体细胞，按照第 2 节所述执行线粒体转移实验（MTA）。
      3. 将受体细胞培养物置于37℃、加湿的培养箱中培养 °C，5% CO₂₂ 孵育24小时，以允许线粒体摄取。
      4. 用不含FBS的培养基稀释储备液，配制70 nM的MitoTracker Green工作液。
      5. 从12孔板中吸除培养基，替换为70 nM MitoTracker Green溶液。将培养板在37℃孵育25分钟。 °C，在含5% CO₂的加湿培养箱中₂ 用于对总线粒体网络进行复染。
      6. 吸除染色液，用1 mL温热的完全培养基将盖玻片洗涤2次。
      7. 用不含酚红的完全培养基替换终体积，以尽量减少采集过程中的背景自发荧光。
      8. 将盖玻片或培养板转移至共聚焦显微镜载物台上。设置显微镜的培养箱以维持37℃、5% CO₂和95%湿度的恒定环境。 °C 和 5% CO₂₂.
      9. 立即使用适当的激发/发射参数，对远红（MitoTracker Deep Red FM）和绿色（MitoTracker Green）通道进行成像。参见 补充文件 1 有关更多详细信息。
         注意：所有染色和操作步骤均需在低光照条件下进行，以防止荧光染料发生光漂白。为获得最佳线粒体形态分辨率，应使用高数值孔径（NA）的油镜物镜（60倍或100倍）。
   2. 固定细胞的共聚焦免疫荧光检测
      注意： 细胞固定后，有毒的多聚甲醛和戊二醛溶液被归类为非卤化有机物。核酸提取副产物需严格分类：苯酚/氯仿混合物必须作为卤化有机物处理，而基于胍盐的缓冲液则被归类为腐蚀性有机物。
      1. 将来自P0.5新生小鼠的原代前脂肪细胞接种于含12 mm盖玻片的12孔板中，具体操作如第1节所述。
      2. 分离线粒体，并按照第2节规定的步骤进行线粒体转移实验（MTA）。
      3. 孵育培养物24小时，以允许线粒体摄取。
      4. 按照上述方案中所述的步骤诱导棕色脂肪细胞分化 补充文件 1 并参考 表1 所需缓冲液的成分。
      5. 在分化第7天（168 h）固定细胞。吸除培养基，加入500 µ每孔加入 4% 多聚甲醛（PFA）溶液 1 L，室温孵育 20 分钟。
      6. 用预冷的 PBS 洗涤盖玻片 2 次，每次每孔加入 1 mL 冰冷的 PBS。将盖玻片置于含 0.05% 皂苷和 0.2% BSA 的 PBS 中，室温孵育 1 h，以进行通透和封闭。将培养板置于摇床上，轻轻振荡。
      7. 用1 mL PBS洗涤细胞2次。同时对细胞核和脂滴进行染色。加入1 µg/mL Hoechst 33342 和 1 µg/mL BODIPY，使用封闭/通透缓冲液配制。室温避光孵育30分钟。
      8. 用 1 mL 冰冷的 PBS 洗涤盖玻片 2 次。将盖玻片封片至洁净的载玻片上。加入 10 µ在载玻片上滴加封片剂，将盖玻片细胞面朝下置于封片剂上。将样品置于室温避光环境中过夜干燥，然后进行成像。
      9. 使用共聚焦显微镜采集图像。采用针对Hoechst和BODIPY发射光谱校准的两个荧光通道。参见 补充文件 1 有关额外的成像细节。
      10. 使用 ImageJ v1.54s 进行脂滴分析。打开脂滴通道，通过手动方式识别单个脂滴，使用 徒手选择 和 ROI 管理器 工具，并使用以下方法计算液滴面积 分析 | 测量 命令
      11. 使用提供的 R 脚本处理和分析所得数据 补充文件 2 在 RStudio v4.5.2 环境中。
          注意：每个盖玻片在10倍放大倍数下精确采集五张图像，以确保具有代表性的取样。使用R 4.5.2或更高版本，以确保与所提供的脚本兼容。
   3. 透射电子显微镜（TEM）
      注意：用于电子显微镜的副产物中，剧毒的四氧化锇和含砷的二甲胂酸钠缓冲液必须作为有毒重金属废物收集处理，而醋酸铀酰则需根据机构辐射安全规程，作为放射性重金属废物单独管理。
      1. 离心第2节中分离得到的线粒体，10,000 × g，4 °C，10分钟 × g 4℃下10分钟 °C以获得致密的沉淀。
      2. 将2.5%戊二醛溶于0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.0）中重悬沉淀，4 °C孵育2小时 °C.
         注意：始终在化学通风橱内操作戊二醛储备液并进行初始固定步骤。佩戴腈类手套和护目镜以保护眼睛。避免接触任何热源，因为加热的戊二醛会释放出强烈刺激性的蒸气。
      3. 洗涤线粒体样品3次 × 用0.05 M二甲胂酸钠缓冲液清洗10分钟，每次更换缓冲液时短暂离心以保留沉淀。
      4. 用1%的水溶液四氧化锇（OsO₄）对样品进行后固定₄室温孵育15分钟。
         注意：四氧化锇只能在经过认证且功能完好的化学通风橱内开启和操作。操作时需穿戴实验服、护目镜或全面罩，以及厚实的或双层腈手套（若发生任何溅洒，应立即更换手套，因为OsO₄具有强毒性）。₄ 可能会随时间渗透薄型丁腈手套。
      5. 洗涤样品 3 次 × 用双蒸水清洗5分钟。用1%醋酸铀酰水溶液对沉淀物染色15分钟。
         注意：在一次性塑料背衬实验台纸上操作。在实验室中划出专门区域用于放射性染色。佩戴双层手套、实验服和安全护目镜。操作完成后彻底清洗双手。
      6. 使用梯度乙醇系列对样品进行脱水。将沉淀物依次在30%、50%、70%、95%和100%乙醇中孵育，每个浓度孵育5分钟。
      7. 包埋线粒体组分。先在1:1的环氧树脂/乙醇溶液中孵育30分钟，随后在纯环氧树脂中孵育1小时。
      8. 将样品转移至包埋模具中，并在60 °C下聚合。 °C 烤箱中孵育 48 小时。
      9. 将树脂块固定在超薄切片机上，切出80 nm的超薄切片。
      10. 将切片收集到载网上，用1%醋酸铀水溶液染色4分钟，然后用双蒸水漂洗。
      11. 采用 Reynolds 法用柠檬酸铅染色 5 分钟²¹. 充分冲洗。使用透射电子显微镜观察网格。参见 补充文件 1 有关雷诺兹法和透射电子显微镜图像采集的详细信息。

4. 分子定量

1. 线粒体DNA（mtDNA）标准曲线
   1. 将HepG2细胞接种至五个100 mm培养皿中。培养至细胞融合度达到80%。
   2. 按照第2节中详述的技术步骤，从收获的细胞中分离线粒体。
   3. 使用4.2.6节所述的酸- guanidinium-酚-氯仿法从所得线粒体沉淀中提取总DNA。测定DNA浓度并评估纯度（A₂₆₀/A₂₈₀ 和（A₂₆₀/A₂₃₀ 使用微量紫外-可见分光光度计测定比值。
   4. 使用无核酸酶水作为稀释液，制备系列稀释溶液。将DNA原液稀释至终浓度分别为1、10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4，和10^-5 每反应体积含 ng。系列稀释过程中，每步均需涡旋振荡 5 秒，以确保充分混匀，再进行下一步操作。
      注意：根据特定样本浓度和最终PCR反应体积调整标准曲线的浓度范围。
2. 检测受体细胞中的人类线粒体DNA
   1. 将来自P0.5新生小鼠的原代前脂肪细胞以第1节中规定的密度和培养基条件接种于60 mm培养皿中。
   2. 从供体HepG2细胞中分离线粒体，并按照第2节所述执行线粒体转移实验（MTA）。
   3. 将培养物在37℃下孵育24小时 °C 和 5% CO₂₂.
   4. 按照第1节所述的培养基更换方案，在第1、3、5天诱导棕色脂肪向分化24–120小时。
   5. 吸弃培养基，用 2 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞 2 次。
   6. 采用酸-胍基-苯酚-氯仿法提取总DNA²².
      注意：始终在通风橱内进行分装和相分离操作，以避免吸入有毒的苯酚蒸气。请使用双层腈类手套或耐化学腐蚀的重型手套。
   7. 进行相分离，并弃去位于中间相上方的全部水相。
      关键步骤：彻底去除水相，以防止污染并确保下游qPCR所用DNA的高纯度。
   8. 每1 mL初始提取试剂中加入0.3 mL 100%乙醇。盖紧管盖，通过倒置剧烈混匀。
   9. 室温静置3分钟，然后在2,000 × g下离心 × g 4℃下持续5分钟 °C 以沉淀 DNA。
   10. 将苯酚-乙醇上清液转移至另一离心管中，用于潜在的蛋白质分离。每使用1 mL提取试剂，用1 mL含10%乙醇的0.1 M柠檬酸钠溶液（pH 8.5）重悬DNA沉淀。
   11. 室温静置30分钟，期间轻柔颠倒数次，然后在2,000 × g下离心 × g 4℃下5分钟 °C. 弃去上清液。
   12. 再重复柠檬酸钠洗涤步骤两次。
   13. 每1 mL初始提取试剂，用2 mL 75%乙醇洗涤所得沉淀。
   14. 室温静置20分钟，然后在2,000 × g条件下离心 × g 4℃下5分钟 °C.
   15. 弃去上清液，将沉淀在空气中干燥10分钟。加入0.3–0.6 mL 8 mM NaOH，反复吹打至沉淀完全溶解，使DNA溶解。
   16. 在 12,000 离心 × g 4℃下10分钟 °C，以去除不溶性残渣。将上清液转移至无菌管中，用 HEPES 调节 pH 至 7–8。
   17. 使用微量紫外-可见分光光度计测定DNA浓度和纯度（A(260)/A(280) 和 A(260)/A(230) 比值）。
   18. 将模板稀释至无核酸酶水中，使总DNA终浓度为15 ng。按照第4.3节的规定，使用光学96孔板对人线粒体DNA进行定量实时PCR（qPCR）。
   19. 使用对数回归模型分析扩增结果。
       注意：使用DNA浓度和对应的循环阈值（Ct）值作为变量进行对数回归分析。
3. 基因表达的RT-qPCR检测
   1. 细胞制备与分化
      1. 按照第1.1节所述，将来自P0.5新生小鼠的原代前脂肪细胞接种于60 mm培养皿中。
      2. 分离线粒体并按照第2节中的步骤进行线粒体转移实验（MTA），将培养物孵育24小时。
      3. 根据第1节中的方案，诱导棕色脂肪生成24–120小时（在分化第1、3、5天取样）。
   2. 总RNA提取
      1. 移除培养基，每1 mL加入1 mL酸性胍-苯酚-氯仿提取试剂 × 10⁶ 将细胞直接加入培养皿中。通过反复吹打使样品匀浆，直至裂解液均匀。
         注意：始终在通风橱内进行分装和相分离操作，以避免吸入有毒的苯酚蒸气。请使用双层丁腈手套或耐化学腐蚀的重型手套。
      2. 每使用1 mL提取试剂，加入0.2 mL氯仿。盖紧管盖，用手剧烈振荡15秒。室温下静置3分钟，然后在12,000 ×g条件下离心 × g 4℃下孵育15分钟 °C.
      3. 小心地将上层水相转移至新的无核酸酶离心管中，避免接触中间相。将样品置于冰上保存。
      4. 每使用1 mL提取试剂，加入0.5 mL异丙醇。轻轻颠倒混匀，在室温下孵育10分钟。
      5. 在 12,000 离心 × g 4℃下10分钟 °C 以沉淀 RNA。通过倒置弃去上清液。
      6. 用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀。短暂涡旋振荡，然后在7,500 × g下离心 × g 4℃下5分钟 °C.
      7. 弃去上清液，在室温下将RNA沉淀晾干10分钟。将沉淀重悬于30 µ无核酸酶水。将样品在60℃下孵育 °37°C 下孵育 15 分钟，以确保完全溶解。
      8. 测定RNA浓度和纯度（A₂₆₀/A₂₈₀ 使用微量紫外-可见分光光度计测定比值。
      9. 通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。
   3. DNase 处理
      1. 加入0.1倍体积的10× DNase 缓冲液和 1 µ将 DNase 酶加入各 RNA 样品中。用移液器轻轻混匀。37 ℃ 孵育反应体系 °30 分钟，37°C
      2. 通过轻弹或涡旋振荡重悬DNase失活试剂，直至混悬液均匀。加入失活试剂（RNA样本体积的0.1倍，或2 µL，取较大者）并充分混匀。室温孵育5分钟，期间 flick 离心管3次以保持试剂悬浮。
      3. 在 10,000 离心 × g 孵育1.5分钟。将含有RNA的上清液转移至新管中。
         关键步骤：确保未带入DNase失活试剂，因为它会抑制后续的cDNA合成。
   4. 逆转录（RT）
      1. 定量处理后的RNA，并用无核酸酶水稀释至最多2 µ每20微克总RNA µL 反应。
      2. 在冰上按照制造商说明书配制反转录主混合液。将混合液分装至反应管中，然后加入RNA样品。
      3. 将样品放入热循环仪中，并按照试剂盒制造商指定的程序运行逆转录反应。
   5. 定量实时荧光PCR（qRT-PCR）
      1. 使用第4.3.4节中生成的cDNA作为PCR模板。将cDNA用无核酸酶的水稀释至工作浓度，每10 μL含20 ng µL反应。将所有试剂保持在冰上。
      2. 配制含有SYBR Green、引物和无核酸酶水的预混液，额外增加一定体积以补偿移液损耗。分装10 μL至各反应孔中。 µ将反应混合物各 20 μL 加入光学 qPCR 板的每个孔中。
      3. 用光学粘合膜密封反应板，短暂离心以使液体沉至管底。将反应板放入实时荧光定量PCR仪中，并使用以下程序进行扩增： 快速循环模式。
      4. 确定阈值循环（Ct）值，并使用相对定量方法进行分析 ΔΔCt 法。在程序结束时进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。
         注意：将目标 mRNA 表达量归一化至 36B4 以内源性管家基因的mRNA水平为参照。qPCR板在配制后2小时内上机运行；否则，将密封的qPCR板保存于4℃ °C.
4. 蛋白质印迹法
   1. 使用BCA法测定全细胞和线粒体提取物（参见第2.1.8和2.1.12节）中的蛋白质浓度。
   2. 准备30 µ每份样品加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液（如Laemmli缓冲液），使蛋白量达到指定值。
   3. 通过在95℃加热使样品变性 °5 分钟（或根据膜蛋白的具体温度要求进行操作）。
   4. 将样品加入聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，在恒定电压（例如 80–120 V）下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），直至染料前沿迁移至凝胶底部。
   5. 将PVDF膜浸入100%甲醇中1分钟以活化，随后在转移缓冲液中平衡。
   6. 组装转膜夹心结构，确保凝胶与膜之间无气泡。
   7. 将蛋白质通过电转印以400 mA电流转移至PVDF膜上，持续2小时。保持系统温度在4℃。 °C 在整个过程中。
   8. 用含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBS-T）配制的5%脱脂牛奶溶液，在室温下孵育膜1小时，以封闭非特异性结合位点。
   9. 将膜与一抗（以封闭液按1:1,000稀释）在4℃孵育过夜 °在温和振荡条件下于 C。
   10. 洗涤膜 3 次 × 用TBS-T洗涤15分钟。
   11. 室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育2小时。
   12. 用 TBS-T 洗涤膜 3 次，最后用 1 次 5 分钟的洗涤× TBS
   13. 使用增强型化学发光（ECL）底物显影蛋白条带，通过数字成像系统采集信号。
       注意：根据目标蛋白的分子量调整聚丙烯酰胺凝胶浓度（例如 8%、10% 或 12%）。如果电转印装置无主动冷却系统，需每小时更换一次冰盒，并将转印槽浸入冰浴中。膜可储存于 1× 4 °C 的 TBS °若可视化延迟，则为 C。

结果

线粒体提取及其结构与呼吸完整性

为了评估线粒体数量增加对棕色脂肪生成的影响，在未分化的前脂肪细胞中进行了线粒体转移实验（MTA）（图1A）。线粒体分离自原代小鼠前脂肪细胞（mMito）以及人肝癌HepG2细胞系（hMito）。Western印迹分析显示，与全细胞提取物相比，两种线粒体制备物中线粒体标志物TOMM20均显著富集（图1B）。对分离组分进行的透射电子显微镜（TEM）分析显示出结构清晰的双层膜结构，并保留了完整的嵴，符合完整线粒体的形态特征（图1C）。氧消耗测定结果显示，将线粒体制备物加入培养基后，氧气浓度曲线斜率呈负向显著下降，表明耗氧量明显增加；在补充ADP后，耗氧进一步升高，证实hMito和mMito制备物均保持了偶联呼吸功能（图1D）。

讨论

线粒体转移在脂肪生成中的生物学意义

我们的结果显示，尽管来自人和小鼠的外源性线粒体均可整合到分化中的前脂肪细胞的内源性线粒体网络中，但人为增加线粒体质量并不足以驱动棕色脂肪生成程序。这些发现表明，棕色脂肪生成过程中典型的线粒体扩增是细胞分化的结果，而非机制上的限制因素或主要驱动因素。这些观察结果与以往在多能干细胞中的研究形成对比，后者显示线粒体移植（MTA）可显著增强分化或诱导代谢重编程^23,24。在本研究中，小鼠线粒体分离自肩胛间棕色脂肪组织（BAT）的基质血管组分（SVF），该组分此前已被鉴定为已定向的前脂肪细胞²⁵。我们的数据表明，一旦细胞已定向于棕色脂肪细胞谱系，仅增加线粒体质量并不能显著改变其分化程序。

如果线粒体提供调控细胞核转录程序的关键逆行信号（例如 MOTS-c、Humanin、长链非编码 RNA、ROS 或三羧...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 培养皿	SPL生命科学	10101SPL
10x Tris/甘氨酸缓冲液	BioRad	1610734
12 mm 玻璃盖玻片	Marienfeld	111520
12孔板	SPL Life Science	30012SPL
16% 甲醛水溶液	Invitrogen	28908
18 mm 玻璃盖玻片	HART	-
24孔板	SPL Life Science	30024SPL
3,3′三碘甲腺原氨酸钠盐（T3）	Sigma	T6397
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）	Calbiochem	410957
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1	伯乐（BioRad）	1610158
35 mm 培养皿	SPL Life Science	20035SPL
6孔板	SPL Life Science	30006SPL
60 mm 培养皿	SPL Life Science	20060SPL	用于原代前脂肪细胞及DNA/qPCR实验；未提供供应商/目录号
AccuRuler RGB Plus 预染蛋白标准品	雌激素	02102-250
ACK裂解缓冲液	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL（胰岛素）	诺和诺德	A10AB01
ADP	默克	117105
琼脂糖	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	用于RNA完整性验证；未提供供应商/目录号
过硫酸铵	伯乐（BioRad）	1610700
抗兔 IgG，HRP 标记抗体	细胞信号传导	7074
抗大鼠IgG，HRP标记抗体	细胞信号传导	7077
抗生素-抗真菌剂	Gibco	15240062
Axio Observer 倒置显微镜机身	卡尔·蔡司	431007-9901-000	来自补充方法
BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	D49328
BD流式细胞仪设置与追踪微球	BD 生物科学	-	来自补充方法；未提供目录编号
BD FACSDiva 软件 v8.0.3	BD 生物科学	-	来自补充方法
BD LSRFortessa X-20 细胞分析仪	BD 生物科学	-	现有条目已标准化以匹配补充文件
BioRender	BioRender	-	用于创建图1的工作流程
印迹级封闭剂	伯乐（BioRad）	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA反转录试剂盒	Invitrogen	4374966
细胞滤网 100 μ米，尼龙	Falcon	352360
细胞滤网 40 μ米，尼龙	Falcon	352340
II型胶原酶	Gibco	17101-015
地塞米松	Sigma	D4902
DMEM粉末，高糖，含丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	12800017
DMEM/F-12，无酚红	赛默飞世尔科技	21041025
DMEM/F-12，粉末	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	诱导培养基溶剂；未提供供应商/目录信息
EMBed-812 包埋试剂盒（Epon）	电子显微镜科学公司	14120
乙醇，绝对	默克	100983
乙二醇双(β-氨基乙基醚-N,N,N′，N′四乙酸四钠盐（EGTA）	默克	324626
FAST SYBR预混液	赛默飞世尔科技	4385612
FCCP	Sigma	C2920
胎牛血清	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	流式细胞术分析软件
Fluoromount-G	赛默飞世尔科技	7984-25
GAPDH 抗体	圣克鲁斯	sc-32233
葡萄糖	Gibco	15023-021
谷氨酸	Sigma	G1626
25% 戊二醛水溶液	电子显微镜科学公司	16210
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	统计学/对数回归分析软件
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 100X	赛默飞世尔科技	78442
HEPES	生物工业公司	41-122-100
组蛋白 H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	美国国立卫生研究院	-	脂滴图像分析软件
免疫印迹PVDF膜	BioRad	1620177
吲哚美辛	Sigma	I7378
胰岛素注射器	蔓越莓	AAJECIN3	用于细胞匀浆；未提供供应商/目录编号
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO₃	Sigma	60339
LAMP-1 抗体	Abcam	ab25245
上样缓冲液（含还原剂，红色）	赛默飞世尔科技	39000
苹果酸	Sigma	M1000
MgCl2	Calbiochem	208291	线粒体检测溶液组分；未提供供应商/目录信息
MgSO4	Sigma	M2643
微量紫外-可见分光光度计	NanoDrop	ND-1000	用于DNA/RNA定量；未提供供应商/目录号
超纯水（MilliQ）无菌	-	-
MitoTracker Deep Red FM	赛默飞世尔科技	M22426
MitoTracker Green	赛默飞世尔科技	M7514
NaCl	默克	1064041000
尼康C2plus共聚焦激光扫描显微镜	尼康	C2-SCHJ-1	来自补充方法
尼康Ti2倒置显微镜	尼康	MEA54010	来自补充方法
NIS-Elements AR 软件 v5.11.03	尼康	MQS31000	来自补充方法
无核酸酶水	温克勒	BM-0140
光学96孔qPCR板	赛默飞世尔科技	4346907	用于 qPCR；未提供供应商/目录号
光学粘合膜	赛默飞世尔科技	4311971	用于 qPCR 板封膜；未提供供应商/目录号
轨道摇床	实验室线	4630-1	封闭/通透化过程中使用；未提供供应商/目录编号
四氧化锇	电子显微镜科学公司	19100
Oxygraph+	Hansatech	-
PBS 10X 分子生物学	温克勒	BM-1340
Plan Apo 60x 油镜，数值孔径 1.4	尼康	MRD01605	来自补充方法
Plan-Apochromat 10x/0.45 M27 空气物镜	卡尔·蔡司	420640-9900-000	来自补充方法
R 软件 v4.5.2	R 基金会	-	用于数据分析
实时荧光定量PCR仪	赛默飞世尔科技	Quantum Studio 3	用于逆转录和qPCR；未提供供应商/目录号
雷诺氏染色（3%柠檬酸铅）	电子显微镜科学公司	22410-1
RIPA裂解缓冲液	赛默飞世尔科技	89901
罗格列酮	默克	557366
RStudio	正位	-	用于 R 分析；论文及补充材料引用了 RStudio
皂苷	Sigma	47036
碳酸氢钠	Sigma	S5761
二甲胂酸钠	电子显微镜科学公司	12300
十二烷基硫酸钠	BioRad	1610301
氢氧化钠（NaOH）	默克	B0547933	T3溶剂；未提供供应商/目录信息
蔗糖	默克	573113	线粒体分离缓冲液组分；未提供供应商/目录编号
四甲基乙二胺（TEMED）	伯乐（BioRad）	1610800
Thermo Scientific F200C 透射电子显微镜	赛默飞世尔科技	-
TOMM20 抗体	细胞信号传导	42406
Tris缓冲盐溶液（TBS-10X）	细胞信号传导	12498
TRIzol试剂	Invitrogen	15596018
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Gibco	25200056
结核菌素注射器	NIPRO	JD-01T2516/IB	用于细胞破碎；未提供供应商/目录编号
TURBO DNA-free 试剂盒	赛默飞世尔科技	AM1907
Tween 20，分子生物学级	Promega	H5152
Ultracut R	Leica	-
醋酸铀酰	电子显微镜科学公司	22400
VAP-A 抗体	圣克鲁斯	sc-293278
Vinculin 抗体	Santa Cruz	sc-73614
Westar Supernova	Cyanagen	XLS3
配备Airyscan检测器的蔡司LSM 880共聚焦激光扫描显微镜	卡尔·蔡司	421102-9010-000
ZEN 软件	卡尔·蔡司	-	Airyscan/去卷积软件
基因	正向（5’→3’)	反向（5’→3’)
H-mtDNA	CACTTTCCACACAGACATCA	CACTTTCCACACAGACATCA
PPARγ	CACAATGCCATCAGGTTTGG	GCTGGTCGATATCACTGGAGATC
PPARα	ACAAGGCCTCAGGGTACCA	GCCGAAAGAAGCCCTTACAG
PCGα-1	AACCACACCCACAGGATC	TCTTCGCTTTATTGCTCCATGA
UCP1	GAGGTGTGGCAGTGTTCATTG	GGCTTGCATTCTGACCTTCA
PRDM16	GACATTCCAATCCCAGA	CACCTCTGTATCCGTCAGCA
PLIN1	GGGCTGTCTGAGACTGAGGT	GCAGAACTCTCTGGAGCACG
FATP4	ACCCAAAGCTGCCATTGTG	GCATGCGGAATCCAAGTACCA
36b4	CACTGGTCTAGGACCCGAGAAG	GGTGCCTCTGGAGATTTTCG