玉米减数分裂细胞中的三维免疫定位

摘要

该雄性玉米小孢子母细胞免疫定位方案在减数分裂过程中保持了细胞的三维完整性。该方法可在经多聚甲醛固定并保存的材料中，动态追踪最多三种独立抗体的细胞内定位，此外还可使用染色DNA的DAPI。

摘要

在减数分裂前期 I 期间，染色体的物理构型在不同发育阶段表现出广泛差异。幸运的是，这些阶段特异性的构型使得能够准确识别各个经典的减数分裂阶段，这些阶段分别被称为细线期（例如“细线”）、偶线期（例如“成对的线”）、粗线期（例如“粗线”）、双线期（例如“双线”）和终变期（例如“排斥运动”）。对前期 I 期间发生的多种细胞遗传学现象（如重组、配对和联会）进行可视化分析，需要高度可靠的免疫定位技术。与传统的铺展和压片技术会消除所有亚细胞和核内信息不同，本文所述的三维保存方法能够将关键的减数分裂蛋白保留在其天然的亚细胞位置（包括细胞质、细胞核以及核内区域：常染色质、异染色质和核仁）。因此，本实验方案描述了如何高效地固定玉米雄性减数分裂花药，从花药中解剖并释放出减数分裂细胞，并在玉米雄性减数分裂细胞中同时进行三种关键蛋白的免疫定位。

引言

减数分裂是调控模式植物和作物性状遗传的关键过程；因此，简便的显微技术能够稳定且真实地可视化蛋白质定位，有助于理解这些性状如何更高效地传递。然而，减数分裂细胞内蛋白质定位的可视化效果因所用技术不同而存在较大差异^1,2。因此，本实验方案旨在提供一种简单、可重复的方法，以消除观察减数分裂细胞过程中产生的假象。例如，长期以来人们认识到，观察减数分裂染色体是一个精细的过程，通常需要通过简单的压片法或更具破坏性的铺展技术来破碎细胞^3,4,5。在Arabidopsis thaliana中，研究人员通常采用以卡诺固定液（乙醇与冰醋酸按3:1比例混合）为基础，并结合多种去污剂（如Lipsol、Tween-20和TritonX-100）以及含有纤维素酶、果胶酶和细胞解旋酶的酶混合物的铺展方法，以破坏细胞结构，从而在其微小染色体上实现有效的免疫定位^1,2。这些技术将染色体的三维构象转变为二维形式，使得在单张图像中快速观察到人工分散的全部染色体成为可能。某些经受住剧烈处理的染色体特征可能得以显现；然而，这些方法往往不能真实反映细胞和染色体在活体（in vivo）条件下的典型行为⁶。二维铺展技术可在包括玉米在内的多种植物中快速、广泛地同时检测最多两种抗体^7,8,9,10,11。

尽管传统的二维技术具有便利性，但现在人们认识到，某些现象对破坏性方法较为敏感，若在细胞、细胞核或染色体铺展或压片过程中造成损伤，则无法观察到这些现象。例如，RAD50蛋白在细线期或着丝粒配对阶段（细线期/偶线期）从细胞质向细胞核的移动，仅在结构完整的三维花粉母细胞中被检测到¹²。本文为读者提供了一种详细的四天三维实验方案，利用4%多聚甲醛固定的花药，对玉米雄性花粉母细胞中的三种关键蛋白进行免疫定位，从而保持细胞的结构完整性。与此前报道的类似玉米三维免疫定位方法⁸相比，我们补充了实用的操作说明和常见问题的解决方案，以帮助研究人员。该方案将有助于植物生物学家和植物育种学家研究多种减数分裂过程，例如联会复合体对减数分裂重组的调控机制。

方案

警告：操作甲醛和丙烯酰胺时需使用适当的个人防护装备并在化学通风橱中进行；这两种物质均有毒性（丙烯酰胺在聚合前还具有神经毒性）。研究中使用的所有材料均列于材料表中。

1. 固定玉米花药以保存小孢子母细胞的完整结构

1. 使用处于V13期的玉米植株，其花序仍在茎内生长。在减数分裂花药固定的那一周，佩戴手套，轻轻按压茎部隆起处，判断其是否足够柔软以进行切开。
   注意：本固定与免疫定位方案可用于玉米和 拟南芥 减数分裂期的花蕾（小于400 µm）。但对于玉米而言，所需时间取决于所用品种和一年中的种植季节（春季生长较快），以自交系B73为参考，从播种到花蕾形成大约需要8周，而早花自交系A344仅需6周。
2. 缓冲液的配制
   注意：化学固定前一天，需仔细配制以下工作液，并正确标记所有瓶子。
   1. 配制 100 mL 10 倍缓冲液 A（Buffer A, BA） 盐，通过加入4.53 g PIPES（哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸)）至终浓度150 mM，5.96 g KCl（终浓度800 mM） 1.17 g NaCl（终浓度 200 mM），0.74 g EDTA（终浓度 20 mM）, 0.19 g EGTA（终浓度 5 mM） 和 90 mL H₂首先用KOH将pH调至6.8–7，然后定容至100 mL。
   2. 最后，使用带有0.45 µm孔径PES膜的一次性Rapid-Flow无菌滤器过滤除菌（4 °C保存，切勿冷冻；可存放数月）。
   3. 准备：
      -50 mM PIPES（用KOH调节pH至7）
      - 0.4 M 的亚精胺储备液（先前溶于 50 mM PIPES 中，用 KOH 调节 pH 至 7，分装为 50 μL 份量，于 -20 °C 保存）。
      - 0.4 M 的亚精胺储备液（溶于 50 mM PIPES 中，用 KOH 调节 pH 至 7，分装为 125 μL 体积，于 -20°C 保存）
      - 1 M 二硫苏糖醇（DTT）储备液（溶于 0.01 M 醋酸钠溶液，调 pH 至 5.2，分装为 100 μL 冻存于 -20 °C）。
      - 山梨醇 2 M，4 °C 保存。
3. 在冰上配制50 mL 2×缓冲液A（BA），使用10 mL 10×缓冲液A盐溶液（4 °C保存）、50 μL 亚精胺（0.4 M，溶于50 mM PIPES，用KOH调节pH至7）、125 μL 精胺（0.4 M，溶于50 mM PIPES，用KOH调节pH至7）、100 μL DTT（1 M，溶于0.01 M醋酸钠，pH 5.2），涡旋充分溶解；切勿加热。
   1. 然后加入16 mL的2 M山梨醇，用无菌水定容至50 mL。使用一次性Rapid-Flow无菌滤器过滤除菌，于4 °C保存。
4. 准备一个由5–10张湿润的纸巾组成的湿盒，将纸巾放入塑料盒中，确保盒盖密封良好，并去除多余的水分。
5. 然后，将以下物品放入托盘中：湿室、剃刀刀片、精细镊子（已用70%乙醇灭菌）、一小瓶无菌水和封口胶带。将托盘及其内容物带至步骤1.1中检查过的玉米植株处。
6. 使用剃刀刀片在花序位置切开凹凸不平的茎。可利用主穗状花序分枝以及花序的侧生分枝来采集减数分裂期的小花。
   注意：这些雄穗分枝含有需要采集减数分裂花药的目标小花。每朵小花包含6个花药，通常选取其中3个较大、位于上方的花药用于分析。花药的大致大小和颜色与各个减数分裂时期相对应：长约1 mm、近乎透明的花药处于细线期，长约1.5 mm、半透明的花药处于偶线期，长约2 mm、呈白色或乳白色的花药处于粗线期，而呈淡黄色、长约 > 长度为2毫米的花药可能含有处于双线期、四分体以及完成配子形成的花粉粒。需注意，不同玉米遗传背景下的花药长度与发育阶段的对应关系可能存在差异，且环境因素（如高温）可加速减数分裂进程并改变这种对应关系。建议研究人员针对每一种特定的玉米基因型和生长条件，通过乙酸洋红压片法（参见1.6）验证花药大小与发育阶段的对应关系。
7. 使用精细镊子解剖并小心采集花序的侧枝，将其包裹在湿润室的纸巾内。
   注意：经过一定练习后，仅需在茎上做一条3–4 cm长的线性切口，即可取出减数分裂期的雄穗分枝。可用普通美纹纸胶带将切口缠绕三到四圈予以闭合，从而能够利用同一植株上未解剖的其余花序进行后续收获。组织将继续生长，之后可用于授粉。
8. 将花序置于室温下。仅使用带有处于减数分裂期花药的小花的花序分支。用半湿毛巾覆盖花序分支，但不要将其浸入水中。
9. 若毛巾变干，需再次润湿。将盒子盖好，直至进行花药解剖，最好盖至开始收集花药前30分钟。
10. 使用带有校准刻度的双目体视显微镜，将小花中的新鲜花药收集到35 mm培养皿中的2 mL 1x BA溶液中，通过花药大小和颜色作为替代指标，准确鉴定减数分裂时期。
    注意：为准确判定取样花药中的小孢子母细胞时期，需从每朵小花的三个同步发育的花药中选取其一，迅速采用3:1的乙醇-冰醋酸固定液固定，经乙酸洋红染色后，利用传统压片显微技术进行分析。¹³.
11. 在1× BA缓冲液和0.0025% Tween-20中配制4%甲醛固定液
    注意：对于 3 mL 体系，加入 750 μL 16% 甲醛和 750 μL H₂O、1.5 mL 2x BA 和 7.5 μL 1% Tween-20
12. 移除初始的 BA 缓冲液，向固定好的花药中加入 3 mL 新鲜固定液，置于新的 35 mm 培养皿中，用封口膜密封以防止甲醛挥发，在旋转摇床（转速设定为 40–60 rpm，或 0.2 x）上于室温固定 45 分钟，然后将其放置在一个更大的培养皿中 g）。在室温下进行。花药应轻微旋涡状搅拌以确保良好固定。它们通常漂浮在液面。
13. 用3 mL 1× BA冲洗，然后将样品转移至小型培养皿中，于室温下置于旋转摇床（40–60 rpm）上孵育45分钟。
14. 使用洁净的镊子将花药转移至一个含有3 mL新鲜1X BA的小型35 mm培养皿中。用封口膜将培养皿紧密密封。然后将该小培养皿放入另一个培养皿中，并用铝箔覆盖以避光，于4 °C保存备用。如需可保存数月。

2. 将玉米花粉母细胞包埋于聚丙烯酰胺夹心垫中

第1天：3D载玻片制备

1. 通过等体积（1:1）混合丙烯酰胺和2x BA，配制2 mL丙烯酰胺溶液。在加入亚硫酸钠（NaS）和过硫酸铵（APS）之前，将丙烯酰胺溶液在真空条件下脱气5–10分钟。
2. 用移液器将100 µL丙烯酰胺与2x BA按1:1比例混合的溶液分装至1.5 mL离心管中。
   准备的管数取决于您将要制备的载玻片数量。
3. 配制1 mL 1x BA溶液。
4. 在培养皿上放置2 cm × 2 cm的Parafilm膜，并将其置于解剖显微镜下。用移液器将50 µL含花药的BA溶液滴加到Parafilm膜上。用剪刀修剪移液器吸头，以便更方便地释放花药。
   1. 在Parafilm膜的另一位置滴加25 µL BA溶液。
5. 用镊子夹住花药，用解剖刀切开花药顶端，轻轻挤出减数分裂细胞。使用移液器将减数分裂细胞轻柔转移至25 µL BA液滴中，并轻轻混匀。
6. 从减数分裂细胞混合液中吸取10 µL，滴加到另一块盖玻片上。
7. 迅速吸取5 µL 20%（0.2 g/1 mL）NaS和5 µL 20%（0.2 g/1 mL）APS，加入含有丙烯酰胺/2x Buffer A的1.5 mL离心管中。
8. 迅速吸取5 µL上述混合液，滴加到盖玻片上，并与减数分裂细胞轻柔混匀。将一块聚-L-赖氨酸包被的盖玻片覆盖其上，但需旋转45度。仅使用一块聚-L-赖氨酸包被的盖玻片（可购买商用产品，或通过将盖玻片浸入培养皿中的聚-L-赖氨酸溶液数分钟，随后取出并置于新的洁净培养皿边缘晾干制备），有助于聚合后完整释放凝胶垫。盖玻片需从溶液中快速取出并干燥后使用。对于超分辨率显微镜观察，必须使用厚度标准化的高性能盖玻片（≤170 nm）¹⁴。
9. 请在30–50分钟内不要触碰盖玻片，以使样品在室温下充分聚合（快速聚合过程会缩短凝胶垫的干燥时间，但所得质量欠佳）。
10. 对每张需制备的载玻片重复步骤“2.6–2.9”。
11. 用刀片小心分离所有盖玻片。将所有盖玻片（凝胶垫面朝上）放置于6孔板中的聚丙烯酰胺垫（或大部分凝胶垫）上。
12. 每张带凝胶垫的盖玻片用2 mL 1x磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤10分钟。重复洗涤一次，总共在室温下洗涤20分钟 。
13. 通过混合49.4 mL 1x PBS、100 µL 0.5 M EDTA和500 µL Triton，配制50 mL溶液。
14. 每张带凝胶垫的盖玻片用1 mL上述含1 mM EDTA和1% Triton的1x PBS溶液在室温下冲洗2小时。
15. 配制新鲜的封闭缓冲液，每张载玻片使用1 mL，包含1x PBS、1 mM EDTA、0.1% Tween-20和3% BSA。配制50 mL封闭缓冲液时，混合44 mL 1x PBS、100 µL 0.5 M EDTA、5 mL 1% Tween-20溶液和1.5 g BSA。优先选用BSA而非驴血清作为封闭剂，因其在使用多种一抗和二抗时有助于最小化非特异性信号。

3. 免疫定位

1. 使用封闭缓冲液将一抗（或多种一抗）稀释至所需浓度。根据其联合使用时产生可区分信号的能力来组合一抗。这些一抗应来源于不同物种，例如兔、大鼠、豚鼠或鸡，以便能被特异性的荧光标记二抗识别。应避免使用驴或山羊来源的抗体，因为它们通常用作二抗。我们建议使用单一物种的二抗（例如，在图1所示实验中使用山羊来源的二抗）。
2. 用移液垫将50 µL稀释后的一抗加至每个盖玻片的中央。
   在孔之间加入水以减缓蒸发。将培养板放入湿盒（带盖的塑料盒）中，4°C孵育过夜。

第2天：洗涤

3. 配制 500 mL 洗涤缓冲液（1× PBS + 0.1% Tween-20 + 1 mM EDTA）。
4. 用移液器抽吸去除各孔中的过夜溶液。
5. 用 1 mL 洗涤缓冲液快速洗涤每个盖玻片两次，然后将其从孔中取出。
6. 每张盖玻片加入 1 mL 洗涤缓冲液，室温孵育 1 小时。
   重复此步骤 7 次。（共 8 小时）
7. 最后一次洗涤后，在孔之间加入水，盖上板子，并在湿盒中过夜放置。

第3天：二抗孵育、洗涤及封片

8. 用封闭缓冲液将每种二抗按1:50的比例稀释。
   吸除洗涤液。使用移液器将50 µL稀释后的二抗滴加至每个垫片的中心。
   注意：每种二抗应与具有非重叠发射波长的荧光染料配合使用。例如，一种二抗应标记AlexaFluor488（绿色），另一种标记AlexaFluor555（橙色），第三种标记AlexaFluor647（远红），后者可与DAPI（激发波长461 nM，蓝色）联合使用。其他荧光染料（如DyLight，由Dyomics GmbH公司提供）也可使用。此外，所有这些二抗不应与其他用于一抗混合物中的物种发生交叉反应。例如，抗兔二抗应经过交叉吸附处理，仅特异性识别兔抗体，而不识别大鼠或豚鼠抗体。所有二抗均需满足此要求。在进行共免疫定位实验时，应通过精心设计的实验同时验证上述各项条件。
9. 在孔之间加入水，将板放入湿盒中，室温孵育2小时。
10. 吸除孔中的溶液。
11. 每孔加入1 mL洗涤液，室温下洗涤4次，每次1小时（共4小时）。
12. 每孔加入1 mL 1x PBS，室温洗涤10分钟，重复此过程两次。（总计30分钟）
13. 用1x PBS稀释DAPI。
14. 使用终浓度为1 µg/mL的DAPI（DAPI粉末溶于水中）染色，每孔加入500 µL，室温孵育30分钟。
15. 将ProLong™ Gold抗荧光淬灭剂从4 °C冰箱中取出，使其解冻并恢复至室温。
16. 用1x PBS洗涤载玻片，每孔1 mL，室温下每次30分钟，重复三次。（总计1小时30分钟）
17. 吸除最后一次洗涤液。
18. 然后在每个垫片中央加入两滴ProLong™ Gold抗荧光淬灭剂。
19. 将盖玻片封片于每张载玻片上，标记每张载玻片，用精细镊子从孔中提起盖玻片，并缓慢放置于载玻片上。使用精细镊子，将第二片盖玻片缓慢地叠放在第一片之上。使用真空装置从盖玻片边缘去除多余的甘油。用两层指甲油密封盖玻片边缘。
20. 若载玻片未立即在荧光显微镜下观察，请将其置于-20 °C冰箱中避光保存，直至观察时取出。后续使用前，将载玻片置于载片盒中，水平放置于暗处，室温平衡1小时，以防止冷凝水形成。

第4天：显微镜观察

21. 在正确的激发波长和滤光片下观察载玻片。标准共聚焦显微镜已足够，但建议使用配备60倍物镜的显微镜，通过每0.2 µm进行一次z轴层扫，结合连续图像采集，并利用Applied Precision SoftWoRx^®软件进行去卷积处理，以实现对整个细胞的三维成像。

结果

利用本实验方案，我们可同时观察玉米中三种关键减数分裂蛋白的定位模式图1）。减数分裂蛋白第一次分裂缺失1（ABSENCE OF FIRST DIVISION 1，AFD1）是减数分裂黏连蛋白复合体中α-黏连素REC8亚基的同源物。ASYNAPTIC 1（ASY1）是一种关键的轴向元件，而ZYPPER1（ZYP1）则是联会复合体的横向元件。¹⁵DAPI 染色可清晰显示细胞核及染色质，有助于识别减数分裂各亚阶段，同时也显示出质体和线粒体 DNA 较弱的天然胞质染色（图1A 和 C, 第二列用于 DAPI 通道，箭头)同样，本方案不仅可在染色体上，还可于前期细线期（pre-leptonema）在细胞质中定位 AFD1、ASY1 和 ZYP1图1A在后期，信号集中在染色体上，但在完全联会之前，仍有大量ZYP1存在于细胞质中...

讨论

与其他方法相比，本方案的关键优势在于能够保留有关减数分裂染色体蛋白加载的三维结构关键信息。而常规铺展技术无法保存这些特征^1,2。然而，本方案也存在两个局限性：与可在一天内完成的常规铺展技术相比，本方法耗时较长且技术要求较高。相比之下，本方案需要四天的工作时间，主要原因是包含大量洗涤步骤以及一抗和二抗的过夜孵育，这些步骤若缩短时间将导致信噪比显著下降。

在技术方面，与以往的三维实验方案^8,12,15相比，本方法的改进之处在于能够同时可视化三种蛋白质，而非仅限于两种。如图1所示，通过该方法可克服非特异性信号干扰，因为每种蛋白质均具有独特的成像特征。然而，这一结果依赖于前期对单个抗体的分析及其在不同物种中的原始设计，以确保它们在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管 Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon 管	赛默飞世尔科技	339651
50 mL Falcon管	赛默飞世尔科技	339652
6 孔 Falcon 聚苯乙烯微孔板	赛默飞世尔科技	08-772-1B
乙酸，60%	赛默飞世尔科技	A38-212
丙烯酰胺 30%  和丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液，29:1	伯乐（Bio-Rad）	1610157
铝箔折叠	雷诺兹	U07211R0
过硫酸铵（APS）	默克	A3678
双目立体显微镜	NA	NA
牛血清白蛋白（BSA）	默克	A9418
DAPI	默克	D9542
DelltaVision 显微镜	Olympus	NA
蒸馏水 H2O	NA	NA
带有0.45微米PES滤膜的一次性滤器单元 μ微孔	赛默飞世尔科技/Nalgene	09-740-63B
精细镊子 FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
山羊（IgG H+L）高度交叉吸附  AlexaFluor647 标记的抗大鼠抗体	Invitrogen	A-21247
山羊抗兔IgG（H+L）高交叉吸附AlexaFluor568标记抗体	Invitrogen	A-21428
山羊抗豚鼠IgG（H+L），经高度交叉吸附，AlexaFluor488标记	Invitrogen	A-11073
手套	默克	Z412392
生长室 / 温室 / 或田间	NA	NA
DTT	默克	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
3M 美纹纸胶带	Fisher Scientific	19-047-259
玉米种子	NA
显微镜用22 x 22 mm-1.5玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-542-B
显微镜 22 x 22 mm-H 盖玻片	Deckglä丝氨酸，蔡司	474030-9020-000
显微镜玻璃载片	Fisher Scientific	22-230-900
显微镜载玻片盒	Fisher Scientific	03-448-9
微量移液器 P20、P200、P1000	默克	CLS4069
NaCl	默克	S7653
指甲油	电子显微镜科学	72180
纸巾	默克	Z188956
Parafilm	默克	P7668
16% 多聚甲醛溶液	电子显微镜级	15710
PBS	默克	P4474
带盖塑料盒	特百惠	NA
聚-L-赖氨酸	默克	P4707
一抗（大鼠抗ZmAFD1、兔抗ZmASY1、豚鼠抗ZmZYP1）	NA
延长抗荧光淬灭	分子探针	P36934
培养皿（直径 × 高度：35 mm × 10 mm）	康宁	351008
培养皿 常规尺寸	默克	P5731
PIPES	默克	P1851
移液器吸头（0.5–10 μL），无菌	默克/康宁	AXYT300
移液器吸头（200 μL），无菌	默克/康宁	AXYT200Y
移液器吸头（1000 µL），无菌	默克/康宁	AXYT1000BRS
单刃剃刀片	Fisher Scientific	12-640
摇床平台振荡器	NA	NA
亚精胺	默克	85590
亚精胺	默克	S2626
山梨醇	默克	S8143
Tween-20	默克	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
超纯丙烯酰胺	Invitrogen	15512023
真空