一种半自动化方法用于检测果蝇前脑前内侧簇多巴胺能神经元数量的组间差异 果蝇 大脑

摘要

本方案介绍了一种半自动化方法，用于定量大型Drosophila原脑前内侧簇中的多巴胺能神经元数量。该方法专为检测和比较实验组与对照组之间的差异而设计，可减少对人工计数的依赖，为组间分析提供了一种实用工具。

摘要

Drosophila melanogaster 是研究神经退行性疾病（包括帕金森病，PD）的有力模式生物，主要通过分析多巴胺能（DA）神经元的退化及其相关的运动功能障碍来实现。传统上，果蝇大脑中 DA 神经元丢失的定量研究局限于较小且易于计数的神经元簇，例如原脑后内侧（PPM）簇和原脑后外侧（PPL）簇。相比之下，体积更大的原脑前内侧（PAM）簇包含超过 100 个神经元，手动计数极为困难，导致其在定量研究中长期被低估。迄今为止，已有报道的研究仍依赖于通过共聚焦 Z 层扫描进行耗时的手动计数，该方法费时且易产生变异。为弥补这一方法学上的不足，我们开发了一种基于开源工具 Labkit 的半自动化图像分析流程。本方案可在同一实验批次内实现对 PAM 簇中酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的高效组间相对定量。该方法始于标准的免疫荧光染色和共聚焦成像，随后提供详细的分步操作指南，用于图像分割与分析。该策略解决了 PAM 簇定量的瓶颈问题，为在神经退行性疾病模型中检测不同组间 DA 神经元易损性差异提供了实用的工作流程。目前帕金森病研究中对 PAM 簇关注较少，反映的是一种历史性的技术障碍，而非其生物学意义的缺失。通过克服这一障碍，本方法为系统研究 PAM 神经元在帕金森病中的易损性及其与非运动症状的潜在关联开辟了新的途径。

引言

醋蝇（Drosophila melanogaster）是研究神经退行性疾病遗传与分子基础的常用模式生物，尤其适用于帕金森病（PD）的研究¹。其保守的神经信号通路、成熟的遗传工具包以及较短的生命周期，使其特别适合用于研究与年龄相关的神经元易损性，并开展高通量的遗传学与药理学筛选^2,3。这些研究的核心在于多巴胺能（DA）神经元的分析，因其选择性变性是帕金森病的典型病理特征⁴。在Drosophila脑中，DA神经元被组织成若干离散的、可由基因识别的神经元簇^5,6。通过TH免疫染色并结合显微镜观察，可对特定神经元簇中DA神经元的进行性丢失进行可视化和定量分析，这一指标是评估实验模型中疾病进展及神经保护干预效果的主要功能读出指标^7,8。因此，对DA神经元丢失进行可靠定量，对于将Drosophila遗传学优势转化为有意义的帕金森病研究结果至关重要。

传统上，对多巴胺能神经元丢失的定量分析主要集中在酪氨酸羟化酶（TH）免疫染色的小型神经元簇，包括原脑后内侧（PPM）簇和原脑后外侧（PPL）簇，每个簇包含少于10个细胞，可通过肉眼轻松计数⁷。尽管耗时费力，通过共聚焦Z轴层扫进行人工计数仍是许多利用果蝇（Drosophila）开展的帕金森病（PD）研究中针对这些神经元簇的既定方法^9,10,11。相比之下，原脑前内侧（PAM）簇是果蝇大脑中最大的多巴胺能神经元群，包含超过100个细胞，其人工计数长期以来存在方法学瓶颈，导致该神经元群在大多数PD研究中难以被纳入分析^9,10,11。尽管PAM神经元在学习、记忆和动机神经回路中具有关键作用，这一技术局限仍导致其在神经退行性变的定量分析中相对被低估^12,13,14,15。值得注意的是，即使近期的研究仍依赖于这种低效的人工计数方法，凸显了该领域对标准化、自动化解决方案的持续且尚未满足的需求¹³。

为解决这一关键空白，我们开发了一种半自动化的图像分析流程，可在实验中实现对PAM簇内酪氨酸羟化酶阳性（TH⁺）神经元的高效群体相对定量。该方案利用开源的、基于机器学习的插件Labkit，结合Fiji/ImageJ平台及3D图像处理软件^16,17。核心工作流程要求用户对具有代表性的图像子集进行标注，以训练像素分类模型，随后将该模型应用于批量处理实验中的TH染色数据集，并生成细胞核斑点，再根据TH⁺区域对其进行分类。该方法在自动化与专家监督之间实现了平衡：既降低了完全手动计数的工作负担和变异性，又保留了研究人员在引导算法和审核结果中的参与。

本文旨在为研究人员提供一种逐步操作的实验方案，用于在实验内进行组间比较时，对PAM簇多巴胺能神经元进行高效、相对定量的分析。我们展示了从大脑解剖、免疫荧光染色、共聚焦成像到采用半自动化方法进行详细图像分析的完整工作流程。通过标准化这一关键定量步骤，本方案旨在帮助研究群体在分析中持续纳入大型PAM簇。该半自动化方法专为PAM簇设计，不适用于其他多巴胺能神经元簇，也不适用于视叶中酪氨酸羟化酶阳性（TH-positive）的神经元。该方法可促进基于果蝇（Drosophila）模型的PAM簇多巴胺能神经元易损性批量研究，并进一步推动突触可塑性、神经退行性变及药物筛选等相关领域的深入探索。

方案

1. 样品制备与共聚焦成像

1. 果蝇饲养与收集
   1. 将具有目标基因型的亲代果蝇进行杂交，以获得实验所需的子代。羽化后，每支新鲜培养管中收集20–30只果蝇。根据实验设计继续培养果蝇，直至达到所需的实验年龄。
2. 解剖前准备
   1. 取一个直径30 mm的培养皿盖，在其中填充至一半高度的Sylgard硅胶弹性体，制备解剖皿。向皿中加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）。另取0.6 mL微量离心管，分装450 µL含1× PBS和4%多聚甲醛（PFA）的固定液，并将该管置于冰上备用。
   2. 用5–10秒的CO₂脉冲麻醉10–20只果蝇，随后立即将其转移至置于冰上的60 mm培养皿中以维持其不动。
      注意：PFA具有毒性，且为疑似致癌物。操作时须在通风橱内进行，并佩戴手套、实验服和护目镜。废弃物应按照所在机构的危险品处理指南进行处置。
3. 果蝇脑解剖与固定
   1. 用镊子夹住果蝇翅基部位，将其腹面朝上浸入盛有PBS的解剖皿中。用精细解剖针刺穿胸部，将果蝇固定在Sylgard垫上。
   2. 将果蝇身体水平放置（例如头部在左，腹部在右）。用一把镊子夹住喙基部，另一把镊子完整移除整个喙，从而在复眼之间形成一个开口。
   3. 用两把镊子分别夹住暴露的眼缘，缓慢对称地向外拉开，以暴露脑组织，同时保持其与腹神经索的连接。
   4. 清除脑周围气管囊和脂肪体。切断腹神经索以释放脑组织，使其自然沉降至皿底，前侧朝上。
      注意：若沉降后的脑组织显示腹侧高于背侧（图1B、C），可用镊子轻轻按压抬高的部分使其平整。
   5. 用含0.1% Triton X-100的溶液预润P10移液枪头，防止解剖后的脑组织粘附于枪头内壁。使用该预润枪头将每个解剖出的脑逐一转移至含固定液的离心管中，随后继续下一轮解剖。所有脑转移完毕后，将离心管轻柔颠倒5次，并水平放置于冰上固定30分钟。随后在室温（RT）条件下震荡孵育1小时。
   6. 静置1分钟使脑沉降至管底。用含1× PBS和0.1% Triton X-100的洗涤液（PBST）震荡洗涤3次，每次10分钟。之后可将脑保存于含0.1%叠氮化钠的PBS中，4 °C保存，或直接进行免疫染色。
4. 免疫染色
   1. 将脑组织置于300 µL一抗染色液中，染色液成分为1× PBS、0.1% Triton X-100、5%正常山羊血清、0.1%叠氮化钠及兔抗TH抗体（1:500稀释），4 °C震荡孵育2天。随后用PBST洗涤3次，每次10分钟。
   2. 将脑组织置于含二抗的染色液中，染色液成分为1× PBS、0.1% Triton X-100、5%正常山羊血清、0.1%叠氮化钠及抗兔Alexa Fluor 635抗体，4 °C震荡孵育2天。随后用PBST洗涤1次。
   3. 在含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:1,000稀释）的PBST中室温孵育2小时，随后在PBST中洗涤2小时。染色后的脑可于4 °C过夜保存，或直接进行封片。
5. 封片
   1. 将0.5 mL封片剂装入配有细针头的1 mL注射器中。在载玻片上平行粘贴两条透明胶带，形成宽度为3 mm的间隙，作为封片腔（图1A、D）。
      注意：针头尖锐，存在刺伤风险。操作时务必小心；必要时使用单手“铲盖法”回套针帽；使用后的针头应立即丢弃至经批准的锐器盒中。
   2. 使用截短的P200枪头将脑转移至洁净的培养皿中。吸除脑周围多余液体，加入10 µL封片剂，轻柔混匀。
   3. 沿载玻片间隙滴加三滴封片剂，并均匀铺展。使用P10移液枪将脑转移并排列于间隙中央线上（图1A）。
   4. 将脑沿间隙中线均匀排列，前侧朝上。缓慢覆盖盖玻片。用拇指在盖玻片边缘轻压3秒，确保其牢固贴合。
   5. 将载玻片水平放入玻片盒中，避光室温固化过夜，随后转移至4 °C长期保存。
6. 共聚焦成像
   1. 开启共聚焦显微镜系统，等待15分钟以使激光稳定。使用10×物镜在明场下定位脑组织，随后切换至100×油镜，并在实时成像模式下定位PAM神经元簇。
   2. 调节载物台XY位置，使一个PAM神经元簇位于成像中心。通过Z轴预览确认其边界与方向。调节数字缩放倍数与方向，使PAM神经元簇沿对角线方向完整填充成像视野。
   3. 设定Z轴堆栈的顶部与底部位置。Z步长设为0.34 µm，图像分辨率为512 × 512。针孔设为自动模式。显示查找表（LUT）设为饱和指示器。
   4. 调节TH通道的激光功率与探测器增益，直至PAM神经元内最小量的弥散性点状信号达到饱和。调节DAPI通道参数，获得明亮清晰的细胞核信号，但不发生饱和。
      注意：最佳缩放倍数因样本而异。不同实验批次之间，以及同一批次内不同脑样本之间，可能因组织收缩程度不同而存在差异。
   5. 以12位或16位原始格式采集并保存图像至输入文件夹（例如 D:\Confocal\images）。返回实时成像模式，重置缩放倍数，沿间隙移动寻找下一个脑样本，无需切换至低倍物镜。
      注意：此阶段不得保存、导出或转换原始数据文件为已处理的.tif格式。保留原始的未处理元数据对于后续图像处理至关重要。

2. 图像处理与定量分析

1. 图像文件转换与TH通道拆分
   1. 将输入文件夹中的原始图像使用相关文件转换器转换为与3D图像分析软件兼容的格式材料表）。将转换后的文件放入 已转换文件夹 （例如，D:\Confocal\converted）
   2. 打开 Fiji 并导航至 文件 | 新建 | 脚本在脚本编辑器中，单击 文件 | 打开 加载宏文件 ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm补充文件 1）。点击 运行 位于编辑器窗口底部附近（如果该按钮被隐藏，请点击小三角形图标以显示）。
   3. 在配置对话框中，单击 浏览 并选择已转换的文件夹。在 命名规范，选择选项 3. 在……之下 导出通道，选择对应于TH的通道索引。点击 好的 对TH通道进行批量分割；导出的TH图像序列将自动保存在一个以 通道分离输出.
2. 训练 Labkit 分类器
   1. 训练数据集的制备
      1. 选择20组具有代表性的图像序列，以涵盖样本信号强度和背景变化的范围 TH 叠层文件夹. 将选定的文件复制到 选择文件夹 （例如，D:\Confocal\selection）
      2. 运行 Fiji 宏 ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (补充文件 2）。当系统提示时，选择包含训练图像的文件夹。该宏将每个图像栈裁剪为相同数量的Z层切片，并将这些图像栈拼接成一个用于训练的延时TIFF文件。
   2. 交互式像素分类器训练
      1. 通过 Fiji 启动 Labkit 插件 | Labkit | 使用 Labkit 打开当前图像 (材料表）。在工具栏中，单击 3D 盒子 切换按钮 切片视图 用于在Z层切片间（右侧滑块）和样本间（底部滑块）导航的模式。
      2. 按压 S 打开 亮度与对比度 面板并调节 Max 用于 TH 最佳可视化的滑块⁺ 神经元。设定一个合适的 画笔尺寸 （例如，5 像素）。点击 设置 展开工具面板。保持默认设置 显示模式 （融合，源，最近邻）
      3. 点击 绘制. 在 标记面板，突出显示 背景 并在一些非细胞区域进行绘制；突出显示 前景 并在几个TH的内壁上涂抹⁺ 神经元
      4. 放大和缩小观察视野 Ctrl + Shift + 滚动使用垂直滑块导航至其他Z平面，使用底部滑块导航至其他训练样本。重复绘制多次，以确保分类器训练的稳健性。
      5. 点击 像素分类. 单击 开始培训 三角形以启动训练和惰性预测，随后在浏览样本、切片或位置（右键单击并拖动）时，可实时提供分割反馈。
      6. 点击 绘制 在预测不准确处添加校正标注，并可选择性切换预测结果与标签的可见性 来源面板 并重新训练。重复此过程，直至分类器能够可靠地区分 TH⁺ 通过背景分离神经元，然后保存分类器 分割 | 保存分类器 在关闭 Labkit 之前。
3. 批量 Labkit 分割
   1. 打开一张随机图像 TH 叠层文件夹 在 Fiji 中。启动 Labkit 并点击 移除全部，然后通过加载预训练的分类器 分割 | 开放式分类器 对图像进行分割。通过视觉检查质量以验证分类器的泛化能力，然后关闭窗口。
   2. 在其他几张随机图像上重复步骤 2.3.1。每次检查后关闭窗口，最后一次除外。
   3. 创建一个 实验套件输出文件夹 （例如，D:\Confocal\LabkitOut）。通过以下方式启动批量处理： 其他 > 批量分割图像设置 输入主管y 到 TH 叠层文件夹 并设置 输出目录 到 实验套件输出文件夹，然后单击 好的 开始批量处理。
   4. 对于将来使用相同 TH 抗体和类似共聚焦设置的实验，可跳过 2.2 步骤并重复使用先前的分类器。
      注意：我们还提供了一个预训练分类器以供测试使用 (补充文件 3).
4. DAPI 斑点形成与 TH⁺ 神经元定量
   1. 放置 XT_Jove_Labkit_TH.m (补充文件 4）在 a 中 脚本文件夹 （例如 D:\scripts）。打开 3D 软件并导航至 文件 | 首选项，然后选择 定制工具. 在 扩展文件夹 面板，单击 添加… 选择 脚本文件夹 并点击 好的.
   2. 对于每个转换后的文件，脚本将自动执行以下顺序操作。
      ​注意：本说明部分不包含用户需执行的操作，但对进入下一步骤至关重要。
      1. DAPI 通道的处理通过以下步骤进行 背景扣除 和 高斯滤波器 以促进优化的 DAPI 斑点识别。
      2. 通过去噪和填补孔洞对Labkit分割掩膜进行优化，并作为掩膜通道附加到数据集中。根据该掩膜通道构建优化的TH表面对象。该TH表面对象进一步生成优化后的掩膜，用于覆盖原有的掩膜通道。
      3. 从TH表面生成一个距离变换通道，其中表面内部的体素设为0，表面外部的体素则赋予浮点数值，表示其到最近TH表面的欧几里得距离。
      4. 使用距离变换通道中每个DAPI斑点的强度轮廓作为TH的度量指标⁺ 神经元鉴定。位于酪氨酸羟化酶（TH）内或附近的DAPI斑点⁺ 区域具有较低的距离值。该标准有助于挽救假阴性结果，例如位于不完整Labkit预测前景区域之外但紧邻其边缘的真实DA神经元细胞核。
   3. 手动优化 质量 用于DAPI斑点生成
      1. 打开一个随机样本 已转换文件夹 在3D软件中。导航至 编辑 | 图像属性 并验证是否 体素大小 Z 在 坐标面板 是 0.340 µm若不是，则手动将其更改为 0.340 µm。
      2. 对DAPI通道执行背景减除操作，方法是单击 图像处理 | 阈值分割 | 背景扣除在对话框中，仅勾选 DAPI 通道，设置 滤波器宽度 到 3，然后单击 好的再重复此步骤一次，然后进行第三次重复，但使用 滤光片带宽 的 1.
      3. 点击应用高斯平滑 图像处理 | 平滑 | 高斯滤波器. 仅勾选 DAPI 通道， 设置 滤光片宽度 至 0.2，然后单击 好的.
      4. 在 超越场景， 点击 添加新斑点 启动 斑点生成向导. 选择 DAPI 通道 并输入一个 估计的 XY 直径 的 1.2 µm按照向导，添加一个 "质量至上" 过滤并微调阈值，直至每个细胞核均能稳定地生成一个准确的单一点。
      5. 在多个随机选择的样本中重复步骤 2.4.3.1–2.4.3.4，并确定在各样本间稳定可靠的阈值。
   4. 打开脚本 XT_Jove_Labkit_TH.m（补充文件 4在文本编辑器中修改以下用户定义的参数。
      1. 设置 ims_文件夹 到路径的 已转换文件夹；设置 实验套件输出文件夹 到路径的 实验套件输出文件夹设置 Ch_DAPI 所有文件中DAPI通道的索引 已转换文件夹 （例如，如果DAPI是第一通道，则为1；如果DAPI是第二通道，则为2）。
      2. 设置 reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. 如果体素大小正确 图像属性 （参见步骤 2.4.3.1），将答案保留为空括号 []。否则，手动输入适当的值（例如，0.130、0.130、0.340，分别），这些值将应用于所有文件 已转换文件夹.
   5. 完成斑点生成参数的设置。
      1. 自定义多个参数版本 在 SpotsParameterAss 细胞阵列，其中每一行指定一个版本。这包括定义 估计的 XY 直径 （µm）用于每行左侧部分的DAPI斑点检测，并定义 过滤字符串 由每行右侧的标准筛选条件组成，包含 质量阈值（s） 来自步骤 2.4.3.4 和/或对步骤 2.4.2.2 中优化后的掩膜通道或步骤 2.4.2.3 中的距离变换通道进行强度阈值分割。
      2. 设置 "强度中心 Ch=aSizeC+1" 高于 0.5 仅保留几何中心位于2.4.2.2步骤所得优化后的TH掩膜通道内的斑点（体素值 > 0.5）。这是用于TH的最直接且最严格的判据⁺ DAPI 斑点过滤
      3. 设置 “强度均值 Ch=aSizeC+2” 低于 [阈值] 保留距离变换通道（步骤 2.4.2.3）中平均强度低于指定阈值的斑点。较低的阈值可选择位于 TH 表面内部或极接近表面的斑点；较高的阈值则逐步包含距离更远的斑点。这允许对 TH 可接受接近程度进行经验校准。⁺ 分配
      4. 预设示例：
         SpotsParameterAss = {
         1.2，["质量"" 高于 94.5"强度中心 Ch = aSizeC + 1" 高于 0.5
         1.2，["质量" 高于 94.5"平均强度 Ch=aSizeC+2" 低于 0.0001
         1.2，["质量" 高于 94.5"平均强度 Ch=aSizeC+2" 低于 0.001
         1.2，["质量" 高于 94.5"平均强度 Ch=aSizeC+2" 低于 0.01
         ... 更多滤光片组合在脚本中提供。
         };
      5. 在将来使用相同TH抗体和共聚焦设置的实验中，重复利用先前的参数组合。删除那些导致斑点计数与实际数量显著偏离的不良组合，以减少不必要的计算负担。
   6. 批量点样制备
      1. 将上述所有修改保存到脚本 XT_Jove_Labkit_TH.m 中。打开一个新的 3D 软件窗口。点击菜单 图像处理 | PAM_TH_processing 以批处理方式执行脚本。
      2. 最初，观察几分钟，对于每种滤光片组合，脚本会创建一个斑点对象（Spots object），其命名反映相应的参数，并且来自文件的 已转换文件夹 被处理并作为副本保存到一个带有后缀的新输出文件夹中 "已处理"然后让计算机无人看管。
      3. 完成后将生成一个电子表格。观察第一列包含的文件名，以及后续各列包含的对应于每种滤光片组合的DAPI斑点计数，列标题标明了相应的滤光片组合 估计的XY直径 和 过滤字符串 使用。
   7. 后处理验证
      1. 步骤 2.4.6 完成后，手动打开几个随机文件进行检查 "已处理" 文件夹中查看与原始TH通道叠加的不同Spots对象。通过目视检查，选择一个或两个能够最真实地反映实际TH的最优滤镜。⁺ 神经元计数。将相应的列从电子表格导出，用于后续的统计分析和图表制作。
      2. 为纠正优选滤光片组合中的斑点计数错误，请在Surpass场景中选择相应的Spots对象，然后点击 编辑 手动删除错误的斑点或根据需要添加遗漏的斑点 移位 并点击屏幕。使用以下方式保存更新 存储为/导出为/另存为 覆盖目标位置的同名文件 "已处理" 与文件同名的文件夹。
         注意：请勿删除、添加、重命名或拖动/重新定位任何“Spots”对象，仅编辑偏好的 Spots。无需对脚本进行任何修改，只需重新运行脚本，即可立即生成反映手动修正结果的更新版电子表格。为保持一致性，应统一处理实验中所有样本：要么全部不编辑，要么全部编辑偏好的 Spots 对象。

结果

从软件收集的原始数据已存入公共存储库，可通过以下 DOI 获取：10.5281/zenodo.19814348。为展示该半自动化定量分析流程的应用，我们将其应用于一个成熟的 果蝇 利用人源α-突触核蛋白的泛神经元表达构建帕金森病模型 (nSyb-QF2>QUAS-SNCA）。对照组果蝇携带 nSyb-QF2 仅表达驱动基因。两种基因型均在29 °C下培养3周，随后解剖脑组织，进行TH免疫染色，并对PAM簇进行成像。如图所示 图3E，半自动化流程检测到表达α-突触核蛋白的果蝇相较于对照组PAM TH⁺神经元数量显著减少（Student’s t检验，p < 0.0001），表明该方法能够在同一实验批次内捕捉到基因型依赖性的差异。以下部分将描述安装配置（图1），Labkit训练界面（图2），以及图像处理步骤（图3) 以实现此定量分析。

图1展示了分离的黑腹果蝇（Drosophila）脑组织的装片构型及其对PAM神经元簇成像的影响。解剖后，脑组织有时会出现与切断的腹神经索相邻区域弯曲或向上翘起的现象。脑腹侧部分的这种抬升会改变体视显微镜下的观察视角，导致背侧轮廓中典型的沟槽投影发生改变，并影响腹侧解剖标志的相对视角（图1B、C）。此类形变通常在脑组织从身体分离的瞬间发生。这种形变会影响装片过程中PAM神经元簇的取向，从而影响所需的Z轴层厚扫描深度（图1C、D）。在最佳装片条件下，单层透明胶带间隔物可对脑中央区域施加适当的压力，使位于背侧的PAM神经元簇紧贴盖玻片并呈水平方向排列。该构型可在0.34 µm间距下获得15–25层的Z轴扫描图像（图1D）。而在另一种情况下，PAM神经元簇保持倾斜状态，需要进行更深的Z轴扫描（图1D）。同样，使用双层胶带间隔物无法提供足够的压力，导致PAM神经元簇保持其天然的倾斜构象，从而同样增加Z轴扫描深度（图1D）。图1E展示了在理想定位与倾斜状态下，TH染色Z轴扫描图像的代表性侧向投影图。

图2展示了Labkit的用户界面以及一个典型的训练工作流程。仅对单个样本进行少量稀疏的涂鸦式标注（图2A），初始像素分类器已能产生相当合理的分割结果（图2B）。然而，必须强调的是，此类极简标注不足以在整个数据集上实现稳健且可推广的性能。要生成能够在完整数据集中可靠分割TH⁺神经元的分类器，需要在多个Z层面、多个样本以及不同染色条件下进行大量迭代标注。值得注意的是，多个训练图像沿时间（帧）维度拼接，而非沿Z轴堆叠。这种设计保留了每个独立脑组织体积的空间完整性，确保三维滤波核仅在单个生物样本内部——而非跨样本之间——进行运算。如果将样本垂直堆叠成一个单一的厚Z栈，则相邻样本之间的边界Z层面在空间上会连续，导致来自不同大脑的体素被视为邻近结构，从而增加不必要的手动校正风险（图2C）。沿时间轴拼接可避免此类跨样本污染，同时仍支持在单次Labkit会话中高效地对多个样本进行训练。

图3展示了后处理流程及最终的定量结果。原始的Labkit分割掩膜（图3A）包含大量微小的假阳性斑点和内部孔洞。在应用形态学去噪和填补孔洞操作后（图3B），构建出平滑的TH表面，并用于生成优化后的二值掩膜（图3C）。该优化效果通过初始掩膜与最终掩膜的叠加对比可视化呈现（图3D，上图）。值得注意的是，某些富含TH的神经突区域偶尔会被保留在最终掩膜中；然而，这些区域几乎始终缺乏DAPI染色的细胞核，因此对最终神经元计数的贡献可忽略不计。高级用户可进一步调整所提供批量处理脚本中的形态学参数，以精细优化此类残余伪影的去除。 图3D（下图）显示了最终的DAPI信号点（品红色）叠加在TH通道（绿色）上的最大强度投影图像。图3D还揭示了本流程中偶尔出现的一种罕见假阳性：当神经突信号与细胞核强烈重叠时，位于富含TH神经突区域内的DAPI染色细胞核可能被错误分类为TH⁺信号点。然而，如图3C所示，神经突附近的DAPI阳性细胞核通常非常稀疏。此外，存在于此类神经突区域附近的少数DAPI信号通常仍能被正确归类为真阴性（即不被计为TH⁺），因为流程本身并未将其误判。图3E 展示了该方法的实际应用价值：在多种滤波条件下，3周龄的nSyb-QF2>SNCA果蝇相较于nSyb-QF2 对照组，PAM TH⁺神经元数量显著减少（Student's t-检验，p < 0.0001）。尽管不同滤波组合下的绝对信号点计数可能存在差异，且该方法尚未达到完美的单一点检测精度，但实验组与对照组之间的相对差异仍保持稳健。对于同一实验批次中测试的多种滤波条件，组间比较的统计结果在各滤波条件下基本一致。因此，结果应被解读为同一批次内的相对比较读数，而非PAM神经元的无误差绝对计数。

图1. 果蝇 脑解剖与安装配置 (A) 大脑固定装置的示意图。黄色条带代表透明胶带制成的间隔垫片。放大的大脑示意图显示了PAM神经元簇（紫色）的大致位置。 (B) 与虚线平面相对应的侧向横截面示意图 A 显示解剖后两种常见的脑形态：位置理想（上）和倾斜（下）。(C在体视显微镜下观察的两个解剖后的果蝇大脑：位置理想（左）与倾斜（右）。黄色箭头指示背侧轮廓上典型的沟槽。蓝色虚线连接腹侧半部左右两侧对应的解剖标志点。蓝色箭头突出显示这些腹侧标志点相对视角产生的偏移。比例尺 = 500 µm。 (D示意图展示大脑形态及胶带垫片厚度（单层与双层）如何影响PAM簇的垂直定位，进而影响所需的Z轴扫描深度。 (E) 酪氨酸羟化酶（TH）染色共聚焦Z轴扫描图像的代表性侧视图（Y投影），分别来自位置最佳（上）和变形（下）的封片条件。比例尺 = 5 µm。缩写：PAM = 原脑前内侧区。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2实验室工具包培训与交互式分割 (A) Labkit 图形用户界面。标注（涂鸦）显示为两类：前景（红色）和背景（蓝色）。 (B) 基于所示涂鸦进行训练后立即生成的分割结果 A红色表示前景色；蓝色表示背景色。比例尺 = 5 µm。 (C相邻Z层间的串扰。将来自不同果蝇大脑的荧光蛋白标记线粒体的单层图像沿Z轴拼接。第1层和第3层为同一图像的完全相同副本，而第2层和第4层来自不同的果蝇大脑。黄色箭头：第2层对第1层的预测信号渗漏；绿色箭头：第4层对第3层的预测信号渗漏。比例尺 = 3 µm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 3．Labkit 分割掩膜的后处理及 TH⁺ 神经元定量。（A）原始 Labkit 二值掩膜（青色，上方）及其与原始 TH 通道的叠加（下方）。注意存在大量小斑点且神经元胞体填充不完整。 （B）经形态学去噪和填补空洞后的掩膜（品红色，上方）；与 TH 通道叠加（下方）。 （C）基于 B 图中平滑后的 TH 表面进行再掩膜处理得到的优化二值掩膜（红色，上方）；与 TH 通道叠加（下方）。 （D）上方：原始（青色）与优化后（红色）掩膜的叠加，突出显示后处理所修正的区域。下方：最大强度投影图，显示最终的 DAPI 斑点（品红色）叠加在 TH 通道（绿色）上。注意右上角的两个斑点来源于对侧 PAM 簇。本图使用滤波器 4 进行演示。 （E）在帕金森病模型中使用多种滤波组合进行的定量验证。三周龄的 nSyb-QF2>SNCA（PD 模型）果蝇在多种滤波条件下均表现出 PAM 区 TH⁺ 神经元数量显著低于 nSyb-QF2 对照组（上图）。原始数据见电子表格（下图）。滤波器 1：1.2，['"质量"高于 94.5，"通道 aSizeC+2 的平均强度"低于 0.0001']；滤波器 2：1.2，['"质量"高于 94.5，"通道 aSizeC+2 的平均强度"低于 0.001']；滤波器 3：1.2，['"质量"高于 94.5，"通道 aSizeC+2 的平均强度"低于 0.01']；滤波器 4：1.2，['"质量"高于 94.5，"通道 aSizeC+2 的平均强度"低于 0.05']；滤波器 5：0.6，['"质量"高于 94.5，"通道 aSizeC+2 的平均强度"低于 0.001']；滤波器 6：0.6，['"质量"高于 94.5，"通道 aSizeC+2 的平均强度"低于 0.01']；滤波器 7：0.9，['"质量"高于 94.5，"通道 aSizeC+2 的平均强度"低于 0.01']；n = 57 个脑（对照组），n = 65 个脑（PD 组）；Student's t-检验，p < 0.0001（****）。果蝇在 29 °C 下培养。比例尺 = 5 µm（A–D）。数据以均值 ± 标准差表示。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件 1. 用于从转换后的图像文件中分离 TH 通道并保存输出堆栈的 Fiji 宏。请点击此处下载该文件。

补充文件 2. 用于将训练用 Z 层堆栈裁剪至相同的 Z 层深度，并将其合并为延时 TIFF 文件以用于 Labkit 分类器训练的 Fiji 宏。请点击此处下载该文件。

补充文件 3。用于测试 PAM TH 分割流程的预训练 Labkit 分类器。请点击此处下载该文件。

补充文件 4：用于批量处理 Labkit 掩膜、生成 DAPI 斑点、应用滤镜组合以及导出 TH⁺ 神经元计数的 MATLAB 脚本。请点击此处下载该文件。

讨论

对果蝇（Drosophila）PAM 神经元簇中多巴胺能（DA）神经元进行定量分析，长期以来一直是一项艰巨的挑战。本文介绍了一种半自动化的分析流程，该流程将基于机器学习的像素分类方法与图像分析软件相结合，以解决这一长期存在的难题。该方法能够在同一实验的不同组别之间，实现对 PAM 簇中 TH⁺ 神经元变化的批量水平检测，从而支持帕金森病模型中的比较研究¹⁸。

在为特定实验选择最佳滤镜时，用户可依据对原始图像的目视检查结果来选择最合适的滤镜，也可参考文献中报道的野生型PAM神经元数量的范围和/或平均值^12,13。然而需谨慎对待：目前仅有两项研究报道了PAM神经元簇的数量，且均不涉及帕金森病（PD）相关研究，报道的数值存在较大差异。此外，标准差可能随年龄增长而增大，进一步增加了跨研究比较的复杂性。因此，基于文献的参考值仅可作为粗略指导，不应视为绝对标准。我们承认，该分析流程无法获得完全无误差的绝对计数结果（图3D）。然而，只要比较局限于同一实验批次内的组别（即不在同一图表中合并不同批次的数据），该方法仍可用于检测同一批次内不同基因型或处理条件之间的相对差异。

根据我们的经验，应避免使用AF488偶联的二抗，因其背景信号较高；同时应避免使用AF546，因其在Z轴方向上的信号衰减更显著。我们还发现，充分的DAPI孵育和洗涤对于获得高信噪比和清晰的细胞核信号至关重要，这直接影响自动分割的性能。在此应用中，DAPI优于Hoechst，因其对异染色质具有优先染色特性，可产生更明亮且边界更清晰的细胞核信号点，有助于实现更准确的检测。

常见故障模式的故障排除讨论

染色相关失败。解剖技术是决定数据质量的主要因素。PAM 簇位于浅表，当移除位于该区域背侧的两个气管囊和脂肪体时，很容易受到损伤。应小心操作镊子，避免刺破或挤压 PAM 区域。在切断腹神经索的瞬间，常会发生腹侧变形，导致脑组织置于玻片上时发生倾斜或卷曲；这种变形在经 PFA 孵育后可能被永久固定。使用者应在切断过程中尝试不同的镊子角度，以找到最佳操作技术。如果解剖后观察到倾斜现象，可对抬高的区域施加轻柔压力以逆转变形（前提是受压区域并非感兴趣区域，则此操作可接受）。

分割失败。分割效果不佳通常是由于训练数据的多样性不足所致。Labkit 分类器必须在一批图像中具有代表性的样本集上进行训练，这些样本应涵盖该批次内染色质量的完整范围，包括最佳、一般和最差的染色情况。在迭代校正过程中，应优先标注那些您确信无误的假阳性与假阴性区域。避免校正模糊或不确定的区域，因为这可能会误导分类器，导致性能下降。

斑点检测失败。参数优化需要在少量具有代表性的样本子集上进行系统性探索。测试不同的估计斑点直径和质量过滤阈值，或尝试其他类型的过滤方法。 "质量至上" 本方案中使用的滤波器。斑点创建向导提供多种过滤选项（例如，强度）。建议用户根据自身特定数据集调整滤波阈值和类型，并在批量处理前进行经验性优化。

为何对PAM簇神经元的手动计数仍然异常困难？PAM簇具有独特的解剖结构和染色特性，使得传统的手动计数方法难以适用。首先，酪氨酸羟化酶（TH）免疫荧光在细胞质中的分布 果蝇 多巴胺能神经元主要标记出围绕着一个大而不着色的核区域的细薄胞质环。因此，经DAPI染色的细胞核与TH⁺ 细胞质区室表现出极小的空间重叠。这种基本的不共定位现象排除了直接的 "TH 掩模内的 DAPI 斑点" 分类策略。其次，PAM 簇包含超过 100 个密集排列的神经元，呈三维葡萄状结构。当通过共聚焦 Z 层切片进行观察时，神经元逐渐显现和消失——一些进入视野平面，另一些则移出平面——导致认知负荷较高，并产生显著的观察者间差异。最近一项对 PAM 多巴胺能神经元进行定量的研究依赖于使用 ImageJ 的细胞计数插件进行手动计数。尽管这种方法完全适用于 PPM1/2 或 PPL1 等较小的神经元簇，但在应用于 PAM 簇时变得极为耗时，尤其是在需要处理数十或数百个样本的研究中。

为什么 Labkit 的随机森林架构特别适用于 TH 神经元的分割？Labkit 实现了一种基于随机森林的像素分类器，能够极好地应对 TH 染色 PAM 簇图像所特有的挑战。该算法通过对每个像素应用一系列变换滤波器（包括高斯模糊、高斯差分、高斯梯度幅值、高斯拉普拉斯以及黑森特征值），并以多个 sigma 尺度（1、2、4、8）进行计算，从而生成全面的特征向量。这种多尺度特征提取方法能有效捕捉区分细胞核内部与细胞外背景的纹理和边缘特征。尤为重要的是，由于随机森林所需的训练数据量比深度学习方法少几个数量级，用户仅需在 20 至 40 张代表性图像上进行稀疏的手绘标注，即可迭代优化分类器。每次迭代都会向集成模型中添加新的决策树，所有决策树共同投票以完成每个像素的分类。该过程天然能够适应染色和成像条件在不同批次间的变异——这一优势在涉及果蝇（Drosophila）遗传杂交和衰老研究等具有固有生物学变异性的实验中尤为关键。利用该方法，可在表达 α-突触核蛋白的帕金森病模型中检测到 TH⁺ 神经元的丢失，并可在同一实验批次内比较遗传增强子和抑制因子对 PAM 簇神经元数量的影响。

重要的是，在训练过程中，裁剪后的图像堆栈是沿时间维度进行拼接，而不是沿Z轴堆叠。这一设计选择对于分类器的最优训练至关重要。Labkit的3D像素分类依赖于连续Z切片之间的体素信息，这对于准确解析定义PAM神经元形态的细长胞质TH环结构尤为关键。如果将各个样本垂直堆叠成一个超厚的Z堆栈，则相邻样本之间的边界Z切片在堆栈中会形成空间上的连续性。结果，属于不同生物样本的体素将被视为同一三维体积内的邻近结构。在交互式训练过程中，靠近此类边界的涂鸦标记可能会同时意外捕获来自两个不同样本的特征，从而混淆分类器（图2B，箭头）。此外，源自一个样本的假阳性信号可能投射到相邻样本的体积中，导致产生错误的校正涂鸦标记，这些错误会在后续训练迭代中持续传播，生成编码了无生物学意义规则的决策树。将样本沿时间轴进行拼接可保持每个独立体积的空间完整性，使得3D滤波核仅在单个生物样本内部（而非跨样本）进行操作，同时仍可在单次Labkit会话中实现高效、多样本的训练。

方法学考量与局限性

有几个重要的注意事项值得讨论。首先，本方案专门针对PAM神经元簇进行优化，可能不适用于其他多巴胺能（DA）神经元簇（例如PPM1/2/3、PPL1）或视叶中的TH⁺神经元。PAM区域的优势在于DAPI密度相对稀疏，细胞核在三维空间中分布清晰、彼此分离，有利于实现稳定且无歧义的DAPI荧光点检测。相比之下，该工作流程难以直接应用于PPL1或PPM1/2等其他DA神经元簇区域。在这些区域中，神经纤维更可能与非DA细胞的DAPI染色细胞核相邻或重叠。鉴于这些小神经元簇中DA神经元的基础数量极低（通常每个簇少于10个细胞），即使出现少量误分类，也可能导致相对较大的误差，从而使该方法在这些应用场景下的可靠性降低。其次，TH免疫染色还会标记神经 Neuropil 中的神经纤维和轴突投射。尽管在训练过程中已进行校正性标注，这些纤维束仍偶尔会产生较强的TH信号，并可能被分类器误判为前景信号。然而，PAM神经元簇区域几乎从不含有DAPI染色的细胞核；因此，在富含神经纤维的PAM区域中，假阳性体素对最终神经元计数的贡献极小。第三，Labkit的像素分类依赖于有限邻域内的局部纹理特征（默认滤波核响应约16 × 16像素的窗口）。这种设计确保了计算效率，并支持实时交互式分割，但也意味着分类器无法利用全局解剖结构信息。因此，对于明显偏离训练数据集的罕见伪影或染色不均现象，可能需要逐案进行人工校正。最后，本文所述的批量处理流程——整合Labkit分割、DAPI荧光点检测与距离变换——会生成多个输出通道及滤波组合。用户应系统性地验证其特定实验条件下最优的滤波参数，而不应不加判断地直接采用本方案中提供的默认阈值。

未来应用

除了本文展示的PD模型外，该半自动化流程可直接应用于任何 果蝇 涉及PAM簇DA神经元定量的模型，包括学习与记忆、动机、睡眠调节以及年龄相关性神经退行性变的研究。具体而言，该方法的批量处理能力可能适用于以下场景：（1）中高通量药物筛选：在多个剂量下测试多种神经保护化合物时，无需相应增加人工计数工作量，可行性更高；（2）遗传修饰因子筛选：对数百个遗传杂交品系（如RNAi品系、过表达品系）中的PAM神经元数量进行定量，以鉴定α-突触核蛋白毒性的增强子或抑制子；（3）纵向衰老研究：在多个时间点追踪PAM神经元的丢失情况，同时减轻人工计数负担。此外，基于Labkit的分割工作流程不仅限于TH染色；通过适当的重新训练，还可适用于定量其他神经元群体 果蝇 大脑，只要它们与PAM簇具有两个关键特征：DAPI染色细胞核密度相对较低，以及神经突染色干扰极小。除了Labkit和本文所用的3D软件外，该流程的整体逻辑——基于机器学习的像素分类，随后进行斑点检测和距离变换——可在其他支持的3D图像分析平台中实现，从而提高其对更广泛研究群体的可及性与灵活性。

综上所述，我们提出了一种半自动化的流程，用于检测PAM神经簇中TH⁺神经元数量的组间差异。该方法结合基于Labkit的像素分类、斑点检测和距离变换技术，能够在同一批次内比较实验组与对照组的TH⁺神经元数量，同时随着样本量增加显著减轻人工计数负担。当样本量从数十个扩展至数百个时，计算时间呈比例增加，但额外的人工工作主要局限于文件整理和质量抽查。尽管迄今为止PAM神经簇在帕金森病（PD）研究中受到的关注较少，但这主要是由于技术限制，而非其生物学意义不足。通过提供一种实用的定量工具，本实验方案未来将有助于探究PAM神经元是否以及如何在PD模型中发生退变，并进一步分析其在非运动症状（如嗅觉障碍和动机减退）中的潜在作用。我们预期该方案将促进在果蝇（Drosophila）模型系统中开展多巴胺能神经退行性变、突触可塑性以及神经保护药物筛选等方面的批次级比较研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三维图像处理软件 - Bitplane Imaris 8.0+	Oxford Instruments	http://www.bitplane.com/	本研究中使用的三维图像分析软件
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Thermo Fisher Scientific	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	Bloomington Drosophila Stock Center	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Bloomington Drosophila Stock Center	600605
DOWSIL SYLGARD 184	Tat Lee Engineering Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
杜蒙特镊子 Styple 3C Dumoxel，0.04/0.08 mm	Electron Microscopy Sciences	72680-D(0203-3C-PO)
FV3000 共聚焦显微镜	Olympus	https://www.olympus-global.com/
山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244
ImageJ/Fiji（1.53q）	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
微型销针，不锈钢，直径 0.15 mm	Austerlitz	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
正常山羊血清，冻干粉	Sigma-Aldrich	566380
数值计算软件 - Python	Python	3.8+
数值计算软件 - Matlab	Mathwork	R2016a+	本研究中使用的数值计算软件
辛基酚聚氧乙烯醚（Triton X-100）	Bio-rad	1610407
4% 多聚甲醛 PBS 溶液	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
聚苯乙烯细胞培养皿	Nest Scientific	706001
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36934
兔抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体	Pel Freeze	P40101-0
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
体视显微镜	Olympus	SZ51
Sterican 一次性针头ülen 27 G 灰色 0.40 x 12 mm	Sterican	D-34209
注射器，1 mL	Terumo	DVR-5175
透明胶带	3M Scotch 600，透明	600