利用共振拉曼光谱实时无创评估线粒体功能

摘要

我们提出了一种利用共振拉曼光谱法（RRS）无创、实时监测线粒体健康状况的方法。我们采用RRS定量分析线粒体的氧化还原状态，并建立了一种评估线粒体健康的指标——共振拉曼还原线粒体比率（3RMR），该指标对氧合状态变化的响应速度优于传统的血气分析物。

摘要

尽管线粒体在疾病发生和发展中起着核心作用，但关于线粒体健康动态的机制性研究仍然成本高昂且难以获取。为弥补这一空白，本研究采用共振拉曼光谱法（RRS）评估线粒体功能，使用一种便携式系统，可对大鼠肝脏中的线粒体细胞色素氧化还原状态进行实时、无创且定量的测量。在本实验方案中，我们展示了该技术的应用，包括系统设置、数据采集和数据处理。本研究提供了一项概念验证实验，突显了RRS在测量线粒体氧化还原状态实时变化方面的能力，进而反映线粒体功能。简言之，将RRS设备连接至激光泵和数据采集计算机，并置于距离大鼠肝脏1 cm的位置。  根据大鼠肝脏实验方案设定采集参数；通过氧气应激测试，在富氧和缺血条件下测量氧化还原状态，并在整个氧气应激测试过程中追踪线粒体氧化还原状态的变化。

引言

线粒体在细胞功能和稳态中发挥关键作用。线粒体是细胞代谢的主要驱动者，通过氧化磷酸化调控ATP的生成。它们还作为信号细胞器，通过调节凋亡通路以及活性氧（ROS）和Ca⁺²信号传导来决定细胞命运¹。因此，线粒体功能障碍可导致多种神经退行性疾病、肌肉疾病和心血管疾病^2,3。尽管线粒体在疾病进展中具有关键作用，但评估线粒体功能的方法往往具有侵入性、成本高昂且存在局限性。

线粒体功能的关键指标，例如耗氧率、氧化磷酸化以及电子传递链（ETC）中各复合物的活性，通常通过呼吸测定法进行测量。ETC由嵌入线粒体内膜（IMM）的四个复合物（I–IV）组成。这些复合物在其他辅酶的协助下，将电子从还原型底物（如NADH和FADH2）传递至最终的电子受体O₂。₂，随后被还原为水。目前大多数呼吸测定实验（如 Seahorse 和 Orobros O2k）均需要对组织进行处理，从而限制了其在转化研究中的应用^4,5. 测量线粒体膜电位（MMP）是评估线粒体功能障碍的另一种方法，该方法利用阳离子脂溶性荧光染料（如JC-1）结合显微成像技术，使耦合状态（健康）和非耦合状态（受损）的线粒体在不同波长下产生荧光⁶然而，这些检测方法的灵敏度可能较低⁵染料本身在高浓度下也可能具有高细胞毒性⁵最后，与呼吸测定法类似，该技术同样需要进行组织处理。近年来，基于光谱学的技术已被用作评估线粒体健康的非侵入性方法。例如，磷磁共振波谱法（P-MRS）通过测定含磷代谢物的浓度来评估细胞代谢，已被用于表征 undergoing 分化的工程化脂肪生成组织⁷然而，该技术也需要专门的设备和培训。

我们课题组近期展示了一种利用共振拉曼光谱法（Resonance Raman Spectroscopy, RRS）实时、无创且高度特异性地测量线粒体氧化还原状态以评估器官活力的技术。RRS 通过光子的非弹性散射来定量分析线粒体细胞色素的氧化还原状态。当以波长为 441 nm 的激光激发时，线粒体细胞色素、血红蛋白和肌红蛋白等分子中的血红素基团内的卟啉环会根据其氧化状态产生特征性的拉曼光谱⁸尽管RRS系统采用441 nm波长，但也可使用420 nm和405 nm波长的激光，每种波长优先增强不同的细胞色素复合物。将待测未知样品获得的光谱与预先记录的完全氧化或完全还原的完整线粒体光谱库进行比对，从而得到还原线粒体与总线粒体的比值，或线粒体的平均氧化还原状态 原位 电子传递链细胞色素。该比值定义为共振拉曼还原型线粒体比值（3RMR）。

3RMR 有 3 种不同的计算方式/类型：线粒体 3RMR（mito-3RMR）、复合物 III 3RMR（cIII-3RMR）和复合物 IV 3RMR（cIV-3RMR）。这些指数均通过特定组分的还原态数量与该组分总量的比值来计算。例如，cIII 的 3RMR 即为还原态 cIII 与组织中 cIII 总量的比值（cIII-R/(cIII-O + cIII-R)），cIV 的计算方式同理。因此，3RMR-cIII 表示还原态 cIII 与 cIII 总量的比值，3RMR-cIV 表示还原态 cIV 与 cIV 总量的比值。通过回归分析，可利用完整线粒体的光谱库计算线粒体氧化还原状态（mito-3RMR），或利用 cIII 和 cIV 的光谱库分别计算各个复合物的氧化还原状态（cIII-3RMR 和 cIV-3RMR）。最近一项研究⁹表明，mito-3RMR 可代表 cIII 和 cIV 氧化还原状态（即 cIII-3RMR 和 cIV-3RMR）的加权平均值。需要注意的是，复合物 I（cI）和复合物 II（cII）在 441 nm 波长下不具备拉曼活性或无法产生共振增强效应，因此在计算 mito-3RMR 时不予考虑。

利用这类3RMR，我们一直在界定3RMR的最佳范围。 "健康" 器官中，线粒体保持完整并具有充足的氧气供应。相反，受损器官可能存在氧气输送或利用不足，从而导致电子传递链复合物积累电子。电子积累会引起 "还原应激，" 将线粒体从氧化状态转变为还原状态，并提高3RMR值。多项研究^8,9,10,11,12 从啮齿类和猪模型的心脏和肝脏等器官的研究，已开始揭示最佳的 "健康" 3RMR 的建议范围为 10 至 30。例如，Perry 等人将哺乳动物心脏置于缺氧条件下，结果显示 30% 的 3RMR 能够在检测缺氧组织时提供最佳的敏感性与特异性平衡⁸这一趋势在心脏组织的其他研究中得到了进一步证实^11,12以及肝脏移植物¹⁰. 此外，Nyugen 等人⁹，证明在代谢已停止的组织中，3RMR值会降至极低（氧化态）水平， 3RMR 水平（7.667 ±± 4.926），而新鲜及可移植的温缺血肝脏的3RMR值则高于10（约12–15）⁹.

除了展示3RMR测量组织活力的方法之外，RRS的高灵敏度、高特异性和操作简便性使其在众多其他研究领域中具有广泛应用前景，特别是在涉及细胞代谢和线粒体功能变化的研究中。在先前的研究中，RRS已用于通过评估视神经乳头处视网膜神经节细胞无髓鞘轴突的代谢活性，来检测小鼠的黄斑变性和青光眼¹³此外，该技术还被用于检测先天性心脏病大鼠模型中的主动脉缩窄（CoA），这一诊断在新生儿心脏筛查中常常被遗漏。¹²该技术被用于理解器官移植领域相关各种实验条件下器官的功能与活力，包括评估器官活力的研究 离体 机器灌注^10,11评估静态冷保存后的再氧合¹⁴，或减轻温缺血肝脏的再灌注损伤⁹.

本文旨在确立共振拉曼光谱法（RRS）作为一种实时、灵敏的线粒体健康评估工具。采用大鼠模型的完整肝脏，通过施加不同程度的缺血与氧再灌注作为应激测试，以评估线粒体的响应。在此氧应激测试中，新鲜肝脏依次经历5分钟的初始灌注、5分钟的缺血以及5分钟的再灌注。在整个应激测试过程中，同步采集3RMR信号，并检测乳酸、K⁺及氧分压（pO₂）的变化。与传统的血气分析指标相比，3RMR对氧合状态变化的响应更为迅速。本研究不仅突显了RRS在机制研究中的应用价值，也展示了其作为诊断方法和治疗研究平台的潜力。因此，本研究所共享的实验方案可为从事线粒体相关研究的各类科研人员提供参考。总体而言，RRS凭借其无创性、实时性和高度特异性，有望对细胞代谢研究产生重要影响。

方案

所有实验动物的饲养均遵循美国国家研究委员会的指导原则，并经麻省总医院（美国马萨诸塞州波士顿）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. RRS 的设置与使用

1. 设备描述：
   注意：便携式共振拉曼光谱系统（Pendar Technologies；该产品仅用于科研目的）采用441 nm激光，因为该波长可共振增强线粒体细胞色素的拉曼光谱。激光功率在4 mW至8 mW之间运行。
   1. 通过光纤电缆将激光激发源连接至定制探头。该探头在组织表面照射出直径为2 mm的激光光斑，并同时收集发射的光谱。光谱随后通过带通滤光片，并由电荷耦合器件（CCD）阵列收集。在180秒的时间范围内每秒采集一次光谱，并进行平均，以生成用于分析的原始、降噪后的光谱。
   2. 软件通过回归分析将所获得的光谱与预先测量的光谱库进行比对。
2. 预建光谱库的操作步骤
   注意：在本论文所展示的实验中，构建并使用了还原态与氧化态的线粒体、复合物III和复合物IV、血红蛋白以及肌红蛋白的光谱库。所有光谱库的RRS信号均在室温（21 °C）下的暗箱中采集。这些光谱库文件将随分析软件另行提供。然而，根据感兴趣组织的类型以及其他拉曼活性分子的存在情况，也可适当调整以下方案来构建其他光谱库。血红蛋白、肌红蛋白以及氧化/还原态复合物III/IV光谱库的原始RRS光谱见补充图1。
   1. 血红蛋白光谱库（补充图1C）：
      1. 通过动物放血采集新鲜啮齿类动物血液。在玻璃比色皿中使用100%氧气对采集的血液进行氧合，或加入连二亚硫酸钠后使用100%氮气进行脱氧处理。
      2. 将RRS探头置于距离玻璃比色皿9 mm处，透过比色皿壁对每种状态连续测量10分钟的RRS信号。
      3. 利用1356 cm^-1 处的光谱峰验证脱氧状态，利用1376 cm^-1 处的峰确认氧合状态。
   2. 还原/氧化线粒体光谱库（图1）
      1. 从匀浆并纯化的啮齿类动物心脏中分离线粒体，置于玻璃比色皿中。将拉曼探头置于距离比色皿9 mm处，透过玻璃壁测量这些线粒体的光谱。
      2. 通过向线粒体通入100%氧气创造完全氧化条件。通过确认1357 cm^-1处还原态RR峰的消失来验证氧化状态。
      3. 通过将线粒体暴露于含少量硫化氢的100%氮气中创造完全还原条件。通过确认1371 cm^-1处氧化态RR标志峰的消失来验证还原状态。
   3. 氧化/还原复合物III/IV（补充图1A、B）：
      1. 按照其他文献所述方法分离复合物III和IV^9,15,16,17。简而言之，使用分离的线粒体储备样品（相当于200 纳摩尔细胞色素a）作为起始材料。
      2. 将线粒体用冰冻缓冲液C（50 mM Tris，1 mM MgSO_4, pH 8.45）稀释至细胞色素A浓度为10 nmol/mL。然后，在冰上轻轻搅拌的同时，逐滴加入10% w/v的n-β-D-十二烷基麦芽糖苷（DM），直至终浓度为1%。
      3. 在4 °C条件下以40,000 × g离心提取物40分钟。将上清液加载至一根已用5柱体积缓冲液C（含0.02% w/v DM）平衡过的离子交换树脂填充的2.5 cm × 20 cm玻璃柱上。
      4. 用2柱体积的缓冲液C洗涤后，使用相同缓冲液中的线性0–400 mM NaCl梯度洗脱线粒体复合物，并以4 mL为一份收集洗脱液。
      5. 含复合物IV的绿色组分在梯度中间附近洗脱（约180 mL NaCl），早于含复合物III的红色组分。将分别含有各复合物的组分合并后浓缩至细胞色素a浓度为20–30 纳摩尔/mL。
      6. 在各复合物分离完成后，分别将其暴露于氧化和还原条件下。在Tris缓冲液中，使用2 mL抗坏血酸（1 M）还原11 mM的复合物III样品以还原细胞色素c1，并加入2 mL HS（连二亚硫酸盐）以完全还原细胞色素b_L和b_H。
      7. 由于复合物IV经历多步催化氧化过程，需分步还原18.67 mM的复合物IV样品。为完全还原复合物IV，先加入两份2 mL H₂O₂（10 mM），随后加入2 mL HS。
      8. 每次添加试剂后采集光谱库数据，以捕捉循环中的每一步变化。将完全氧化和完全还原状态的光谱加入最终参考光谱库，以代表复合物IV的稳态。
      9. 将所有样品制备于1 mL玻璃小瓶中，固定在距探头镜头9 mm的位置，并置于暗箱中以防止光污染。对每个复合物及其氧化状态采集600秒的RRS光谱。
      10. 按照先前文献所述方法¹⁷验证分离的cIII和cIV的纯度，并参照近期研究中所述方法⁹验证分离的cIII和cIV光谱库在解释完整线粒体光谱方面的充分性。
   4. 肌红蛋白光谱库（补充图1D）：
      1. 采用类似的氧气和氮气（溶解连二亚硫酸钠）气流，将心肌肌红蛋白提取物中的氧合肌红蛋白饱和度调节至0%至100%之间。通过1355 cm^-1 和1376 cm^-1处的标志峰验证拉曼光谱。

注意：上述大多数光谱组分（如血红蛋白或氧化/还原型线粒体）均为含血红素的分子，并由相同波长激发。该 RRS 系统通过为每种分子基于其独特的光谱信号建立回归谱库，避免信号重叠。所获得的散射光谱会与选定的谱库进行回归算法分析。回归算法为每个谱库光谱输出一个因子，代表其在记录光谱中相对贡献的最佳拟合估计值，从而反映其在组织中的相对浓度。由于该算法利用多个波数范围内的最佳拟合，各种谱库组分在光谱峰位置或强度上的微小差异均能使回归分析区分出即使高度相似的发色团。通过回归算法与光谱谱库，RRS 系统可将总的散射信号根据其独特的光谱峰分解为多个组分，避免含血红素分子之间的信号重叠。为展示血红蛋白与线粒体之间的关系，提供了补充图 2，其中包含来自肝脏灌注的光谱图像，分解为实测信号、最佳拟合线以及因各光谱峰差异导致的未解释残差。在图 A 中，选用了还原型与氧化型血红蛋白以及还原型与氧化型线粒体的回归谱库。通过谱库和回归分析生成的最佳拟合线与实测信号高度重合，未解释残差极小。在图 B 中，仅选用了氧化型与还原型线粒体谱库。由于存在较大的未解释残差结构，表明线粒体的光谱峰与未包含在回归分析中的血红蛋白相比，偏移了数个波数。此外，在 Nguyen 等人⁹的补充图中，作者解释了线粒体与各个复合物（cIII 和 cIV）之间的关系，以及各复合物之间的相互关系¹⁶，其中复合物 III 表现出更尖锐、频率更低的峰，而复合物 IV 则呈现更宽、向高频偏移的谱带。此外，作者还表明，还原型复合物 III 和复合物 IV 的谱库能够完全解释还原态完整线粒体的实测光谱，从而产生极小的未解释残差。

图1：完全氧化和还原状态下线粒体的光谱库。 在分离的线粒体分别暴露于（A）100% 氧气或（B）100% 氮气以达到氧化态和还原态后，获得共振拉曼光谱（RRS）库光谱。这些状态通过存在RR（C）氧化态和（D）还原态标志峰得以确认。这些峰的位移对应于在氧气存在下分子振动模式的变化。每个峰的强度被归一化为1个任意强度单位（AU），因为在使用441 nm激发波长时，还原态的增强效应更强。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 使用 RRS 进行数据采集

1. 设备 设置：
   1. 将光谱仪单元（置于一个紧凑的盒体内）使用配套的电缆连接至直流（DC）电源和电源适配器。光谱仪单元有一个带对齐凹槽的圆形插头。
   2. 将圆形插头的凹槽与连接电源适配器的电缆凹槽对齐。连接端口前无需清洁。图2). 
   3. 使用随附的电缆，将运行分析软件的计算机连接到与光谱仪和电源共用的同一电源适配器上。
   4. 将激光探头放入探头架中。在实验开始时调整该探头的位置。
   5. 打开光谱仪控制软件（Cellular Energetics Software）。
2. 软件设置：
   注意：系统提供针对不同类型组织的设置文件和回归分析库。这些文件包含有关RRS系统在回归分析中应包含哪些光谱库、回归窗口中包含的光谱数量以及其他参数（如激光功率）的信息。默认设置可进行修改，并可将新设置保存为文件，供后续实验使用。下文详细展示了软件界面的截图 补充图3.
   1. 打开光谱仪控制软件后，会显示一个图表，呈现3RMR百分比、氧饱和度（StO₂）和肌红蛋白饱和度将显示。如果选择，在整个测量过程中，这些指标将实时显示在此界面中。点击 设置 页面左下角的标签
   2. 在……之下 信息 标签，输入会话信息 实验名称以及所需的任何细节 课程描述 表。
   3. 有两种数据采集模式。使用 点检 模式持续累积光谱，直至达到指定的质量指标（例如，目标 sigma 值或回归窗口/光谱数量），然后停止记录。使用 连续模式 在停止按钮被按下前持续记录光谱。两种模式下，所有数据（包括3RMR结果和单个光谱）均自动保存。本实验采用 连续模式.
   4. 输入所有会话信息后，点击 系统 标签
   5. 下 设置文件，选择适合项目的方案（对于无细胞大鼠肝脏灌注，选择该） 大鼠肝脏脱细胞支架 方案）。这将自动调整测量类型、测量的平均长度（回归窗口）以及目标西格玛。
      1. 要创建一个新的设置文件，请调整上述列出的任意组件，然后单击 保存 按钮。这会将这些参数保存为一个独立的设置文件，随后可导入系统中。
      2. 要导入新的设置文件，请点击旁边的下拉菜单 默认（Mod） 并选择 导入新设置文件. 点击新的 设置文件 待导入。
   6. 下 回归分析库选择并确认用于数据采集和分析的文库组合。本实验选择了用于还原态和氧化态线粒体 [Mito Only] 的文库。其他用户可选择包含血红蛋白、肌红蛋白或在其他条件下发现的其他复合物的文库 高级资源库. 
   7. 选择并确认首选项 窗宽模式
      1. 自适应宽度模式：使用 自适应宽度 模式下持续将单个光谱添加至平均光谱，直至达到设定的最大sigma目标值。若未能达到sigma目标值，当记录光谱数量达到预设回归窗口上限（即设定的最大记录光谱数量）时，测量将自动停止。一旦达到最小sigma目标值，测量结果将实时显示在屏幕上。
      2. 固定宽度模式：使用 固定宽度 模式下将单个光谱逐个添加至平均光谱中，直至达到目标光谱数量（在平均长度中设定）。
   8. 系统设置完成后，单击 绘图 表。
   9. 下方 主系列选择在测量期间要在屏幕上绘制和显示的组件。
   10. 确认所选的所有测量组件均符合目标实验方案的要求。
3. 数据采集：
   注意：拉曼测量应在暗环境中进行。开始数据采集前，确保工作区域尽可能屏蔽外界光线。若房间无法完全避光，共振拉曼光谱系统配备有一个黑色遮罩，其中心带有矩形开口（如图所示） 图2），激光探头可由此置入。该装置可覆盖待测样本或器官切片区域。使用共振拉曼光谱（RRS）激光时，应避免眼睛直接或长时间暴露于激光。切勿将激光直接照射眼睛或反射表面。仅在激光探头准确定位于目标组织时方可启动激光。当输出功率为4 mW时，该激光器属于3R类激光产品；当输出功率为10 mW时，属于3B类激光产品。该激光器与组织接触是安全的。
   1. 选择适当的预存设置、记录参数和库文件。
   2. 将激光探头直接置于目标组织/器官的上方，尽可能使其与组织表面垂直，并距离组织1 cm。使用直尺精确测量器官表面至探头的距离，确保为1 cm。若信号不清晰，可将探头调整至小于1 cm的距离，但必须确保探头始终不接触组织。
      注意：探头可手持使用，但建议使用可调节且能保持稳定的探头支架/支架台。将探头尽可能垂直地置于距离组织1 cm的位置。可使用直尺精确测量距器官表面1 cm的距离。若信号不清晰，可调整探头使其距离小于1 cm，但探头切勿接触组织。
   3. 确认激光光斑位于左外侧叶，尽可能靠近门静脉。
   4. 确认所有选定的文库、回归设置、目标西格玛值、回归窗口和采集模式均正确且符合预期。
      1. 确保房间尽可能黑暗。检查探头窗口是否洁净，尤其避免血液等污染物。若存在污染，应使用蘸有70%异丙醇的无绒、无研磨性擦拭布清洁石英窗口，随后用干燥的擦拭布彻底擦干，再继续操作。
      2. 若污染严重，应按照上述方法尽可能彻底擦拭探头。然后，将激光器放入内壁贴有黑色胶带的暗盒中，并按下按钮以校准设备 暗视野观察 按钮。校准过程大约需要5–10分钟。无论是否存在污染，均需每月校准设备一次，设备将自动发送提醒消息。
         注意：各项质量控制指标的解释、此类质量控制指标的示例，以及从最优和次优记录中获得的原始光谱信号（补充文件 1, 图3, 补充图3）。这些质量控制标准是针对大鼠模型的完整肝脏优化而得。任何使用不同器官或动物模型新开发的方案，均应相应地优化和调整这些指标。
   5. 在主页面上，点击 开始 点击按钮开始采集数据。根据所选设置，软件将持续记录，直至达到目标误差值（sigma）或180秒为止。数据采集现已完成。
      1. 根据这些图谱和数值推断RRS信号的质量，以调整探针位置或测量条件（图3）。如果获得的RRS信号未能满足这些质量控制标准，应调整探头，使其尽可能垂直，并距离表面约9 mm至探头窗口。
   6. 数据采集/实验方案完成后，将整个肝脏/组织丢弃至生物危害废物容器中。使用70%乙醇清洁所有接触过器官/组织的系统或表面。
      1. 若使用灌流系统，先运行去离子水（DI水）与酶清洁剂的混合液（7.8 mL酶清洁剂稀释于1 L去离子水中），随后再运行洁净的去离子水。
         注意：每次记录将作为单独的分析文件保存在新的会话文件下。3RMR 和线粒体信号强度（r3RMR）的结果将在主窗口中绘制。原始光谱也可显示。其他质量检查指标，如残余信号强度和总信号强度，将在下方显示 光谱 表。
4. 数据分析：
   1. 数据采集完成后，单击 综述 点击屏幕底部的文件夹以打开实验文件并查看结果。
   2. 或者，打开一个包含结果的文本文件，选择所需会话文件，系统将打开一个包含所有测量结果的分析文件。每个参数及其sigma值将分别占据独立的列。例如，每秒获得的3RMR值将列在“3RMR”列下，其sigma值将列在“sigma_3RMR”列下。
   3. 每列的最后一行将包含该会话文件中各参数的最终值。请使用此值进行绘图。
   4. 对每个会话文件/每次记录重复上述步骤。根据需要绘制所得数值。

图2：RRS装置示意图。 RRS系统的装置示意图。探头通过光纤电缆连接至RRS系统，该系统包含激光激发光源和光谱仪。此装置进一步连接至任何装有光谱仪控制应用程序的笔记本电脑，用于数据采集与分析。计算机和光谱仪单元均需接入电源插座。RRS测量应在黑暗环境中进行。若房间无法完全遮光，RRS系统配备一个黑色遮光罩，其中心设有矩形开口，可将激光探头置于该开口处。该遮光罩覆盖待测样品或器官的测量区域。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：质量次优与最优信号示例轨迹及质量控制指标。 残余信号（噪声）以橙色括号标示，线粒体信号以绿色括号标示。（A）来自次优拉曼信号的示例轨迹。残余信号过大，无法与线粒体信号区分。在整个测量信号中，光谱峰无法分辨。（B）来自最优拉曼信号的示例轨迹。线粒体信号明显强于残余信号且可清晰区分。所获得测量结果中的光谱峰可明确识别。（C）从各信号获得的质量控制指标。总体而言，次优读数所获得的总信号低于最优读数。与次优记录相比，最优记录中检测到更多的线粒体信号，线粒体信号分别占总信号的17%和14%。最优读数的信号测量误差为4.3%，而次优读数为18.5%。类似地，未解释的残余信号在次优记录中占总信号的11%，而在最优记录中仅占3.6%。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 使用RRS评估线粒体健康状况

注意：采用共振拉曼光谱技术（RRS）开发了一种线粒体活力指标（3RMR），用于指示移植器官的活力状态。本研究旨在展示氧合状态（进而反映细胞呼吸）的变化如何体现在3RMR趋势中，并与传统损伤生物标志物（如乳酸和K⁺）进行比较。本实验采用氧应激测试方案：在持续灌注5分钟后，暂停含氧灌注流5分钟，随后再恢复灌注5分钟。在整个应激测试过程中，同步采集RRS测量数据以及灌注液的流入和流出样本。

1. 肝脏获取
   1. 使用3%–5%异氟烷在诱导室中对动物进行麻醉。用活性炭过滤过量蒸气。
   2. 对雄性Lewis大鼠（150 g）进行全肝切除术。结扎门静脉分支。通过下腔静脉注射50 U肝素钠。术中用16 G导管插入门静脉，以50 mL生理盐水灌注肝脏。
   3. 将获取的肝脏置于含有 30 mL 威斯康星大学（UW）溶液的培养皿中，并置于冰上。
2. 亚常温 机器灌注（SNMP）装置与共振拉曼测量:
   1. 按照之前所述设置RRS设备。设置 无细胞大鼠肝脏方案 在光谱仪控制软件上，该软件会自动设置 宽度模式 至 自适应宽度，平均长度至180，目标σ值为1.5。同时选择 3RMR 和 荧光 作为测量参数，以及 仅线粒体 作为回归库。将采集模式设置为 连续模式.
   2. 按照其他地方所述设置 SNMP 系统¹⁸.
      1. 简而言之，确保灌流装置由灌流室、蠕动泵、膜式氧合器和气泡捕集器组成。
      2. 以大气混合气体（95% O₂，5% CO₂）输送氧气₂ 和5% CO₂₂）；保持 pO₂ 在400–500 mmHg之间。使用压力传感器监测肝内压力，并维持在3–5 mmHg。通过取样口收集样品。
   3. 软件和灌注系统设置完毕后，将穿过门静脉（PV）的插管连接至灌注仪的进液管。保持器官、灌注液及灌注装置处于室温（21 °C），无需使用水浴装置。
   4. 利用蠕动泵通过门静脉（PV）中的导管将灌注液输送至器官。
      1. 配制灌注液：将500 mL无酚红Williams培养基与5 g牛血清白蛋白（BSA）、12 mg水溶性地塞米松、5 mL青霉素-链霉素、5 mL L-谷氨酰胺、2.5 µL胰岛素和1000 U肝素混合。
      2. 将所有组分置于摇床中搅拌约20分钟，或直至所有组分完全溶解。增加灌注流速，使压力达到3–5 mmHg。
   5. 然后，将RRS激光源放入探头架中，并置于肝脏最大叶上方1 cm处，尽可能靠近门静脉（PV）。在灌注5分钟时（T₅）并在10分钟时（T₁₀）。在15分钟时（T₁₅).
   6. 在整个应激试验过程中采集RRS数据；从时间点T开始，每5分钟采集一次流入和流出数据₀ (图4）。绘制3RMR值以及流出道K⁺ T 的水平和乳酸水平₀，T₅，T₁₀，T₁₅ （n = 3）（图5).
   7. 在 T 时刻计算耗氧率（OCR）₀，T₅，T₁₀，T₁₅ 通过将氧气流入/流出的分压（pO₂) 乘以血浆中氧气的溶解系数（0.00314）。绘制T的耗氧率（OCR）₀，T₅，T₁₀，T₁₅ (图5).
      注意：灌注状态下（T₅），缺血性（T₁₀）并重新灌注（T₁₅）状态 来自一个肝脏的结果显示（图6)

图4：实验流程示意图。对雌性Lewis大鼠进行全肝切除。获取的肝脏置于亚常温机械灌注系统中，并在前5分钟内供给含氧灌注液。灌注液经门静脉流入肝脏，并通过蠕动泵循环（灌注流向以蓝色箭头表示）。在T5时间点暂停含氧灌注5分钟，随后在T10时间点重新启动灌注，持续5分钟。在整个应激测试过程中进行3RMR测量（以激光表示）。在T0、T5、T10和T15时间点采集灌注液样本。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

新鲜肝脏通过氧应激测试进行缺血和再灌注处理。随后，在整个应激测试过程中，将3RMR的实时变化与T₀、T₅、T₁₀、T₁₅时间点通过灌注液分析获得的耗氧率、流出液乳酸和钾离子水平进行比较。在健康状态下，3RMR值预期介于10%至30%之间（图5A）。如预期所示，T₀和T₅时的3RMR值处于该范围内，因为在此期间肝脏持续接受含氧灌注液供应（图5A）。然而，在缺血期结束时（T₁₀），3RMR值超出最佳范围（图5A）。这一升高表明线粒体向还原状态转变，原因是脱氧导致电子传递链中电子积聚。在T₁₀时，恢复含氧灌注流，再灌注期开始。在再灌注期结束时（T₁₅），随着氧气作为最终电子受体重新引入，电子传递链活性恢复，3RMR值回归至最佳水平（图5A）。这些氧流变化在原始光谱中亦清晰可见。T₀和T₁₅时的原始RRS光谱表现出与氧化态线粒体相似的光谱特征（图6A、C），例如在1371 cm^-1处出现光谱标志峰（图6D、F）。类似地，T₁₀时的原始拉曼光谱（图6B）显示出还原态RR标志物特征，例如在1357 cm^-1处的光谱标志峰（图6E）。综上所述，共振拉曼光谱（RRS）能够实时识别线粒体氧化还原状态的变化，这一变化既体现在原始光谱信号中，也可通过线粒体健康指标（3RMR）进行量化。

RRS 还可根据 cIII 和 cIV 的氧化还原状态计算 3RMR 值。cIII 和 cIV 的 3RMR 值呈现出相似的模式（图 5B）。在 T₀ 时刻，观察到 cIV 的 3RMR 值处于完全氧化状态，而 cIII 的 3RMR 值处于最佳范围内。这种复合物之间的氧化还原平衡是生理性的，因为电子从 cIII 流向 cIV 并被迅速氧化。缺血开始后，每个复合物的 3RMR 水平均升高。在缺血期间，电子传递链（ETC）中电子积聚，导致 cIII 和 cIV 的还原性应激增加，从而引起 cIII-3RMR 和 cIV-3RMR 升高。 然而，当重新供氧后，两个复合物的 3RMR 值均回落至最佳水平：cIV 恢复完全氧化状态，cIII 恢复生理性的还原状态（图 5B）。两个复合物的 3RMR 变化趋势表明，氧气供应的中断会影响整个电子传递链，而并非某个单一复合物对无灌注缺血特别敏感。

另一方面，氧合动力学的变化并未反映在灌注液分析所得的损伤生物标志物和血气分析物中。缺血开始后，乳酸和 K⁺ 预期会上升，因为细胞开始依赖无氧呼吸，并逐渐降解释放细胞内 K⁺。我们还预期耗氧率（OCR）会下降，因为细胞无法产生足够的能量以维持细胞呼吸。即使经过一段无灌注缺血期后，耗氧率仍未显示出损伤迹象。在整个应激测试过程中，流出液中的乳酸和 K⁺ 水平保持相对稳定，尽管氧合状态发生了变化（图 5D–E）。

图5：氧应激试验过程中3RMR及损伤生物标志物的变化。缺血期和再灌注期的起始时间分别用第5分钟和第10分钟的虚线表示。此外，氧合血流期以蓝线表示，缺血期以红线表示。（A）线粒体检测过程中3RMR值的变化。当氧合血流暂停时，3RMR值升高；当血流恢复时，3RMR值回落至最佳水平。（B）复合物III和复合物IV的3RMR值。血流停止导致两个复合物的活性均下降。（C）应激试验期间平均流出液K⁺值。尽管氧合动态发生变化，K⁺值在整个试验过程中保持稳定。（D）应激试验期间平均流出液乳酸水平。乳酸输出量在整个应激试验过程中保持一致。（E）T₀、T₁₀、T₁₅时刻的氧气消耗速率。由于pO₂值是基于血流的测量参数，因此无法计算无血流缺血期的耗氧率（OUR）。未观察到显著变化（p值：0.2500）（n = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：大鼠新鲜肝脏在整个应激测试过程中的典型原始光谱轨迹。 肝脏在（A）氧化态、（B）缺血态和（C）再灌注态下的完整光谱轮廓。当放大至各光谱轮廓中标红色框的线粒体光谱峰时，可观察到从氧化态RR标志物向还原态RR标志物的转变。（D–F）氧化态RR标志物峰（1371 cm^-1）出现在（D）氧化态和（F）再灌注态中，并以红色虚线标出。还原态RR标志物峰（1357 cm^-1）出现在（E）缺血态中，并以蓝色虚线标出。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：复合体III、复合体IV、血红蛋白和肌红蛋白的还原态与氧化态光谱迹线。 (A) C复合体 III，（B) 复合物 IV，（C) 血红蛋白，以及（D) 肌红蛋白 回归分析将采集到的光谱与这些光谱库（如已选择）进行比对，得到每个库光谱的因子，该因子代表其在记录光谱中相对贡献的最佳拟合估计值，从而反映其在组织中的相对浓度。 请点击此处下载此文件。

补充图2：利用回归分析文库分解重叠的含血红素分子（血红蛋白与氧化/还原型线粒体）的示例。（A）来自用细胞灌注液灌注的肝组织的原始光谱迹线，选用了所有必要的回归分析文库，如血红蛋白、氧化型血红蛋白、还原型线粒体和氧化型线粒体。显然，由文库和回归分析得出的最佳拟合线与实测信号高度重合，未解释的残差极小。（B）相同组织的原始光谱迹线，但仅选用了氧化型和还原型线粒体文库。由于存在显著的未解释残差结构，明显可见线粒体的光谱峰与未包含在回归分析中的血红蛋白相比，偏移了数个波数。该图表明，高分辨率光谱仪结合全光谱回归分析能够区分高度相似的光谱。请点击此处下载该文件。

补充图3：软件界面截图。（A）主窗口，用于显示随时间变化的测量值。在测量过程中，3RMR、StO2 及任何其他选定的系列数据将在此处显示。此外，每个系列的信号强度将以虚线形式在图中显示，并在屏幕右侧下方标注具体数值。例如，此处捕获的实线代表组织的 3RMR，虚线代表 r3RMR（即 3RMR 的信号强度）。若需查看记录光谱的质量，可点击 显示光谱 选项卡（图中以紫色圈出）。（B）显示组织原始光谱的界面。在此选项卡中，可通过测量光谱强度与残余噪声的对比来评估信号质量。（C）显示实验过程中各系列数据趋势的选项卡。例如，在整个实验过程中进行了多次 3RMR 测量，则每次测量结果将在此选项卡中按时间顺序显示。若选择了其他系列数据，其趋势也将在此处显示。该选项卡可通过点击主界面上的 趋势 按钮进入（在 A 图中以绿色圈出）。（D）信息 选项卡，用户可在此输入实验相关信息，如会话名称和描述。（E）系统 选项卡，用户可在此上传预加载的协议。例如，若选择 LiverContAcell 协议，该协议将根据大鼠肝脏无细胞灌注方案自动设置回归库、目标回归窗口和 sigma 参数。要导入协议，可点击 从文件导入设置 并导入所需协议。若用户希望创建自己的协议，可从（F）回归库 下拉菜单中选择必要的库，调整目标 sigma 和回归窗口，以及报警设置，然后点击左下角的 保存 按钮（以光盘图标表示）。（F）绘图 选项卡，用户可在此选择在主窗口中显示哪些系列数据。若重新分析光谱，并希望在先前测量结果中添加更多系列数据，可在 重校准（Recal）部分下选择所需系列。在重校准（Recal）过程中，软件将重新分析测得的原始光谱，并显示新选系列的分析结果。用户也可通过此选项卡选择是否显示所选系列的信号强度。请点击此处下载该文件。

补充文件1：各项质量控制指标的说明。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究介绍了一种非侵入性、实时且高度灵敏的线粒体健康定量方法，该方法采用便携式共振拉曼光谱系统，系统由紧凑型探头中的激光器组成，并通过光纤电缆连接至激光泵。该方法使用441 nm激光激发线粒体，线粒体根据其氧化状态产生独特的光谱信号。因此，共振拉曼光谱（RRS）能够通过其光谱特征量化线粒体的每种状态，并通过回归分析将发射光谱与预先测量的光谱库进行比对。随后基于还原态线粒体与总线粒体的比值构建了一项线粒体健康指标：还原共振拉曼线粒体比率（3RMR）。

本文重点展示在无需样本处理的情况下，3RMR 随天然组织氧合状态实时变化的情况。该目标通过氧应激测试实现：在持续氧合灌注 5 分钟后，暂停灌注 5 分钟，随后重新启动灌注 5 分钟。在整个应激测试过程中持续采集 3RMR 测量数据。通过在缺血与氧合状态之间切换的应激测试模型，可追踪线粒体氧化还原状态的连续变化，进而反映线粒体功能的变化。换句话说，氧应激测试使我们能够追踪 3RMR 随氧合状态变化的趋势。本课题组已指出，3RMR 值升高与缺血条件相关，即灌注中断导致电子传递链（ETC）中的电子因缺乏最终电子受体 O₂ 而积聚。电子的积聚导致还原状态增强，表现为 3RMR 值升高。然而，当重新引入 O₂ 后，结构和功能完整的健康线粒体应能恢复 ETC 活性，并回归生理性的氧化还原状态。

正如预期，在本研究中，缺血期间观察到3RMR实时持续升高（图5A）。同样，在再灌注期间，3RMR逐渐恢复至最佳水平（图5A）。线粒体氧化还原状态的这种实时变化也可在光谱图中观察到：在缺血期间，线粒体峰从氧化态（1371 cm^-1）向还原态（1357 cm^-1）移动，并在再灌注结束时恢复至氧化态（图6）。在缺血期间，其他还原型RR标志物峰也出现。与传统的线粒体健康检测方法不同，共振拉曼（Resonance Raman）具有足够的灵敏度，可定量复合物III和复合物IV的氧化还原状态，从而为缺血-再灌注损伤对电子传递链（ETC）的特定影响提供机制性见解。在健康的线粒体中，电子从复合物I开始，依次通过电子传递链中的多个复合物，最终传递给O₂ 作为终末电子受体。氧气供应中断会导致电子在电子传递链中积聚，从而使各个复合物转变为还原状态。正如预期，在缺血开始时，cIII和cIV的3RMR值均出现实时升高。这表明O₂的缺乏影响了整个电子传递链，而非某一特定复合物（图5B）。正如我们将在下文讨论的，RRS的高灵敏度有助于开展详细的机制研究，并为缺血-再灌注损伤（IRI）的靶向治疗策略开发提供依据。

传统上，我们还预期在缺血器官中观察到乳酸水平升高，因为这些器官在缺乏氧气的情况下依赖无氧代谢来生成ATP。同样，K⁺浓度也会升高⁺ 受损器官中预计会出现钾离子水平升高，因为细胞膜完整性遭到破坏，导致细胞内钾离子外流⁺. 最后，严重受损的细胞可能代谢水平较低，因为其代谢通路受到缺血诱导的代谢废物和活性氧（ROS）的影响，导致氧气消耗减少。然而，乳酸和 K 未发生明显变化。⁺，或耗氧量在缺血期间或之后均未观察到下降。事实上，这些数值并未显示任何氧流中断的迹象，因为在整个应激试验过程中，它们始终保持相对稳定图 5B–D）。本质上，通过使用氧应激测试，本研究表明，3RMR值相较于传统损伤生物标志物，能够更快速、实时且更灵敏地反映缺血-再灌注过程中线粒体氧化还原状态的变化图5）。我们认识到，本研究将3RMR动态变化与乳酸和耗氧率（OCR）等线粒体健康的间接指标进行了比较，而非采用NAD+/NADH和ATP等更为直接的下游指标作为对照。尽管本研究未明确将3RMR的变化与ATP/NADH浓度相关联，但先前的研究^9,14 已表明3RMR可预测这些下游生物标志物的变化。例如，Nguyen等人⁹ 证明了低3RMR值的3小时热缺血（WI）肝脏<10%）的ATP浓度和NAD/NADH比值显著低于灌注1小时的肝脏（3RMR值约为15%）。此外，Jain等¹⁴ 在3RMR无显著差异的组别中，NAD+/NADH比值或能量电荷（EC）亦未观察到显著差异。研究者还发现，在24小时冷缺血（CI）肝脏中，无细胞灌注条件下NAD+/NADH比值和EC相较于有细胞灌注条件存在显著差异，而后者也显示出具有统计学意义的3RMR值。综上所述，这些结果表明3RMR值能够反映线粒体及电子传递链（ETC）功能更直接指标的变化。

尽管本文通过15分钟灌注全程使用RRS来展示系统的性能，但其他已发表的研究已证明了RRS在纵向研究中的应用价值。更具体地说，在之前的一项工作中，我们证明了RRS在较长时间器官灌注过程中能够补充传统生物标志物的不足，因为它提供了关于线粒体健康与功能的信息，这些信息与传统方法有显著差异。例如，该研究利用RRS评估了可移植（24小时冷保存）和不可移植（72小时冷保存）冷缺血大鼠肝脏在亚常温灌注过程中的活力¹⁰。尽管两组在开始氧合时的初始反应相似，但不可移植肝脏的3RMR随着灌注时间延长而升高，而可移植肝脏的3RMR在整个SNMP过程中保持稳定。同样，72小时冷缺血肝脏在整个SNMP期间的钾离子水平和总体增重均高于24小时冷缺血肝脏。该研究证明了RRS在长时程灌注中对传统生物标志物的补充作用。在另一项研究中，我们利用RRS来理解冷缺血（CI）大鼠肝脏的再氧合动力学和代谢恢复过程¹⁴。我们分别使用无细胞灌注液或红细胞浓缩液（pRBC）对轻度缺血（15分钟冷缺血）和24小时冷缺血肝脏进行灌注。当24小时冷缺血肝脏使用无细胞灌注液灌注时，其3RMR相较于使用pRBC灌注时出现延迟性下降。该研究将这种3RMR的延迟上升归因于冷缺血期间线粒体细胞色素中电子的积累，这些电子在pRBC灌注液富含氧气的情况下可迅速转移。然而，结合其他损伤标志物，我们发现使用pRBC灌注的24小时冷缺血肝脏表现出更严重的肝损伤。该研究得出结论：通过RRS实时测量线粒体氧合状态，可深入了解线粒体的恢复过程，这对于优化长时程灌注策略具有潜在益处。本质上，这些发现表明，将传统生物标志物（如乳酸、OCR、ATP）与RRS提供的线粒体氧化还原状态和氧合动态信息相结合，能够更全面地评估线粒体的恢复情况。

其他研究已将RRS用作测试治疗手段的平台，以减轻缺血-再灌注对电子传递链（ETC）造成的损伤⁹。在长时间缺血期间，电子在ETC中积聚，并可能通过各个复合物逸出，尤其是在再灌注期间。了解各个复合物在缺血-再灌注过程中的氧化还原状态，有助于更深入地确定损伤发生的位置，从而实现更有针对性的干预。例如，我们团队已利用RRS开发针对温缺血猪肝中复合物III（cIII）功能障碍的治疗策略。Nguyen等人（2026）⁹开展的一项研究中，将经历1小时和3小时温缺血（WI）的肝脏置于SNMP系统上灌注3小时。如前所述，经历3小时WI的肝脏已知会遭受ETC损伤，导致过度氧化和代谢降低。尽管新鲜肝脏和1小时WI肝脏在整个灌注过程中3RMR值均处于最佳范围内，但我们观察到3小时WI肝脏的3RMR值持续下降，在3小时时已降至最佳范围以下（10%）。此外，两组间细胞色素cIV（cIV）的3RMR值未见差异，cIV在两组中均处于完全氧化状态。cIII的过度氧化，结合cIV中观察到的正常氧化还原状态，表明再灌注引起的过度氧化发生在复合物III。基于这一认识，Nguyen等人（2026）⁹成功选择了一种可克服cIII功能障碍的治疗剂：亚甲蓝（MB），其可在复合物I（cI）与细胞色素c之间作为电子穿梭体，绕过cIII，将电子直接传递至cIV。3RMR结果反映了MB对线粒体的治疗作用，在对3小时WI肝脏进行SNMP期间，3RMR值上升，表明电子被直接转运至cIV，肝脏代谢得以恢复。MB的保护作用还通过流出液乳酸水平下降和氧耗速率改善得到验证。本质上，RRS的特异性使得能够开发出针对温缺血后线粒体需求的个性化治疗路径。

本文中，我们 将共振拉曼光谱法（Resonance Raman Spectroscopy）作为一种无创、 实时且高度特异性的方法，用于评估线粒体健康状况。该研究 表明 ，RRS 可在生理变化产生下游效应之前，检测组织中氧化还原 状态 的细微变化，且不干扰组织 本身 。 然而，必须指出共振拉曼系统存在若干局限性。 首先， RRS 要求在回归分析中识别并纳入组织中所有发生共振增强的分子，且每种分子具有不同的增强因子，需据此校正其相对信号强度。尽管我们已在特定波长和组织条件下建立了所有相关组分的光谱库，但用户可能仍需为每种感兴趣的组织和波长建立并验证新的光谱库。此外，某些组织可能含有复杂的光谱组分，这使得检测浓度较低的线粒体细胞色素变得困难。例如，猪或人肝脏中含有 β-胡萝卜素 ，血液中含有血红蛋白，二者均具有强烈的光谱信号，会增加 RRS 在回归分析中需要考虑的光谱特征 数量 ，从而增加分析复杂性 。 光谱 信号 的叠加 。最后，本研究采用的 441 nm 激光束直径为 2 mm ，穿透深度小于 1 mm。此类局部、表面测量 可能 导致取样误差，因为器官其他区域的氧化还原状态差异可能被忽略。 为克服上述挑战，可从器官深部获取活检样本进行测量，或采用多激光系统 ，以 实现 更大 表面积 上的检测，从而更全面地评估整个器官的健康状况。 

综上所述，我们证明了与血气分析物相比，共振拉曼光谱法对线粒体动态的细微变化具有更高的敏感性。本文提供了该系统搭建与操作的详细说明。我们强调了共振拉曼光谱法（RRS）具有无创性、高特异性和实时评估的特点，并阐述了其作为诊断工具及机制研究方法的应用潜力。我们还强调了该技术在线粒体功能障碍特异性治疗通路开发中的应用价值。未来的研究可聚焦于将RRS系统应用于组织活检样本、精密切割的组织切片或其他组织来源产物（包括用于转化研究的人体组织）中的线粒体健康评估。RRS技术的推广应用为代谢研究提供了一种强有力的手段，使我们能够比传统方法更便捷地深入理解细胞生物能量学过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16 G 导管	BD Insyte Authoguard	381454	用于门静脉插管
活性炭	Vet Equip Vapor Guard 活性炭	931401	用于麻醉期间过滤过量蒸气
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	灌注液成分
气泡捕获器	Radnoti	130149
地塞米松	Sigma-Aldrich	D2915	灌注液成分
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	灌注液成分
Masterflex L/S 精密泵管（24 G）	Fisher Scientific	13-200-292	用于使灌注液流经肝脏
Masterflex 蠕动泵	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	用于使灌注液流经肝脏
膜式氧合器	Radnoti	130144	用于灌注液的氧合。
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4458	灌注液成分
RAPIDPoint 500 血气分析系统	Siemens Healthineers	41115805	用于血气分析
共振拉曼系统	Pendar Technologies	A4D441	有关该产品的咨询，请联系 Pendar Technologies