制备可调谐聚丙烯酰胺水凝胶以研究基质刚度对干细胞样Leydig细胞的影响

摘要

本方案描述了制备具有可调刚度的聚丙烯酰胺水凝胶的方法，用于在可控的二维培养系统中研究基质力学对干细胞样 Leydig 细胞行为的影响。

摘要

细胞外基质（ECM）硬度对干细胞行为具有关键调控作用。此前，我们已证明衰老过程中基质硬度的病理性增加会破坏干细胞样利迪细胞（SLC）的稳态，导致睾酮水平下降。基于这一发现，本文详细介绍了一种由本实验室原创开发的实验方案，用于制备硬度可调的聚丙烯酰胺（PA）水凝胶，以模拟睾丸微环境。 体外该方法能够实现1–100 kPa硬度范围内水凝胶的可重复制备，覆盖从生理到病理条件的硬度范围。关键步骤包括丙烯酰胺/双丙烯酰胺的精确配比、凝胶溶胀平衡、使用Sulfo-SANPAH进行表面活化以及胶原蛋白包被，以支持SLC的黏附与培养。我们提供了针对目标硬度的优化配方，并针对聚合不完全和细胞贴壁不良等常见问题给出了相应的解决方案。 该系统可在定义明确的二维条件下，系统性地研究基质刚度对支持细胞增殖、分化及类固醇生成功能的调控作用。除生殖生物学领域外，该系统还可作为研究其他细胞类型中力学生物学效应的有力平台，并可用于筛选靶向刚度相关功能障碍的治疗药物。

引言

细胞外基质（ECM）的力学特性在调控干细胞命运（包括增殖、分化和功能维持）中发挥关键作用^1,2,3,4在睾丸中，与年龄相关的细胞外基质（ECM）硬化已被认为与睾酮生成能力下降有关。然而，其潜在的力学生物学机制仍不清楚，部分原因在于缺乏标准化方法 体外 能够真实再现睾丸微环境生理硬度范围的模型。 年轻小鼠睾丸组织的生理硬度约为1–15 kPa，而衰老或纤维化组织的硬度可达到20–30 kPa甚至更高。

聚丙烯酰胺（PA）凝胶因其刚度可通过调节丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例进行精确调控，已成为研究细胞-基质相互作用的多功能平台^5,6。与其他基底（如胶原包被的玻璃或商用水凝胶）相比，PA凝胶能够独立控制刚度和生化配体密度，从而系统性地解析机械信号的作用。尽管已有多种PA凝胶制备方案^7,8,9，但这些方案通常缺乏针对特定细胞类型的详细优化，尤其是对于SLCs等稀有的原代细胞。

本文介绍了一种稳定且可重复的制备聚丙烯酰胺（PA）凝胶的方案，该凝胶具有明确的刚度（1–100 kPa），专为培养小鼠精原干细胞（SLC）而设计。该方法包含凝胶浇铸、溶胀平衡、使用 Sulfo-SANPAH 进行表面功能化以及胶原蛋白包被以促进细胞黏附的逐步操作说明。通过遵循本方案，研究人员可制备出刚度可调（范围为 1 至 100 kPa）的基底，以模拟年轻（柔软）和衰老（僵硬）睾丸的机械微环境，从而实现对刚度依赖性 SLC 反应的定量研究。该系统还可适用于其他力敏感细胞类型，并为靶向刚度相关病理的药物筛选提供平台。

方案

所有动物实验程序均经中山大学实验动物伦理与使用委员会批准（批准号：SYSU-IACUC-2026-B1278），并依照机构指南进行。

1. 小鼠原代 SLC 的分离与培养

1. 从 C57BL/6 小鼠中解剖出睾丸，并小心去除白膜。
2. 将睾丸切成小块。
3. 在 DMEM/F12 中加入 1 mg/mL IV 型胶原酶，于 37 ºC 孵育 15 分钟，以分离间质细胞与曲细精管。
4. 加入含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 以终止胶原酶活性。
5. 在室温下以 1500 × g 离心 3 分钟。
6. 将沉淀重悬于 PBS 中，并通过 70 µm 滤膜过滤。
7. 使用 Influx 细胞分选仪通过荧光激活细胞分选（FACS）富集 CD51⁺ 细胞。
8. 将富集后的细胞接种于 SLC 培养基中，该培养基由 DMEM/F12 添加以下成分组成：1 nM 地塞米松、1 ng/mL 白血病抑制因子（LIF）、5 µg/L 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、5% 鸡胚提取物、0.1 mM β-巯基乙醇、1% 非必需氨基酸、1% N2、2% B27、20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板源性生长因子和抑癌素 M。
9. 将 SLC 细胞在标准条件下（37 °C，5% CO₂）培养，直至达到在水凝胶上接种所需的密度。

2. 组装凝胶制备玻璃容器

1. 仔细检查并清洁用于制备聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶的专用玻璃板和垫片，确保其无灰尘、无损伤且无残留物。
2. 根据制造商的说明正确组装玻璃板、垫片和夹子，确保组装严密，防止灌胶过程中发生泄漏。
3. 将组装好的玻璃容器稳固地放置在实验支架上，准备进行灌胶。
   注意：该灌胶装置使用标准的蛋白质印迹（十二烷基硫酸钠[SDS]-PAGE）玻璃板，配备固定厚度为1.0 mm的垫片，以确保凝胶厚度一致，并为细胞培养提供平整表面。

3. 制备PAGE胶混合溶液

1. 根据实验设计，精确量取以下试剂加入一个 15 mL 或 50 mL 无菌离心管中（见表 1）：40% 丙烯酰胺贮存液、2% 双丙烯酰胺贮存液、1 M HEPES 缓冲液（pH 8.5）、无菌 ddH₂O。
   注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺为神经毒素。称量干粉时务必佩戴手套和防尘口罩，避免皮肤接触和吸入粉尘。操作应在通风橱内进行。

4. 添加引发剂和催化剂，并浇铸凝胶

1. 依次向混合溶液中加入以下成分：10% 过硫酸铵（APS）：作为引发剂启动聚合反应。N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：作为催化剂加速聚合反应。 对于总体积为 6 mL 的凝胶，加入 60 µL 的 10% APS 和 6 µL 的 TEMED（参见表 1进行比例换算）。
   注意：加入 TEMED 后聚合反应立即开始；因此，后续步骤必须迅速进行。

5. 倒入混合溶液

1. 立即沿玻璃容器的一边平稳地用移液管吸取或倾倒混合溶液，以避免产生气泡。

6. 使凝胶聚合

1. 将制备好的凝胶容器置于室温下静置，避免扰动。
   注意：在室温（20–25 °C）下，聚合通常需要 15–30 分钟。
2. 当观察到未聚合的凝胶混合物与已聚合凝胶之间出现清晰的界面，且凝胶完全固化（倾斜容器时凝胶不流动）时，进行下一步操作。
3. 浇注后立即小心地在凝胶混合物表面覆盖一层无水乙醇（或水饱和乙醇），以隔绝大气中的氧气，防止其抑制自由基聚合反应。乙醇还有助于形成平整的上表面。
4. 聚合完成后，在拆卸玻璃板之前去除乙醇。

7. 拆卸容器并收集凝胶

1. 小心拆卸夹子，并使用塑料楔子或刮刀轻轻将玻璃板分开，使聚合后的聚丙烯酰胺凝胶完整地保留在其中一块玻璃板上。
2. 准备一个含有足量无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿。
3. 使用刮刀或戴手套的手小心地将凝胶从玻璃板上剥离，并使其平滑滑入PBS中。
4. 密封含有凝胶的培养皿，并在4 °C下孵育过夜。
   注意： 此步骤至关重要。新制备的凝胶处于脱水状态，必须在PBS中充分吸水并膨胀至最终尺寸。如果跳过此步骤而直接切割凝胶，凝胶将在后续的细胞培养基中继续膨胀，很可能超出培养孔的面积，导致无法使用。溶胀后的凝胶厚度为1 mm。这一点极为关键，因为当凝胶厚度低于100 µm时，细胞可能会感知到下方刚性培养板的硬度，从而干扰预期的力学生物学测量。

8. 将凝胶切割并转移至培养皿

1. 第二天，从 4 °C 取出凝胶。在无菌条件下，使用无菌活检打孔器或刀片切割器（直径与培养板孔大小相匹配，例如 6 孔板），将凝胶切割成相应大小的圆片。
2. 在生物安全柜内，使用无菌镊子轻轻夹取切割好的凝胶圆片，并将其放置于一个洁净无菌的培养孔中央。

9. 初次洗涤与紫外照射

1. 向含有凝胶的孔中加入足量无菌 PBS，确保凝胶完全浸没。
2. 轻轻摇动培养板以清洗凝胶表面。
3. 使用移液器吸除 PBS。
4. 重复此清洗步骤一次，共清洗两次，每次持续 3 min。
5. 清洗后，再次加入足量无菌 PBS 覆盖凝胶。将整个带盖微开的培养板置于紫外灯下（在生物安全柜或专用紫外交联仪内），照射 1 h 以进行基本灭菌。

10. 活化 Sulfo-SANPAH 交联剂

1. 在生物安全柜内，小心吸除孔中的 PBS。
2. 吸液前，使用移液器吸头轻轻将凝胶从孔壁和孔底分离，以避免因液体表面张力而损坏凝胶。
3. 使用无菌镊子将凝胶转移至同一培养板中的另一个洁净孔中。
   注意：转移凝胶时，可先在洁净孔中加入少量 PBS，有助于排除凝胶放置时底部与孔之间夹带的气泡，同时也起到额外洗涤的作用。
4. 配制交联剂工作液：使用无菌水或推荐缓冲液（如 PBS）将储存液稀释，新鲜配制 0.2 mg/mL 的 Sulfo-SANPAH 工作液（参见 表 1）。
   注意：避免溶液暴露于光照下。
5. 加入足量的 Sulfo-SANPAH 工作液以完全覆盖凝胶（例如，12 孔板加 250 µL，6 孔板加 500 µL），确保凝胶被完全浸没。
6. 将培养板置于 365 nm 波长 / 120 mJ/cm² 的紫外光下照射 1 小时。
   注意：此步骤可激活 Sulfo-SANPAH，使其能够与凝胶表面的功能基团结合。

11. 交联剂活化与最终洗涤

1. 照射后，在生物安全柜内吸出孔中的 Sulfo-SANPAH 溶液。
2. 向孔中加入足量无菌 PBS，轻轻摇动以清洗凝胶表面，然后吸出 PBS。
3. 重复此清洗步骤一次，共清洗两次，每次持续 3 分钟，以彻底去除未反应的 Sulfo-SANPAH。

12. 准备大鼠尾部I型胶原工作液

1. 使用 0.02 M 乙酸溶液作为溶剂，稀释大鼠尾部 I 型胶原蛋白储备液。
2. 将最终工作液浓度调整为 60–100 µg/mL。例如，若胶原蛋白储备液浓度为 4 mg/mL，则取 15–25 µL 储备液加入 985–975 µL 的 0.02 M 乙酸溶液中，得到 1 mL 工作液。

13. 胶原蛋白包被与孵育

1. 根据培养板类型，向每孔中加入适量的胶原工作液：6孔板每孔加2 mL，12孔板每孔加1 mL。
2. 轻轻晃动培养板，确保胶原溶液均匀覆盖凝胶及孔底表面。
3. 盖好培养板，在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜，使胶原通过Sulfo-SANPAH交联固定于凝胶表面。

14. 二次紫外照射与固定

1. 第二天，取出培养板，在约 120 mJ/cm² 的紫外光下再次照射 1 小时。

15. 去除未结合的胶原蛋白并接种细胞

1. 在生物安全柜内，小心地从孔中吸除大鼠尾部I型胶原工作液。
2. 向孔中加入无菌PBS，轻轻摇动以清洗凝胶表面，然后吸除PBS。
3. 重复清洗一次，共清洗两次，每次持续3分钟。
4. 清洗后，凝胶基质即准备就绪。将制备好的精原干细胞重悬于完全SLC培养基中（成分详见步骤1）。
5. 直接将细胞悬液接种至凝胶表面。推荐接种密度为2 × 10⁴ 细胞/cm²（例如，标准6孔板每孔约2 × 10⁵ 细胞）。
6. 将培养板置于37 °C、含5% CO₂的加湿培养箱中孵育。
7. 为维持细胞最佳存活率和类固醇生成功能，每48小时更换一次培养基。

结果

成功执行本方案可获得具有特定刚度（范围为 1 至 100 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶，该凝胶牢固附着于培养板上，并能有效支持 SLC 的黏附与铺展。图 1 概括展示了从凝胶浇铸到细胞接种的完整操作流程，帮助用户直观理解本方案的关键步骤。

使用振荡流变仪（平行板几何结构，37 °C）对聚丙烯酰胺水凝胶（目标刚度：1、5、15、30、50 和 100 kPa）进行力学性能验证。测得的杨氏模量分别为 1.1 ± 0.2 kPa、5.1 ± 0.6 kPa、15.2 ± 2.1 kPa、29 ± 3 kPa、51.7 ± 3.7 kPa 和 96 ± 6 kPa，证实所描述的配方覆盖了预期的生理和病理刚度范围。在 4 °C 的 PBS 中溶胀过夜后，凝胶达到平衡尺寸，可使用定制模具切割成与标准培养板孔匹配的均匀圆片（图2）。转移至培养板后，通过细胞形态评估胶原包被质量和细胞接种效果。如图3所示，成功接种的 SLC...

讨论

细胞外基质的力学特性在调控干细胞行为中起着根本性作用，然而用于系统研究生殖细胞中这些效应的工具仍然有限。我们之前的研究表明，衰老过程中病理性基质硬化通过Piezo1/ROS/Gli1轴破坏干细胞样Leydig细胞（SLC）的稳态，导致睾酮水平下降¹⁰。基于这一发现，我们开发了该聚丙烯酰胺水凝胶实验方案，以提供一个标准化且可重复的平台，用于研究基底刚度如何直接调控SLC功能。该方法能够制备出覆盖生理至病理刚度范围（1–100 kPa）的水凝胶，使研究人员可在体外重现年轻和衰老睾丸的力学微环境。

聚丙烯酰胺水凝胶的操作简便。此外，该实验方案需要使用一些特殊设备，例如紫外交联仪，以及用于刚度验证的流变仪或原子力显微镜，而这些设备并非所有实验室都具备。该模型在水凝胶制备（过夜）、表面活化（1小时）和胶原蛋白包被（过夜）后即可用于实验；细胞接种的具体时间可根据实验室的工作安排和实验需求进行调整。由于这些水凝胶与多种常规下游检测方法兼容，其应用领域可十分广泛，包括免疫荧光染色、Western印迹分析、基因表达研究所需的RNA提取以及激素分泌水平测...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Sigma-Aldrich	Cat#A6283	大鼠尾胶原的稀释液（0.02 M）
丙烯酰胺	生工生物	Cat#A100341-0500	聚丙烯酰胺凝胶制备用单体
过硫酸铵（APS）	生工生物	Cat#A100486-0100	凝胶聚合引发剂
B27添加剂	Invitrogen	Cat#A1486701	成分明确的补充剂，富含抗氧化剂和激素；支持神经元和干细胞存活（2% v/v）
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Invitrogen	Cat#13256029	促有丝分裂生长因子；促进干细胞样细胞（SLC）增殖和干性维持（20 ng/mL）
双丙烯酰胺	上海源叶生物科技	Cat#S14002	聚丙烯酰胺凝胶交联剂
鸡胚提取物	US Biologicals	Cat#C3999	富含生长因子和营养物质；支持干细胞样细胞（SLC）生长和活力（5% v/v）
Ⅰ型胶原蛋白（来自大鼠尾）	YEASEN	Cat#40125ES50	包被经磺基-SANPAH活化的聚丙烯酰胺水凝胶表面，以促进干细胞样细胞（SLC）黏附和培养
IV型胶原酶	Gibco	Cat#17104-019	在DMEM/F12中配制成1 mg/mL用于睾丸组织消化
CYP11A1抗体	GeneTex	Cat#GTX56293	用于蛋白质印迹（western blotting）
地塞米松	Sigma-Aldrich	Cat#D1756	糖皮质激素受体激动剂；支持干细胞样细胞（SLC）增殖和干性维持（1 nM）
DMEM/F12培养基	Gibco	Cat#11320033	用于组织消化、洗涤及干细胞样细胞（SLC）培养的基础培养基
表皮生长因子（EGF）	PeproTech	Cat#AF-100-15	刺激干细胞样细胞（SLC）增殖并维持未分化状态（20 ng/mL）
胎牛血清（FBS）	VISTECH	Cat#SE100-011	使用浓度为10%，用于终止胶原酶活性
Fiji	N/A	https://imagej.net/Fiji	图像分析软件
GADPH抗体	Proteintech	Cat#60004-1-Ig	用于蛋白质印迹（western blotting）
凝胶消化酶	精准生物	Cat#GXDLFA	用于睾丸组织消化和干细胞样细胞（SLC）分离的酶混合物
HEPES	Cytiva	Cat#SH30237.01	缓冲液，用于维持pH值在7.0–7.4
HSD3β抗体	Santa Cruz	Cat#sc-515120	用于蛋白质印迹（western blotting）
Influx细胞分选仪	BD	https://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠（ITS）	Sigma-Aldrich	Cat#11074547001	促进细胞存活、葡萄糖摄取和抗氧化防御（5 μg/L）
KnockOut血清替代物（KSR）	Gibco	Cat#10828-028	干细胞样细胞（SLC）培养基中的血清替代品
LIF（白血病抑制因子）	Millipore	Cat#LIF1010	维持干细胞多能性和自我更新的细胞因子（1 ng/mL）
小鼠睾丸	本文	N/A	从小鼠C57BL/6中分离获得
小鼠睾酮ELISA试剂盒	菲恩生物	Cat#40203ES80	用于定量培养上清液中的睾酮含量
小鼠：C57BL/6	深圳菲鹏生物	N/A	用于睾丸采集的小鼠品系
小鼠：睾丸干细胞样间质细胞（SLCs）	本文	N/A	从小鼠睾丸中分离的原代细胞
N2添加剂	Invitrogen	Cat#17502001	成分明确的无血清添加剂，支持神经细胞和干细胞培养（1% v/v）
非必需氨基酸	HyClone	Cat#SH30050.03	为蛋白质合成和细胞代谢提供氮源（1% v/v）
抑瘤素M（OSM）	PeproTech	Cat#300-10T	参与干细胞样细胞（SLC）分化调控和间质细胞成熟的细胞因子（20 ng/mL）
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	Cat#10010023	洗涤和重悬缓冲液
血小板源性生长因子（PDGF）	PeproTech	Cat#100-14B	支持细胞增殖、迁移和存活（20 ng/mL）
Prism 9.0	GraphPad	https://www.graphpad.com/	用于统计分析和绘图的软件
StAR抗体	Proteintech	Cat#67130-1-Ig	用于蛋白质印迹（western blotting）
Sulfo-SANPAH	MACKLIN	Cat#102568-43-4	用于凝胶表面活化的异双功能交联剂
TEMED	Phygene	Cat#PH0341	聚合催化剂
β-巯基乙醇	Invitrogen	Cat#21985023	减轻氧化应激，支持细胞在培养中的生长（0.1 mM）