一种用于研究炎症诱导代谢改变的吡罗昔康加速型白细胞介素-10基因敲除小鼠肠炎模型

摘要

本方案采用吡罗昔康加速白细胞介素（IL-10）基因敲除小鼠模型中结肠炎的发展。该方案可确保结肠炎进程的同步性，从而获得严格且可重复的实验结果，且结果不受性别、背景品系或动物饲养条件的影响。该模型可用于研究肠道炎症期间的代谢改变，具有重要应用价值。

摘要

炎症性肠病（IBD）是一种影响全球超过一千万人的消化道慢性炎症性疾病。尽管已有大量研究聚焦于IBD的免疫机制及其后果，但对黏膜炎症如何导致代谢紊乱（包括体重减轻和食欲下降）的理解仍较为有限。本文作者描述了一种在白细胞介素-10基因敲除（IL-10-KO）小鼠中使用吡罗昔康加速诱导肠炎的小鼠模型，用于研究炎症引起的代谢失调。已知IL-10-KO小鼠会自发发展为肠炎，并对由感染或药物触发的肠炎具有更高的易感性。然而，已有报道指出，动物饲养环境和遗传背景可能成为该模型中结肠炎发展的混杂因素。吡罗昔康是一种非甾体抗炎药（NSAID），已被证明可通过增加黏膜对管腔细菌的暴露，从而在动物模型中诱发或加速肠炎的发生。在本实验方案中，雄性和雌性IL-10-KO小鼠被给予含吡罗昔康的强化饲料，以替代常规饲料。每日测量食物摄入量和体重，以反映全身性代谢变化，同时记录肠炎的临床表现，如腹泻和直肠出血。该方案高效且可重复，能够在多只小鼠中同步诱导肠炎，从而允许在炎症性肠病模型中评估代谢失调情况。未来利用该方案的进一步研究可探讨肠炎对其他代谢紊乱组分的影响，例如能量消耗和体成分的变化，揭示炎症性肠病与宿主代谢之间更广泛的关联。

引言

克罗恩病和溃疡性结肠炎统称为炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD），是一类以黏膜炎症为特征的胃肠道慢性自身免疫性疾病，临床表现包括腹痛、体重减轻、便血和腹泻。全球有数百万人受此病影响，其中以西方化社会的患病率最高¹。在美国，估计有超过300万人患病^2,3，且发病率和患病率呈上升趋势，尤其在儿童和年轻人中更为明显^4,5。

IBD 发病机制的确切机理尚未完全阐明，但普遍认为该疾病是由于遗传易感个体对肠道微生物群产生过度免疫反应所致。调节炎症反应的细胞因子在维持肠道稳态以及 IBD 的发生发展中起着关键作用。其中，白细胞介素-10（IL-10）是一种研究较为深入的抗炎细胞因子，可通过调节免疫反应的先天性和适应性免疫两个分支，在人体内帮助维持免疫稳态^6,7。值得注意的是，在极早发 IBD（VEO-IBD）婴儿患者中已发现 IL-10 及其受体（IL-10RA/B）的多态性，这类患者通常在出生后最初数月内即出现肛周病变⁸。这一关联性在针对克罗恩病成人患者的大规模外显子组测序研究中进一步得到支持，该研究将 IL-10RA 鉴定为非单基因遗传性 IBD 的疾病易感位点⁹。此外，在 VEO-IBD 患者中还发现了一种涉及 IL-10 中和抗体的非遗传性通路，进一步凸显了该通路在维持黏膜免疫稳态中的重要性¹⁰。

基于人类研究中关于IL-10在炎症性肠病（IBD）中作用的证据，已开发出白细胞介素-10基因敲除（IL-10-KO）小鼠模型，用于研究IL-10在IBD中的功能。已知IL-10-KO小鼠在受到刺激时会产生过度的CD4+ Th1反应，并在8–12周龄时自发发展为肠结肠炎¹¹。然而，在缺乏促发因素的情况下，IL-10-KO小鼠自发性肠结肠炎的发展可能具有不可预测性^12,13,14，其表现取决于遗传背景、肠道微生物组成以及饲养条件^15,16。因此，采用一种可靠的结肠炎诱导方案对于IL-10-KO模型的实际应用至关重要。以往研究曾使用非甾体抗炎药（NSAIDs）如吡罗昔康来诱导IL-10-KO小鼠发生肠结肠炎^17,18。然而，这些研究主要关注免疫学改变，对肠结肠炎对代谢的影响或性别在结肠炎严重程度中的作用则相对较少涉及¹⁹。本文作者描述了使用添加吡罗昔康的饮食诱导IL-10-KO小鼠发生肠结肠炎的方法，并利用雄性和雌性小鼠对该模型中的代谢紊乱及黏膜炎症反应进行了表征。该方案通过检测体重和食物摄入量来反映整体代谢变化，同时评估结肠炎的临床表现以及组织病理学和转录组学变化以反映黏膜炎症情况。这一高效且可重复的模型为研究IBD与宿主代谢之间的关联提供了有价值的工具。

方案

所有动物实验均按照德克萨斯大学西南医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行，符合《实验动物照护与使用指南"》的要求[批准编号：2017-102011]。安乐死操作依照机构指南执行。所进行的操作无需麻醉。材料的具体信息详见材料表。

1. 在IL-10基因敲除小鼠中建立吡罗昔康加速的肠炎模型

1. 在12小时光照循环的特定病原体-free（SPF）设施中饲养IL-10-KO小鼠，并提供 随意摄取 自由摄取饲料和水。
2. 将7至8周龄、年龄和性别匹配的小鼠 individually 置于独立通气隔离笼（microisolator cages）中饲养。在实验开始前，让小鼠适应单只饲养和每日抓取操作至少一周。
   注意：确保体重数据 >20 克（雄性）或 >雌性小鼠体重为17 g，且无打斗造成的伤口。
3. 将小鼠分为实验组和对照组。对于实验组，用添加吡罗昔康的饲料替代标准饲料；对于对照组，提供新鲜的标准饲料。每个笼子的饲料盒中加入50 g饲料。
   注意：每组每种性别至少分配五只小鼠。含吡罗昔康的强化饲料（200 ppm）由Teklad公司使用研究人员提供的吡罗昔康制备，用于生产定制的实验动物饲料。为尽量减少批间差异，建议同一实验中的所有动物均使用同一批次生产的饲料。在条件允许的情况下，不同实验之间也应使用同一批次饲料，以提高实验的可重复性。

2. 体重与摄食行为的监测

1. 使用分析天平记录每只小鼠的体重。每天在同一时间逐只称量小鼠体重，连续7天。将每日体重以第0天（设定为100%）基础体重的百分比形式报告。
   注意：若体重减轻超过20%，表明小鼠承受过度应激，有即将死亡的风险。一旦达到此阈值，应实施安乐死。
2. 使用分析天平记录每笼中添加吡罗昔康的饲料和标准饲料的初始重量。
3. 随后，每天在同一时间测量每笼饲料槽中剩余饲料的重量，连续7天。
4. 通过用前一天的饲料重量减去当日剩余饲料重量，计算每日饲料消耗量。
   注意：应定期检查饲料量，若低于10 g应及时补充。吡罗昔康饲料的适口性不影响摄食量，其摄食量应与标准饲料相近。

3. 疾病活动度的监测

1. 在第0天和第7天，目视检查每只小鼠的粪便颗粒，判断粪便中是否存在血液。
2. 若未见明显血液，取一粒粪便涂抹于检测试纸上，加入提供的显色试剂进行粪便隐血试验。根据表1对结果进行评分。
3. 在第0天和第7天，目视检查新排出的粪便颗粒以评估粪便性状。可使用平头镊子辅助判断粪便性状。根据表1对结果进行评分。
4. 在第0天和第7天，通过观察肛周区域评估直肠脱垂程度。根据表1对结果进行评分。
5. 按上述方法测量体重。根据表1对结果进行评分。
   注意：疾病活动指数（DAI）评分应由同一名研究人员以盲法在整个实验过程中完成，以确保一致性，减少观察者偏倚，并提高评估的可靠性。

4. 结肠组织的采集

1. 按照文献报道的方法，通过 CO₂ 窒息结合颈椎脱位处死小鼠²⁰。
2. 将小鼠置于仰卧位，并用 70% 乙醇喷洒腹部腹侧。
3. 用镊子提起皮肤，使用手术剪沿正中线剪开，暴露腹膜腔并定位结肠。
4. 通过钝性分离暴露结肠和盲肠，整块切除结肠（en bloc），包括盲肠和肛管组织。
5. 将结肠置于平坦表面，去除所有结缔组织。
6. 测量并记录结肠长度。
7. 测量结肠长度后，在盲肠-结肠交界处剪切，移除盲肠。
8. 准备一支 10 mL 注射器，内含磷酸盐缓冲液（PBS），并连接可重复使用的 22 号球头不锈钢灌胃针。将针头插入结肠，冲洗肠腔内容物。
9. 将冲洗后的结肠放入含有 PBS 的培养皿中，再次冲洗以去除残留内容物。待内容物完全清除后，用于后续实验分析。

5. 组织学分析

1. 将结肠平放在玻璃载片上。用镊子从远端开始将组织自身卷绕，形成“瑞士卷”状。以此方式，远端/肛端将位于内层卷中，而近端区域则延伸至外层卷。
2. 使用27号针头将卷好的结肠固定，以维持其卷曲状态，并将其放入包埋组织盒中。
3. 为固定组织，将组织盒浸入10%缓冲福尔马林溶液中，在4 °C下固定16小时。
   警告：10%福尔马林接触皮肤有害，可导致严重皮肤灼伤和眼部损伤。操作时应谨慎，佩戴防护手套和护目镜。残留的福尔马林应按照机构规定妥善处理。
4. 福尔马林固定后，将组织进行石蜡包埋处理，并切片后贴附于玻璃载片上。
   注：样品应提交至具备相应设备的组织学实验室，以完成组织盒的石蜡处理、卷片切片、载片贴附及苏木精-伊红染色。
5. 按照既定方案对组织切片进行苏木精-伊红（HE）染色²¹。
6. 根据表2中描述的组织学评分系统，评估每张切片中的以下组织学特征：肠炎引起的组织损伤、固有层炎性细胞浸润以及受累面积百分比。将每张切片中的各项评分相加，得出总分（表2）。
   总分 = 特征 × 受累程度（组织损伤） + 特征 × 受累程度（固有层炎性细胞浸润）  （1）
7. 组织损伤和细胞浸润的代表性组织病理学图像可参见Erben等人的发表文献²²。
   注：组织学评分应以盲法进行，最好由经过培训的病理学家完成，以确保评估的一致性和可靠性。

6. 甲醛固定石蜡包埋组织的免疫荧光染色

1. 将组织切片放入切片架中，并置于55 °C的切片烘干机中1小时，以熔化石蜡。
2. 将切片放入染色架中，依次将染色架浸入含二甲苯的染色缸中3分钟。重复此步骤3次。
3. 将染色架浸入含100%乙醇的染色缸中3分钟。重复此步骤3次。
4. 将染色架浸入含95%乙醇的染色缸中3分钟。
5. 将染色架浸入含80%乙醇的染色缸中3分钟。
6. 将染色架浸入含去离子水（DI水）的染色缸中5分钟。
   注意：由于二甲苯蒸气的存在，所有前述步骤必须在通风橱中进行。操作时应佩戴防护手套和护目镜，并谨慎处理。残留的二甲苯应根据机构规定妥善处置。
7. 将切片转移至切片架中，并浸入含1×柠檬酸修复液的染色缸中。
8. 将染色缸放入染色盘支架中。
9. 将染色盘支架放入压力锅中。
10. 在压力锅中加热15分钟。
11. 从压力锅中取出切片，并使其冷却至室温。
12. 在湿盒中，每张切片加入300 µL封闭缓冲液（含3.5%山羊血清的PBS溶液），孵育1小时。确保组织完全被封闭缓冲液覆盖。
13. 在湿盒中，每张切片加入300 µL用封闭缓冲液稀释的一抗溶液，在4 °C孵育16小时。确保组织完全被一抗覆盖。使用的一抗为：Anti-S100A8/S100A9（1:500）。
    注意：一抗的稀释比例因试剂而异，应遵循供应商的推荐说明。
14. 将切片在染色缸中依次浸入PBS溶液中，每次5分钟，重复3次进行漂洗。
15. 在湿盒中，每张切片加入300 µL用封闭缓冲液稀释的荧光二抗溶液，在室温孵育1小时。确保组织完全被二抗覆盖。使用的荧光二抗为：山羊抗兔Alexa Fluor 555（1:150稀释）。
    注意：自此步骤起，切片应避光保存，以防止荧光染料发生光漂白。二抗的稀释比例因试剂而异，应遵循供应商的推荐说明。
16. 将切片在染色缸中依次浸入PBS溶液中，每次5分钟，重复3次进行漂洗。
17. 将切片浸入用PBS按1:5000稀释的Hoechst染色液中，染色20分钟。
18. 将切片在染色缸中依次浸入PBS溶液中，每次5分钟，重复3次进行漂洗。
19. 用无磨损性纸巾小心擦去切片表面残留的PBS。每张切片加入50 µL抗荧光淬灭封片剂，并加盖盖玻片。

7. RNA 提取

1. 将整个结肠或结肠片段在液氮中速冻，然后于 -80 °C 保存。或者，将其浸入 1.5 mL RNALater 保存液中，并按照制造商说明进行储存。
2. 解冻先前冷冻的结肠组织，置于平坦表面。使用手持式匀浆器对组织进行破碎和均质化处理。
3. 使用试剂盒提取 RNA，并遵循制造商提供的操作说明。
4. 使用分光光度计测定 RNA 浓度。A₂₆₀/A₂₈₀ 比值> 1.8 且 A₂₆₀/A₂₃₀ 比值在 2.0–2.2 范围内，表明 RNA 纯度符合要求。
5. 进行逆转录反应，随后使用 SYBR Green 插入染料进行定量 PCR（qPCR）。
6. 使用定量分析平台或类似仪器分析结果。

结果

雄性和雌性IL-10-KO小鼠在短期摄入含吡罗昔康强化饮食后均会发展为肠结肠炎（图1A–E）。在第2天时，接触吡罗昔康的小鼠体重下降程度显著高于同性别普通饲料喂养的对照组，且不同性别的体重下降程度相似（图1B）。在整个吡罗昔康暴露及肠结肠炎发展过程中，每日表观食物摄入量保持不变，与标准饲料摄入量相近，表明该模型中的体重下降并非主要由摄入减少引起，而是由促进代谢消耗的其他因素所致（图1C）。

为了进一步研究肠道炎症的进展，通过体重减轻、粪便潜血、粪便性状以及直肠脱垂程度的综合评分来评估疾病活动度。改良的疾病活动指数（DAI）在基线期和第7天进行评估，第7天的评分结果见图1D。此外，在吡罗昔康暴露的小鼠中观察到的肠炎发展呈现出死亡率升高的强烈趋势，尽管该差异未达到统计学显著性（p = 0.12；图1E）。在此模型中，早期死亡继发于小鼠达到人道终点（体重减轻 > 20%），且雄性小鼠更易受影响（图1E）。如果死亡率是实验拟观察的终点指标，可考虑使用比本研究更多的实验动物。在本研究中，作者采用了完成研究所需的最少动物数量，同时兼顾了预期的死亡率以确保统计效能。

结肠缩短是小鼠结肠炎严重程度相关的一个特征。在取材时，饲喂吡罗昔康饮食的雄性和雌性IL-10-KO小鼠的结肠均比饲喂普通饲料的小鼠更短（图 2A–B）。经组织学评估，饲喂吡罗昔康小鼠的结肠显示出上皮损伤和免疫细胞浸润增加，这些改变与结肠炎相关（图 2C）。这些发现反映为更高的组织学评分（图 2D）。此外，还评估了参与人类炎症性肠病（IBD）及小鼠结肠炎模型的促炎细胞因子的转录水平²³。与先前报道一致，饲喂吡罗昔康的IL-10-KO小鼠结肠在转录水平上表现出促炎细胞因子的显著上调（图 3A–D）。值得注意的是，这种转录变化在饲喂普通饲料的IL-10-KO小鼠或饲喂吡罗昔康强化饮食的野生型（WT）小鼠中均未观察到，表明该转录特征是由IL-10缺乏与吡罗昔康共同作用所致，而非单一因素引起。最后，作者证实，在吡罗昔康处理小鼠的结肠中观察到的转录特征与结肠黏膜中钙卫蛋白染色增强相关（图 3E）^24,25。

图1IL-10基因敲除小鼠中吡罗昔康加速的肠炎 小鼠 (A) 实验方案示意图。B) 体重，(C) 食物摄入量，(D7天疾病活动指数（DAI），E) 接受含吡罗昔康饮食或普通饮食的8周龄雄性与8周龄雌性IL-10-KO小鼠的生存曲线。雄性对照组：n = 5，雄性吡罗昔康组：n = 5，雌性对照组：n = 6，雌性吡罗昔康组：n = 6。B), (C），以及（D）。雄性对照组：n = 6，雄性吡罗昔康组：n = 10，雌性对照组：n = 6，雌性吡罗昔康组：n = 7（E). * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001，通过（图中）雄性（上标星号）与雌性（下标星号）小鼠的成对比较得出B）。统计分析采用（中的双尾非配对 t 检验进行。B), (C），以及（D）以及（中的对数秩检验E）。图中均值以平均值表示，误差线代表平均值的标准误（SEM）。在柱状图中，单个测量值以抖动散点图（jitter plots）表示。 请点击此处以查看该图的放大版本。

图 2：结肠缩短及组织学评估。（A）接受吡罗昔康饮食（上方）或普通饮食（下方）7天的8周龄雄性和雌性白细胞介素-10基因敲除（IL-10-KO）小鼠的代表性结肠标本。比例尺 = 1 cm。（B）第7天的结肠长度（雄性对照组：n = 5，雄性吡罗昔康组：n = 5，雌性对照组：n = 6，雌性吡罗昔康组：n = 6）。（C）苏木精-伊红（HE）染色结肠组织的代表性图像。比例尺 = 100 µm。（D）第7天的组织学评分。（B）和（D）中采用双尾非配对t-检验。图中显示均值及代表标准误（SEM）的误差线。柱状图中，单个测量值以抖动散点图表示。无显著性差异（NS），* p ≤ 0.05，*** p ≤ 0.001，**** p ≤ 0.0001（通过成对比较分析）。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：吡罗昔康加速性肠结肠炎中的炎症变化。 8周龄野生型（WT）和白细胞介素-10基因敲除（IL-10-KO）雄性小鼠结肠组织中收获时的定量RT-PCR结果：（A）Tnf，（B）Il6，（C）Il1b，以及（D）Ifng。A–D图中，WT吡罗昔康组n = 7，KO吡罗昔康组n = 6，KO对照组n = 3。（E）8周龄IL-10-KO小鼠结肠组织收获时钙卫蛋白免疫荧光染色的代表性图像。统计分析采用双尾非配对t-检验。图中显示均值及代表均值标准误（SEM）的误差线。柱状图中，单个测量值以抖动图（jitter plots）表示。（E）中的比例尺 = 200 µm。无显著性差异（NS），* p ≤ 0.05，** p ≤ 0.01，*** p ≤ 0.001（通过成对比较得出）。请点击此处查看此图的放大版本。

评估项目	评分
体重变化	0 – 无变化
	1 – 减轻 1–5%
	2 – 减轻 6–10%
	3 – 减轻 11–20%
	4 – 减轻超过 20%
粪便性状	0 – 正常
	1 – 软便但成形
	2 – 糊状便（非水样）
	4 – 腹泻（水样便）
出血	0 – 无
	2 – 粪便隐血阳性
	3 – 粪便表面可见血液
	4 – 直肠大量出血
直肠脱垂	0 – 无
	1 – 有
总评分	总评分：各评估项目得分之和

表1：疾病活动度评分（DAI）。 一种通过体重减轻、粪便性状、便血和直肠脱垂来确定疾病活动度的评分系统。改编自 Sifuentes-Dominguez 等人²⁶。

组织损伤					固有层炎性细胞浸润
特征		累及范围			特征		累及范围
0	无	1	表面的1–25%		0	少见	1	表面的1–25%
1	偶见	2	表面的26–50%		1	增多，部分中性粒细胞	2	表面的26–50%
2	黏膜糜烂和溃疡	3	表面的51–75%		2	黏膜下层出现炎性细胞簇	3	表面的51–75%
3	肠壁深层广泛损伤	4	表面的76–100%		3	透壁性细胞浸润	4	表面的76–100%

表2：组织学评分系统。 用于评估组织学变化和损伤的评分系统。改编自 Sifuentes-Dominguez 等人²⁶。

讨论

炎症性肠病是一种复杂的多基因疾病，其临床前模型是解析参与炎症性肠病发病机制的通路以及开发新型诊断和治疗策略的宝贵工具。目前，许多炎症性肠病的临床前模型依赖于化学诱导方法，例如葡聚糖硫酸钠（DSS）、氧化偶氮酮（oxazolone）和三硝基苯磺酸（TNBS），因其操作简便而被广泛使用。此外，也可采用可自发性结肠炎的遗传模型。其中，IL-10基因敲除（IL-10-KO）模型尤为有价值，因为IL-10信号通路的基因变异已知可导致人类肠道炎症，且IL-10-KO小鼠会自发产生慢性肠结肠炎，其病理特征与人类疾病相似。然而，该模型的一个主要局限在于无法解释表型的变异性。尽管肠结肠炎可自发产生，但其发病时间可能因小鼠品系背景和动物饲养条件的不同而存在差异²⁷。

通过将化学暴露与遗传模型相结合，本文所述方案提供了一种可靠且可重复的小鼠实验性结肠炎模型。在IL-10基因敲除小鼠中，吡罗昔康可加速肠炎的发生，摄入含吡罗昔康的饲料后7天内即可出现疾病表型。该方案可实现结肠炎发展的同步化。该模型重现了其他常用小鼠结肠炎模型中观察到的多种特征，包括体重减轻、粪便潜血、腹泻、结肠缩短、组织学损伤以及转录水平的变化。此外，该模型在广泛使用的C57Bl/6J品系中同样具有可重复性，这使得通过在该品系中相对容易地构建携带额外突变的小鼠，来研究与炎症性肠病相关的其他基因缺陷成为可能。

本文所述模型为研究肠道炎症期间的代谢变化提供了一种有用的工具。在该模型中，暴露于吡罗昔康并发展为加速性肠炎的小鼠仍能正常进食，每日摄食量无明显下降。这表明该模型中的体重减轻并非由进食障碍所致，而是由其他因素引起。尚需进一步研究以确定这些结果是否源于炎症导致的能量消耗增加、腹泻引起的热量过度丢失，或产热功能受损。此外，雄性和雌性小鼠表现出相似的疾病严重程度模式，这一发现与先前在IL-10-KO和DSS模型中的观察结果形成对比^28,29,30。

为确保该模型的可重复性，有几个重要的故障排除步骤需要注意。首先，小鼠在接触吡罗昔康之前，应提前一周适应每日的抓取和观察操作，以防止因应激导致的体重下降。其次，每个笼子中饲养的小鼠不应超过三只，且仅选择共养关系和谐的小鼠进入实验。表现出打斗行为或具有打斗伤痕的小鼠更容易发生结肠炎，并可能在实验结束前死亡^31,32。第三，若需在整个实验过程中监测食物摄入量，应将小鼠单独饲养，以便准确测量饲料消耗量。此外，饲料槽中应仅放置大块且完整的饲料颗粒，防止其碎裂落入垫料中，从而影响摄入量的测定结果。本文所述的食物摄入量定量方法符合已发表的啮齿类动物摄食指南³³。最后，实验期间应避免更换笼具，因为突然的环境变化可能导致食物摄入量减少1–2天，尤其是在幼龄小鼠中更为明显。

本方案存在若干局限性。首先，对代谢改变的评估仅限于体重和摄食量，而未评价其他系统性代谢指标，如呼吸交换比（RER）、能量消耗和体力活动。此外，体重减轻的潜在机制尚未探究，因此摄食减少、能量消耗改变、吸收不良以及与肠道炎症相关的其他因素各自所起的作用仍不明确。其次，仅采集并分析了结肠组织，而未检查其他参与代谢调控的器官，包括脂肪组织、肝脏和骨骼肌。第三，本方案采用的是C57BL/6 IL-10-KO小鼠建立的，与其他遗传背景的小鼠相比，其对结肠炎的易感性可能不同。尽管存在这些局限性，该方案可便捷地进行调整，以纳入更全面的代谢表型分析和肠外组织检测，从而深入研究体重减轻的机制以及肠道炎症与系统性代谢改变之间的关系³⁴，或用于评估新型抗炎纳米材料³⁵。此外，该方法也应适用于其他IL-10-KO小鼠品系，但需开展进一步的验证研究。

综上所述，作者报道了一种高效且可重复的实验方案，可同时在多只IL-10-KO小鼠中诱导肠结肠炎，并能够评估其摄食行为。未来还需进一步研究该模型中肠结肠炎对能量消耗和体成分的影响，从而揭示炎症性肠病（IBD）与宿主代谢之间更广泛的关联。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 缓冲福尔马林	StatLab	28600-1	1 加仑
27 号针头	BD	305109
抗S100A8 + S100A9抗体	Abcam	AB288715
平衡	Fisher Scientific	S94792D	Fisher Science Education 便携式天平，300 g
柠檬酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
去离子水	Fisher Scientific	STLSL301
解剖镊	Fisher Scientific	22-327379
乙醇，100%（200 proof）	Fisher Scientific	NC1675398	Pharmco Products 乙醇 200 证明
乙醇，190 proof，95%	Fisher Scientific	AC615110010
80% 乙醇	Fisher Scientific	T08204K7
EZ-Quick 染色缸	IHC 世界	IW-2511	染色缸
EZ-Quick 染色架	IHC 世界	IW-2512	载玻片架
饲喂针	Fisher Scientific	NC9924986	22号，25毫米
精细剪刀	Fisher Scientific	14060-11
平头镊子	Fisher Scientific	21-125-109
山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 555	赛默飞世尔科技	AB_2535849
手持式匀浆器	Fisher Scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/单张检测卡 - CLIA豁免
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 基因敲除小鼠	杰森实验室	品系编号：002251	IL10基因敲除小鼠，基因型：B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC小鼠笼具	阿伦镇	小鼠 500
液氮	Airgas	NI UHP300
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12541033
Nanodrop	赛默飞世尔科技	ND-ONE-W
正常山羊血清	Vector Laboratories	S-1000-20
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich	D8537
培养皿	Fisher Scientific	FB0875713
吡罗昔康	Sigma Aldrich	P0847	供应至Inotiv以制备定制动物饲料
含吡罗昔康的强化饲料	Inotiv	自定义	200 ppm
引物：小鼠 GAPDH 正向	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' 正向引物
引物：小鼠 GAPDH 反向引物	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' 反向引物
引物：小鼠 IFN-γ 正向	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' 正向引物
引物：小鼠 IFN-G 反向	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' 反向
引物：小鼠 IL-10 正向	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3'（通用）
引物：小鼠 IL-10 反向	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3'（野生型反向）
引物：小鼠 IL-10 反向 (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3'（突变型反向）
引物：小鼠 IL-1β 正向	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' 正向引物
引物：小鼠 IL-1B 反向	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' 反向引物
引物：小鼠 IL-6 正向	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' 正向引物
引物：小鼠 IL-6 反向	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' 反向引物
引物：小鼠 TNF 正向	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' 正向引物
引物：小鼠 TNF 反向	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' 反向引物
QuantStudio 7 Pro	赛默飞世尔科技	A43183
RNAlater 溶液	Invitrogen	AM7020	RNA稳定溶液，100 mL
RNeasy mini试剂盒	Qiagen	74104
SHURDry SD-II 玻片干燥仪	一般数据	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip 载玻片染色架	Fisher Scientific	22-038-494	染色架
SlowFade Gold 抗荧光淬灭试剂	Invitrogen	S36936
染色皿支架	BioSB	BSB7086
Staintray IHC 免疫组化切片染色系统	免疫组化世界	M918-1	免疫组化用湿盒
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green预混液	应用生物系统公司	A46109
Tintoretriever 压力锅	BioSB	BSB7008
组织包埋盒	Fisher Scientific	50-197-8152	Research Products International Corp 组织处理盒，粉色，每箱500个
二甲苯	Pharmco	399000000	1 加仑