高通量筛选L-乳酸高产菌株 Bacillus coagulans 利用自动化液滴微流控平台筛选突变体

摘要

本方案介绍了一种用于工业微生物的标准高通量筛选流程。该流程包括通过ARTP诱变构建突变体文库，利用自动化微流控技术进行正向液滴筛选，随后对筛选结果进行验证。该工作流程的可靠性已通过筛选高产B. coagulans菌株得到验证。

摘要

工业生物制造依赖微生物在工程化条件下高效合成目标产物。然而，野生型菌株由于其固有的代谢网络，通常缺乏实现这一目标的能力。因此，从大规模突变体文库中快速、准确地筛选高性能菌株，是工业微生物育种中的关键步骤。近年来，液滴微流控技术因其高通量、低消耗以及单细胞分隔能力而受到广泛关注，推动了多种单细胞分选系统的开发。本研究提出了一种基于自动化液滴微流控平台的工业微生物菌株高通量筛选方案。该集成化工作流程包含四个关键阶段：通过常压室温等离子体（ARTP）诱变构建突变体文库；在皮升级液滴中实现高效的单细胞包裹与可控微培养；精确皮升级注射荧光生物传感器，随后通过荧光激活液滴分选（FADS）分离含有高产变异体的液滴；以及通过微孔板和摇瓶发酵验证所分选的候选菌株。该完整且集成的筛选流程旨在作为标准化模板，其有效性通过分离高产L-乳酸的B. coagulans突变体这一具体实例得以验证。这一自动化、高通量的筛选平台为加速高性能菌株的工业育种提供了强有力的技术解决方案。

引言

工业生物技术利用微生物和酶作为生物催化剂，大规模生产高价值产品。与传统的化学制造方法相比，这种方法被认为更环保且高效。然而，微生物的天然代谢网络在进化过程中优先保障其自身的生存与繁殖，而非高效合成人类所需的产品。因此，通常需要通过高通量微生物育种来满足工业生产中严格条件的要求^1,2,3。该过程包括通过物理或化学诱变快速构建大规模的微生物突变体文库，随后对具有不同基因型的突变体进行培养和表型检测，并从中筛选出极少数优良菌株。然而，传统的基于平板和微孔板的筛选技术受限于操作繁琐、通量低以及成本高昂。这一瓶颈，加之耗材和试剂的大量消耗，导致微生物育种的整体效率较低^4,5。

近年来，液滴微流控技术已成为解决这一挑战的变革性方案。与荧光激活细胞分选（FACS）不同，FACS因分子会迅速从细胞周围扩散而不适用于分泌产物的筛选；而荧光激活液滴分选（FADS）则将单个细胞封装在皮升级、区室化的微反应器中^6,7,8。这种物理隔离可防止菌株间的竞争，实现分泌代谢物的局部富集，并可通过荧光生物传感器对其进行定量检测。因此，FADS已被证明是高通量筛选多种胞外产物（包括氨基酸、有机酸和酶）的理想平台。一个研究团队开发了基因编码的荧光生物传感器GECFINDER，并将其与FADS结合，成功筛选出高产苯丙氨酸的菌株，筛选效率提高了1000倍以上⁹。另一研究小组建立了基于基因编码生物传感器的荧光激活液滴分选平台，用于大肠杆菌（E. coli）中3-脱氢奎尼酸高产菌株的高通量筛选，优化后的FADS系统显著提高了筛选效率，并实现了产量显著提升的突变菌株的分离¹⁰。一些研究人员将FADS技术应用于Bst DNA聚合酶的改造，获得的突变体具有显著增强的热稳定性和链置换活性，并进一步应用于LAMP检测，使反应时间从40分钟缩短至10分钟¹¹。

然而，将这些技术进步转化为常规的工业菌株开发工作流程仍然具有挑战性。许多商用液滴微流控系统尽管硬件先进，但仍缺乏一套完整、直观且可重复的标准操作程序，以满足微生物表型筛选的需求。为弥补这一空白，本研究采用了一种集成了模块化流体控制、用户友好型软件和标准化芯片设计的自动化液滴微流控平台，为建立完全整合的筛选工作流程奠定了理想的技术基础。本研究以高产L-乳酸的B. coagulans菌株的高通量筛选作为验证案例。基于该液滴微流控平台，建立了包含四个关键顺序步骤的工作流程：（1）通过常压室温等离子体（ARTP）诱变构建多样性突变体文库；（2）在优化的B. coagulans生长及L-乳酸生产条件下，实现单细胞的高效封装及液滴内的可控微培养；（3）精确地向液滴中皮升级注射L-乳酸特异性荧光生物传感器，随后高速分选包裹高性能生产菌株的液滴；（4）通过摇瓶发酵对分选获得的候选菌株进行严格验证，确认其产量提升及遗传稳定性。本方案适用于从事工业微生物育种、需要对外分泌产物进行高通量筛选的研究人员和工程师。尤其适用于能够培养并分泌小分子代谢物或酶类的细菌。筛选平台必须配备与液滴微环境兼容的传感器，以实现对目标代谢物的特异性检测。对于具有特殊培养需求的菌株（如严格厌氧菌），可调整培养参数，优化并建立专用的培养策略。通过建立这一闭环式、标准化的筛选工作流程，本研究旨在为加速工业菌株育种提供一种强大且可转移的解决方案。

方案

本研究无需伦理批准。所有实验均使用纯微生物培养物进行，未涉及人类受试者或实验动物。有关本方案中所用材料的详细信息，请参见材料表。

1. 准备工作

注意：遵循生物安全操作规范。 B. coagulans 属生物安全一级生物体。操作时需佩戴手套和实验服。所有开放性操作均应在层流罩内进行。所有接触过活细胞的材料，废弃前须在121 °C下高压灭菌20分钟。

1. 菌种来源与保藏
   1. 从商业菌种保藏中心购买 B. coagulans ATCC 7050 的第二代斜面培养物。
   2. 取一环斜面培养物划线接种至种子培养基琼脂平板，于 50 °C 培养 24 h。挑取单菌落接种至液体种子培养基中，在 50 °C、200 rpm 条件下培养 12 h。
   3. 将上述培养物与无菌 40% 甘油混合，终浓度为 25%（v/v），分装后于 –80 °C 冻存作为菌种保藏液。每次实验时，取新鲜分装样品解冻，划线接种至种子培养基琼脂平板，于 50 °C 培养 24 h。
   4. 随后挑取单菌落接种至液体种子培养基，在 50 °C、200 rpm 条件下培养 12 h，用于后续诱变与筛选（补充图 1）。
2. 乳酸传感器
   1. 按照补充材料中所述方法表达并纯化 eLACCO1.1 传感器（补充图 2）¹²。
   2. 向纯化的传感器中添加 5%（v/v）甘油，于 –80 °C 保存。每次实验时，将一份样品置于冰上解冻，并立即用无菌 10 mM PBS（pH 7.4）稀释至工作浓度 0.1 mg/mL。
3. 培养基制备
   1. 种子培养基（g/L：葡萄糖 20，酵母提取物 5，胰蛋白胨 10，乙酸钠 2，柠檬酸钠 2，K₂HPO₄ 2，MgSO₄·7H₂O 0.2，MnSO₄·H₂O 0.05，FeSO₄·7H₂O 0.01）。葡萄糖单独配制成 200 g/L 母液，于 115 °C 灭菌 20 min。
      1. 其余组分于 121 °C 高压灭菌 15 min。冷却后加入无菌葡萄糖母液至终浓度 20 g/L，再过滤除菌微量元素。
      2. 完全配制好的培养基于 4 °C 保存，最多一周。用于菌种活化及接种物制备。
   2. 筛选培养基（g/L：葡萄糖 20，酵母提取物 6.66，NaCl 0.333，NH₄Cl 0.665，KH₂PO₄ 2，Na₂HPO₄ 4.46，MgSO₄ 0.12，CaCl₂ 0.074）。
      1. 葡萄糖单独于 115 °C 灭菌 20 min。盐类与酵母提取物混合物于 121 °C 高压灭菌 15 min。
      2. 冷却后加入无菌葡萄糖母液至终浓度 20 g/L。4 °C 保存，最多一周。用于液滴生成的水相以及液滴内 10 h 培养期间的培养基。
   3. 发酵培养基（g/L：葡萄糖 90，胰蛋白胨 13.33，酵母提取物 13.33，乙酸钠 0.67，NaCl 0.0133，MgSO₄·7H₂O 0.0133，MnSO₄·H₂O 0.0133，FeSO₄·7H₂O 0.0133）。
      1. 将葡萄糖配制成 500 g/L 母液，于 115 °C 灭菌 20 min。其余组分于 121 °C 高压灭菌 15 min。
      2. 冷却后加入无菌葡萄糖母液至终浓度 90 g/L。接种前加入无菌 CaCO₃ 粉末（4% w/v）以缓冲 pH。每日新鲜配制。用于微孔板初筛及摇瓶验证。
         注：所有培养基均使用蒸馏水定容至 1 L。用 1 M HCl 调节 pH 至 6.5。

2. 利用ARTP构建突变体文库

警告：ARTP 操作涉及高频等离子体和紫外灯。紫外辐射可导致眼睛和皮肤损伤。等离子体放电会产生臭氧和高温。等离子体工作时，务必保持腔室门关闭。实验时需穿戴实验服并佩戴防紫外线护目镜。仅使用纯度为 99.999% 的氦气；确保环境通风良好。每次诱变操作后，应用浸有 75%（v/v）乙醇的无尘布擦拭工作台面及诱变腔室内壁。75% 乙醇高度易燃，应远离明火、火花和高温表面。

1. 建立OD₆₀₀与活细胞浓度之间的标准曲线。
   1. 将一株B. coagulans单菌落接种至种子培养基中，在50 °C、200 rpm条件下培养12 h，直至菌液进入对数中期。
   2. 将细菌悬液进行连续梯度稀释，稀释倍数分别为10⁴、10⁵和10⁶。
   3. 用移液器吸取每种稀释液100 µL，均匀涂布于种子培养基琼脂平板上，每种稀释度设三个重复。
   4. 将所有涂布好的琼脂平板置于50 °C培养24 h。
   5. 计数各稀释度的菌落形成单位（CFU）。
      注：校准结果显示，OD₆₀₀ = 0.5 对应约 1 × 10⁸ CFU/mL。利用此关系确定液滴包封的初始细胞密度（补充图3）。
2. 将B. coagulans培养至对数中后期，然后用新鲜种子培养基将新鲜种子培养物稀释至OD₆₀₀ = 0.05。
3. 在超净工作台内，准备八个无菌的小金属圆片和一个无菌的大金属圆片。将八个小圆片依次在酒精灯火焰上灼烧1分钟，放置于无菌的大圆片上，并静置冷却10分钟。
4. 使用微量移液器，将10 µL稀释后的细菌悬液均匀涂布于每个已冷却的小金属圆片表面。
5. 将承载接种后小圆片的大圆片转移至无菌培养皿中。
6. 开启ARTP仪器电源，启动主控屏幕。打开诱变室内的紫外灯。启动冷水机并预冷20分钟，直至温度稳定在20 °C。
7. 迅速打开诱变室门，将小金属圆片放入室内。
8. 使用无菌镊子，依次将每个小圆片转移至ARTP样品台。
   注：射频功率、氦气流速、喷嘴至样品距离及氦气纯度分别固定为120 W、10 SLM、2 mm和99.999%。氦气辐照时间分别设定为5、10、15、20、25和30 s。
9. 根据设定参数对每个小圆片进行ARTP诱变处理。辐照结束后，将所有圆片转移至含有10 mL复苏培养基的50 mL离心管中，在50 °C、200 rpm条件下振荡培养4 h，以促进细胞恢复与生长。
10. 致死率的测定。
    1. 将复苏后的菌液进行连续稀释，稀释梯度为10^-2至10^-6。
    2. 取每种稀释液100 µL涂布于种子培养基琼脂平板，每种稀释度设三个重复。
    3. 将所有平板在50 °C培养24 h。
    4. 计数菌落数量，并计算对应的CFU/mL。
    5. 使用以下公式计算致死率：
       ​   (1)
       注：每个时间点均需进行三次重复实验。本实验中ARTP的最佳诱变时间为20 s（补充图4）。

3. 自动化液滴微流控平台及耗材的组成

1. 驱动系统（图1）
   注意：该系统包含3个高精度压力控制器通道，压力范围为0–1000 mbar，压力响应时间< 50 ms（图1A）。
2. 成像系统
   注意：高速CMOS显微成像系统具备高速图像数据采集能力（≥ 2 GB/s），帧速率为0–20,000 fps，最高分辨率为1280 x 860。系统配备自动对焦功能，可实时观察液滴运动，并支持图像和视频的记录，可导出为多种格式，包括BMP、AVI、MP4和TIF。
3. 检测系统
   注意：该系统配备两束激光（488 nm和633 nm）和两个检测通道，用于荧光信号检测。
4. 主机控制系统
   注意：由自动化液滴微流控平台软件控制，系统集成了多个模块，包括流体驱动、显微成像、激发与检测、液滴生成、皮升级注射和分选。系统还支持实验数据的采集、记录、存储、显示和导出。部分自动化液滴微流控平台的操作单元如图所示（图1B）。
5. 耗材
   注意：本实验方案所用耗材包括：油相、样品和试剂的进样管（图2A）；液滴孵育用收集管（图2B）；液滴生成芯片（图2C）；液滴皮升级注射芯片（图2D）；以及液滴分选芯片（图2E）。

4. 液滴生成

警告：清洁自动液滴微流控平台。每次实验后，使用无绒布蘸取75%乙醇擦拭载物台、芯片架及任何可能溅洒的区域。清除残留的氟化油、细胞悬液或传感器溶液。

1. 单细胞包封。为了在14 pL液滴中获得λ = 0.1，需将细菌悬液稀释至OD₆₀₀ ≈ 0.04（OD₆₀₀=0.5对应1 × 10⁸ CFU/mL）。根据泊松分布：
      (2)
   当λ = 0.1时，90.5%的液滴为空，9.1%含有单个细胞，0.4%含有多个细胞。
   注意：在此实验中，实测单细胞包封效率为11.2%（补充图5）。可通过DAPI染色确定每个液滴中的细胞数量。当λ = 0.1且多细胞包封率超过1%时，应降低OD₆₀₀以减少含多个细胞的液滴比例。
2. 用移液器将300 µL氟化油加入油相进样瓶中。将500 µL细菌悬液加入水相进样瓶中。
3. 撕去覆盖液滴生成芯片表面的胶带。依次将油相瓶、样品瓶和收集瓶连接至芯片对应的孔位。
4. 将芯片放置于载物台上并固定。根据气路标识，依次将气管连接至各进样瓶。
5. 打开自动化液滴微流控平台软件。根据芯片上的箭头方向调节载物台移动旋钮，将视野移至液滴生成区域。
6. 在自动化液滴微流控平台软件的“液滴生成”界面点击“开始”（图3A）。在成像界面中，拖动“Z轴”和光源亮度滑块，调节图像清晰度与亮度。
7. 点击“+”和“-”按钮，调节“液滴速度”与“液滴大小”，以控制液滴生成速率和尺寸。
   注意：本实验中，液滴生成时油相压力和样品相压力自动设定为300 mbar和400 mbar，以实现1500 Hz的生成速率。在此条件下，液滴体积为14 pL，液滴直径的变异系数（CV）保持在5%以下，确保液滴尺寸均一，保障后续操作的可靠性。
8. 等待1分钟，待设备运行稳定且液滴生成状态一致后，迅速更换收集瓶以开始收集液滴。
   注意：在新的收集管中预先加入少量氟化油，覆盖聚四氟乙烯（Teflon）管下端口，确保液滴不直接接触管壁，防止融合。
9. 运行30分钟后停止液滴收集。在弹出窗口中点击“停止”以确认终止液滴生成。
10. 轻柔地将收集管从芯片上取下。将管子和收集瓶垂直放置，等待管内液滴进入收集瓶中。
11. 从载物台上取下芯片、油相进样瓶和水相进样瓶。用75%酒精擦拭载物台表面。液滴生成步骤至此完成。

5. 液滴培养

1. 向收集管中加入 1 mL 矿物油。
   注意：矿物油层覆盖液滴悬浮液，以最大限度减少蒸发并降低氧气暴露，同时仍允许兼性厌氧菌 B. coagulans 进行足够的气体交换。
2. 将收集管直立放入含有无菌水的 15 mL 离心管中。收集管盖子稍松，于 45 °C 培养 10 小时。
   注意：培养后，确保液滴直径的变异系数（CV）<10%，且未观察到液滴融合现象。若不符合上述标准，则弃用该批次。

6. 微液滴皮升级注射

警告：皮升注射过程中，仪器连接会向芯片电极施加高电压。电场可能导致严重电击。当高电压激活时，请勿使用金属工具或徒手接触电极或芯片表面。在处理芯片前，务必先关闭高电压输出。操作时应佩戴绝缘手套，并使用非导电工具。

1. 准备油相进样瓶。在超净工作台中，用移液器将300 µL氟化油加入油相进样瓶中。
2. 准备样品进样瓶。从含有液滴的收集管上取下进样瓶盖，并更换为新的瓶盖。
3. 修剪新进样瓶的尖端。从新进样瓶前端切下一小段，使其尖端能够伸入样品瓶液滴的液面以下。
4. 拧紧瓶盖。确保瓶盖牢固，以防泄漏。
5. 准备试剂入口小瓶。将500 µL乳酸传感器溶液加入试剂入口小瓶中。
6. 向试剂入口小瓶中加入 PBS。同时，向同一试剂入口小瓶中加入 500 µL 无菌 PBS 缓冲液。
   注意：本实验中添加 PBS 缓冲液以平衡液滴的 pH 值。乳酸传感器的最终工作浓度为 0.1 mg/mL，乳酸传感器的加载体积为 500 µL。
7. 使用刀片切开覆盖电极孔的胶带以暴露电极。将万用表调至通断测试模式，检测电路连接情况及芯片的短路状态。
   注意：如果万用表显示芯片电极的电路连接正常，则进行下一步操作；如果电路断开，请更换注射芯片并重新测试。
8. 使用万用表确认电路连接正常后，撕去芯片表面的胶带。依次将油瓶、样品瓶、试剂瓶和收集瓶连接到芯片的相应孔位。
9. 将芯片放置在载物台上并固定。根据气体通路标签，依次将气管连接到进样瓶。
10. 打开 自动化的液滴微流控平台软件。根据芯片上的箭头方向调节载物台移动旋钮，将视野移动至液滴芯片的电极区域。
11. 点击“开始“在”微滴皮升级注射自动液滴微流控平台软件的界面（图3B）。在成像界面中，拖动“Z轴并调节光源亮度滑块以调整图像清晰度和亮度。
    注意：此时，仪器会自动将油相泵压力调节至400 mbar，样品相泵压力调节至420 mbar，试剂注入相泵压力调节至450 mbar。
12. 在操作初期，导管中的一段空气将被排入芯片，这是一种持续数分钟的正常现象。
13. 等待液滴进入视野。点击“开始皮升注射此时，设备的电场将被激活。通过点击“+“和”-“按钮的”液滴速度“液滴间距”和“进样体积”
    注意：电场设定为默认最高档。若在融合过程中液滴于电场区域发生破裂，请切换至中档或低档。本实验中，液滴注入速率为 200 Hz。
14. 在高速图像显示软件中观察。若液滴能够以1:1比例稳定注入乳酸传感器中，等待5分钟使设备稳定。迅速更换收集瓶以开始液滴收集。
15. 注射稳定持续2小时后，点击“停止以结束液滴皮升级注射。
16. 轻轻将收集管从芯片上取下。将收集管和收集瓶垂直放置，等待管内的液滴进入收集瓶。

7. 液滴分选

警告：破乳剂具有刺激性，可引起皮肤和眼睛刺激。吸入或吞咽后也有害。操作时务必穿戴适当的个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。应在通风良好的区域或通风橱中操作破乳剂。废弃的破乳剂应收集于单独的、标识清晰的容器中，禁止倒入水槽。

1. 在超净工作台中，用移液器吸取 300 µL 氟化油并加入油相入口小瓶中。将含有微注射液滴的收集管的入口小瓶盖替换为新盖。
   注意：在进行液滴分选实验之前，取 5 µL 液滴并在荧光显微镜下观察。测量至少 200 个液滴的直径；仅当变异系数 CV < 10% 时方可继续。
2. 使用刀片划开覆盖电极孔的胶带以暴露电极。将万用表调至通断测试模式，检测电路连接及芯片短路状态。
3. 使用万用表确认电路连接正常后，撕去芯片表面的胶带。依次将油相小瓶、样品小瓶和分选收集小瓶连接至芯片对应的孔位。
4. 将芯片放置于载物台上并固定。根据气路标签，依次将气管连接至各入口小瓶。
5. 打开高速成像软件。根据芯片上的箭头方向调节载物台移动旋钮，将视野移至液滴芯片的电极区域。
6. 在自动液滴微流控平台软件的“液滴分选”界面中点击“开始”。在成像界面中，拖动“Z 轴”和光源亮度滑块，调节图像清晰度与亮度。
   注意：点击“开始”后，仪器会自动将油相泵压力调节至 300 mbar，样品泵压力调节至 190 mbar，从而实现约 100 Hz 的液滴通量。
7. 运行初期，导管中的一段空气将被排入芯片，此过程持续数分钟，属于正常现象。
8. 点击选择“激光”，并选择 488 nm 检测通道。
   注意：实验人员可根据实验检测设计选择 488 nm 激光、633 nm 激光，或两者组合使用。激光功率：20 mW。
9. 点击“数据记录”。仪器将开始采集液滴荧光信号（图 3C）。
   注意：采集 50,000 至 100,000 个液滴的荧光信号；仪器将自动对信号值进行排序，并生成荧光信号直方图。
10. 根据生成的荧光信号直方图，将分选阈值设定为总荧光信号的前 0.1%，收集荧光信号值高于该阈值的液滴。
    注意：本实验中，分选门设定为收集荧光强度 > 2750（a.u.）的液滴，对应于荧光信号最强的前 0.1% 液滴。
11. 再次点击“数据记录”。仪器将重新记录剩余液滴的荧光信号，并根据第 7.10 节设定的阈值对目标液滴进行分选。
    注意：剩余液滴的信号也将被自动排序并绘制成荧光直方图。
12. 选定目标液滴区域后，打开“分选开关”，并设置“偏转力”数值。设备将开始进行液滴分选。
    注意：仪器提供三种可选电场强度等级（高、中、低）。对于直径大于 30 µm 的液滴，选择“高”；对于直径小于 25 µm 的液滴，选择“中”或“低”。以确保稳定的偏转效果和最佳分选效率。
13. 设备稳定运行 5 分钟后，更换收集小瓶以收集阳性液滴。
    注意：分选过程中，仪器实时连续测量每个液滴的荧光强度，并与预设阈值进行比较。仅当液滴荧光强度超过阈值时，才会被偏转并收集至阳性收集管中。若仪器显示某液滴的荧光信号超过分选阈值，同时在成像界面中观察到该液滴发生偏转，则可判定该液滴为阳性，并已成功导入阳性收集通道。
14. 在稳定运行 4 小时后停止液滴分选。在“液滴分选”界面中点击“停止”。
15. 轻轻将收集管从芯片上取下。将收集管和收集小瓶垂直放置，确保管内液滴进入收集小瓶中。
16. 液滴收集完成后，点击散点图以保存实验的散点图、已分选阳性液滴的荧光信号值以及所有液滴的荧光信号值。
17. 从载物台上取下芯片、油相入口小瓶、样品小瓶和试剂小瓶。关闭软件。
18. 液滴破乳。向液滴收集管中加入 500 µL 的 1H,1H,2H,2H-全氟辛醇。等待 5 分钟后，加入 500 µL 新鲜筛选培养基用于回收。
    注意：加入破乳剂后切勿剧烈振荡收集管，应轻柔混匀。液滴破乳后，水相与油相之间将形成清晰的界面。
19. 取 20 µL 破乳后的菌悬液，进行 10 倍稀释后涂布于两块琼脂平板上。在 50 °C 下培养 2 天。
    注意：可根据收集的液滴数量调整稀释倍数。本实验中，两块平板共获得约 400 个单菌落。

8. 数据导出

1. 在软件分选界面的空白区域点击荧光信号图。选择保存液滴荧光信号散点图、荧光信号直方图以及荧光信号 Excel 表格，这些文件包含所有液滴记录的荧光强度值，以及筛选出的阳性液滴的荧光强度值。

9. 微孔板初筛

1. 随机挑选单菌落。
2. 接种24孔深孔板进行扩增培养。挑取每个选定的菌落，接种至含有2 mL发酵培养基的24孔深孔板中的一个孔内，使用接种环操作。
3. 用非透气膜密封24孔深孔板。
   注意：请勿使用透气膜，否则会导致培养基蒸发。
4. 培养扩增菌液。将密封后的24孔深孔板置于摇床培养箱中，在50 °C、200 rpm条件下培养24 h。
5. 进行传代培养以验证发酵能力。培养24 h后，从每孔中转移200 µL培养物至另一含有1.8 mL发酵培养基的新鲜24孔深孔板中（接种量为10% v/v）。接种前，向每孔中加入无菌CaCO₃，使其终浓度为4%（w/v），以缓冲pH。
6. 设置对照组。在每块新的24孔深孔板中，随机选择三个孔接种亲本菌株ATCC 7050作为阴性对照，并与候选菌株同步进行相同处理。
7. 用非透气膜密封24孔深孔板。
8. 培养24孔深孔板。将密封后的板置于摇床培养箱中，在50 °C、200 rpm条件下培养24 h。
9. 准备乳酸检测样品。将培养板在5,842 × g 条件下离心10 min，取10 µL上清液转移至96孔黑色微孔板中，加入990 µL超纯水稀释，充分混匀。
10. 加入乳酸传感器。将100 µL稀释后的样品加入新的96孔黑色微孔板的各孔中，然后每孔加入100 µL乳酸传感器溶液，轻轻混匀。
11. 检测荧光。将微孔板在室温下避光孵育5 min，使用酶标仪在激发波长485 nm、发射波长515 nm条件下测定荧光值。
12. 设定阳性筛选阈值。计算三个亲本对照孔的平均荧光值（parent）及其标准差（SD_parent），将阈值定义为F_parent + 3 × SD_parent。
13. 确定初筛阳性菌株。若候选菌株的荧光信号超过该阈值，则判定为初筛阳性菌株。记录初筛阳性菌株数量，用于后续验证。

10. 高产菌株的二次验证

警告：流动相含有稀硫酸（5 mM），具有腐蚀性。避免皮肤接触和吸入。佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。在通风良好的区域或通风橱中配制和操作流动相。所有含酸废液应收集在专用的酸性废液容器中，妥善处理，不得倒入下水道。

1. 准备种子培养物。将初筛获得的菌株划线接种至种子培养基琼脂平板上，在50 °C下培养24 h。从每块平板上挑取单菌落，接种于250 mL摇瓶中的30 mL液体种子培养基中，在50 °C、200 rpm条件下培养12 h。
2. 设置发酵实验。配制发酵培养基，并加入无菌CaCO₃粉末至终浓度为4%（w/v），作为pH中和剂。将5 mL种子培养液转移至装有45 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中（接种量为10% v/v，最终工作体积为50 mL）。
   注意：每种候选菌株及作为对照的亲本菌株ATCC 7050均需设置三个独立的平行瓶。
3. 培养发酵瓶。将锥形瓶置于摇床培养箱中，在50 °C、200 rpm条件下培养24 h。
4. 采集样品。培养24 h后，从每个发酵瓶中取1 mL培养液，于13,800 × g离心2 min。将上清液用超纯水稀释100倍后，经0.22 µm针头滤器过滤。
5. 设置高效液相色谱（HPLC）条件。使用Aminex HPX‑87H色谱柱。流动相为含5 mM H₂SO₄的超纯水溶液，经0.22 µm膜过滤并超声脱气。设定柱温为40 °C，流速为0.6 mL/min，进样量为20 µL，每样品运行时间为20 min（乳酸洗脱时间约为12.600 min）。采用示差折光检测器（RID）进行检测。
6. 绘制标准曲线。将L-乳酸钙溶于超纯水中，配制成浓度分别为0、0.4、0.8、1.2和1.6 g/L的标准溶液（以L-乳酸钙计）。每个标准品重复进样三次。
   注意：以峰面积对浓度作图，获得线性回归方程（R² > 0.999）。每批样品检测开始和结束时均需运行标准品，以校正系统漂移。
7. 进样分析。将过滤后的发酵上清液（20 µL）注入HPLC系统，记录L-乳酸钙峰的峰面积。
   注意：每检测10个样品插入一个质控样品（1 g/L L-乳酸钙），以监控系统稳定性。可接受的保留时间偏移应小于<0.2 min，峰面积变异率应小于<5%，相对于初始校准标准。
8. 计算L-乳酸产量。将各样品的峰面积代入标准曲线，计算出L-乳酸钙浓度（g/L）。
   注意：利用分子量比例换算为L-乳酸浓度：
       (3)
   计算产量提升百分比：
       (4)
9. 确定最终高产菌株。选择L-乳酸产量稳定高于亲本菌株的突变株作为验证后的高产菌株，并选取表现最优者进行后续表征。

11. 高产菌株遗传稳定性评估

1. 将筛选的突变菌株划线接种至种子培养基琼脂平板上，在 50 °C 下培养 24 小时。此为第 1 代。
2. 从第 1 代平板上挑取单菌落，接种于 50 mL 试管中的 5 mL 液体种子培养基中，在 50 °C、200 rpm 条件下振荡培养 12 小时，获得 F1 种子培养物。
3. 取第 1 代种子培养物体积的 10%（v/v），转接至 250 mL 三角摇瓶中的 50 mL 发酵培养基（含 4% w/v 无菌 CaCO₃）中，在 50 °C、200 rpm 条件下振荡培养 24 小时。
4. 发酵结束后取 1 mL 培养液，以 13,800 × g 离心 2 分钟，将上清液用超纯水稀释 100 倍后，采用 HPLC 测定 L-乳酸浓度。每一代均使用三个独立的摇瓶进行实验。
5. 为获得下一代菌株，取第 1 代培养物一环，划线接种至新鲜的种子培养基琼脂平板上，在 50 °C 下培养 24 小时。随后重复步骤 11.2 和 11.3，获得第 2 代。
6. 重复传代培养过程，依次获得第 3 代和第 4 代。每一代均准备三个摇瓶，并通过 HPLC 测定乳酸产量。
7. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或 Student’s t 检验比较四代（1–4）的产量差异。若各代间乳酸产量无显著差异（p > 0.05），则认为该菌株具有遗传稳定性。

结果

基于自动化的液滴微流控平台，建立了一种高通量筛选模型。通过ARTP诱变技术构建了B. coagulans的突变体文库，最佳辐照时间为20 s，致死率约为90%（图4A）。随后将突变细胞封装成体积约为14 pL、直径约30 µm的液滴，生成速率为1500 Hz（图4B）。在45 °C下孵育10 h后，以200 Hz的速率将传感器皮升注射至每个液滴中（图4C）。使用488 nm激光以100 Hz进行荧光激活液滴分选（图4D）。收集分选出的阳性液滴，破乳后挑取单菌落进行验证。挑取的菌落首先在含有发酵培养基的24孔深孔板中于50 °C、200 rpm条件下培养24 h。使用酶标仪在激发波长485 nm、发射波长515 nm下测定各孔的荧光强度。选择荧光强度高于亲本菌株均值加三个标准差的克隆。将这些候选菌株进一步转接至250 mL摇瓶中，接种量为10%，在相同条件下继续发酵24 h。最终通过高效液相色谱法测定L-乳酸浓度（图4E）。

讨论

本方案介绍了一种基于自动化液滴微流控平台的工业微生物筛选标准化工作流程。该集成化工作流程涵盖突变体文库构建、液滴生成与单细胞包封、微反应器培养、生物传感器注入、荧光激活液滴分选以及目标菌株的最终验证。以高产L-乳酸的B. coagulans高通量筛选作为验证案例，该工作流程在B. coagulans菌株改良中展现出相较于传统微孔板和琼脂平板方法的多项优势。在筛选通量和效率方面，该平台利用微流控芯片并行生成和处理每秒数千至数万个液滴，单轮筛选通量较传统基于微孔板的方法提高了约10⁴倍¹²。针对B. coagulans，该工作流程可在4 h内完成10⁶个液滴的筛选，从而将菌株开发周期从数周缩短至数天，显著加快育种进程。FADS系统的筛选效率约为基于平板筛选系统的3 × 10³倍，同时显著降低了设备、人力和耗材成本¹³。然而，由于不同微生物自身的特性差异，需对该标准工作流程进行针对性优化。例如，酵母培养36 h后，渗透压...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Becton, Dickinson and Company	214030	用于固体平板的制备
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司	10009218	用于擦拭和消毒实验台面及仪器设备
常压室温等离子体（ARTP）	江苏泰茂生物科技股份有限公司	CP-002	ARTP 用于构建突变文库以进行菌株诱变
B. coagulans	北京微生物菌种保藏中心，BMCC	1511C0004000002355	以B. coagulans ATCC 7050作为起始菌株进行诱变，并作为高通量液滴筛选的目标菌株
黑色微孔板（96孔）	Corning	3925	96孔黑色微孔板用于乳酸传感器检测及乳酸浓度测定
碳酸钙	国药集团化学试剂有限公司	20011062	用于分离L-乳酸高产菌株
氯化钙	国药集团	10005819	氯化钙用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养
L-乳酸钙	国药集团化学试剂有限公司	69027528	作为检测过程中标准曲线制备的样品
离心管（15 mL）	北京新恒岩科技有限公司	HB53397	用于菌液稀释
收集管	江苏泰茂生物科技股份有限公司	DREMcell-CL	用于收集液滴并进行后续培养
计算机	联想	E450	用于软件安装及DREM Cell仪器控制
DAPI	Solarbio	c0065	用于细胞染色
深孔板（24孔）	BKMAMLAB	110424008	用于利用深孔板对B. coagulans突变株进行初步产量验证
破乳剂（1H,1H,2H,2H-全氟辛醇）	MACKLIN	H817022	液滴破乳剂用于破坏油包水微液滴，释放内部细胞、菌株或上清液，以便后续检测与分析
D-葡萄糖	Solarbio	G8150-1000	D-葡萄糖用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养
柠檬酸氢二铵	Solarbio	D9950	柠檬酸氢二铵用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养
无水磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	P8281	无水磷酸氢二钾用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养
DREM软件版本	江苏泰茂生物科技股份有限公司	DREMcell v02.01.18	用于控制DREM Cell仪器。DREM软件是江苏泰茂生物科技股份有限公司专有的商业程序，仅供DREM Cell仪器使用，无公开的官方访问或下载链接，仅随仪器授权分发
液滴捕获微流控细胞分选仪（DREM Cell）	江苏泰茂生物科技股份有限公司	CP-027	用于高通量单细胞包封与分选，快速从突变文库中筛选高产菌株
液滴生成芯片	江苏泰茂生物科技股份有限公司	HC-03-009	液滴生成芯片用于产生单分散的皮升级（pL）液滴，实现单细胞包封
液滴注射芯片	江苏泰茂生物科技股份有限公司	HC-03-003	液滴微注射芯片用于向预先形成的液滴中实现精确微量试剂注入，以进行后续生化反应
液滴分选芯片	江苏泰茂生物科技股份有限公司	HC-03-002	液滴分选芯片用于根据荧光信号对含有高产细胞的目标液滴进行分选
锥形摇瓶（250 mL）	四川蜀牛玻璃仪器有限公司	B-001006	用于在深孔板初筛后对B. coagulans突变株进行扩大培养验证，以确认高产菌株的稳定性与可重复性
滤膜（0.22 μm）	Merck	SLGPR33RB	用于发酵液的过滤
荧光倒置显微镜	Olympus	IX73	使用Olympus IX73荧光倒置显微镜观察液滴内的细菌形态
氟化油	Bio-Rad	1864006	氟化油在液滴微流控中作为连续相，生成稳定、单分散且无干扰的油包水微液滴，支持单细胞培养与筛选
高效液相色谱柱	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	根据乳酸与其他组分在色谱柱中的保留特性差异进行分离，实现乳酸的准确定量检测
高效液相色谱	岛津	228-34001-02	HPLC用于发酵样品中L-乳酸的定量检测与分析
注射管	江苏泰茂生物科技股份有限公司	DREMcell-1N	用于注入油相、样品菌悬液和试剂溶液
七水合硫酸铁(III)	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate
超净工作台	上海申浦仪器设备有限公司	SP20230501	用于B. coagulans培养与发酵过程中的无菌操作
七水合硫酸镁	国药集团	10013018	酵母提取物用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养
一水合硫酸锰	MACKLIN	M813856	一水合硫酸锰用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养
酶标仪	TECAN	TCAT92000001	用于在微孔板中对乳酸传感器-乳酸混合物进行485/515 nm荧光检测
矿物油	江苏泰茂生物科技股份有限公司	Miss cell-BOS-B	用于液体表面密封，隔绝空气，防止样品挥发、氧化及微生物污染
万用表	SNAKOL	SK-9205Pro	用于检测液滴注射芯片和液滴分选芯片上电极的导通性
pBAD-eLACCO1.1	Addgene	167947	eLACCO1.1乳酸传感器可在微液滴内实现基于荧光的L-乳酸实时定量，从而实现对高产B. coagulans突变株的高通量筛选
磷酸盐缓冲液	诺唯赞	G101	注入等渗PBS缓冲液以维持液滴内稳定的pH和渗透压环境，从而确保乳酸传感器的最佳性能并提高筛选准确性。PBS组分：10 mM磷酸盐缓冲液，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，pH 7.4 ± 0.1（25 °C）
摇床	上海智城仪器有限公司	10240211	用于B. coagulans的培养与发酵过程
无水乙酸钠	Solarbio	S5330	无水乙酸钠用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养
氯化钠	国药集团	10019318	氯化钠用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养
硫酸	国药集团化学试剂有限公司	10021618	用于以5 mM浓度进行液滴流动性测试
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042	胰蛋白胨用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养
超低温冰箱	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	用于菌株保藏（-80 °C）
超纯水净化系统	Merck	17100500	用于实验室超纯水的制备
酵母提取物	Oxoid	LP0021	酵母提取物用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养