一种用于自组装重组I型胶原纤维中胶原矿化的多色3D-STORM高分辨率可视化方案

摘要

本文介绍了一种利用多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM），结合优化的标记、成像及定量共定位分析方法，以区分重组胶原原纤维中纤维内矿化与纤维外矿化过程的实验方案。

摘要

本方案描述了一种多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM）方法，用于在重组I型胶原自组装纤维模型中对胶原矿化进行纳米尺度的可视化观察。该方法可同时成像胶原、非胶原蛋白（例如硫酸软骨素）以及磷酸钙矿化相。样品制备包括氨基硅烷化和胶原自组装，随后使用磷酸钙培养基进行矿化，该培养基在早期（30分钟）形成无定形磷酸钙（ACP），并在6小时后成熟为羟基磷灰石（HAP）。接着进行多重免疫荧光标记，样品首先通过共聚焦显微镜进行评估，然后在含氧清除成像缓冲液的条件下进行3D-STORM图像采集。数据处理与分析采用公开可用的软件完成。与传统的电子显微镜或共聚焦显微镜相比，本方案结合了分子特异性和纳米级分辨率（典型横向定位精度为20–30 nm，轴向为50–60 nm），可实现对纤维内与纤维外矿化模式的三维可视化。代表性结果展示了在三维空间中胶原网络、相关非胶原蛋白及矿化相的清晰成像。结果部分提供了包括Pearson相关系数（0.89 ± 0.04）和Manders重叠系数（0.91 ± 0.03）在内的定量指标。本方案为生物材料科学、生物矿化及骨组织工程领域的研究人员提供了强有力的工具，可用于深入探究矿化动态过程的纳米级特征。

引言

胶原矿化是一种在骨和牙等硬组织形成过程中起关键作用的基本生物学过程¹。胶原纤维的复杂结构与矿化沉积的精细调控相结合，赋予这些组织卓越的机械强度和结构完整性²。胶原不仅作为被动的支架，更作为主动参与者，通过复杂的分子和物理相互作用调控精确的矿化沉积³。阐明这些机制对于理解骨质疏松症和龋齿等病理状态，以及开发用于再生治疗的仿生材料至关重要⁴。

硬组织中胶原纤维的直径约为50至100 nm，而羟基磷灰石（HAP）颗粒更小（厚度通常为2–5 nm，长度为20–30 nm），并嵌插在纤维间隙中⁵。虽然间隙区可作为成核位点，但在天然组织中，矿物质最初在纤维间区域形成，随后扩展至纤维内区域。传统的表征方法包括组织学染色、共聚焦激光扫描显微镜^6,7和电子显微镜^8,9。组织学染色可提供宏观评估，但无法评价纳米尺度的矿化状态。共聚焦显微镜能够观察特定组分，但受衍射极限限制（横向分辨率约200 nm），无法分辨纤维内与纤维外矿化¹⁰。电子显微镜具有高分辨率，但缺乏分子特异性。尽管免疫金标记可为电子显微镜提供分子特异性，但其需要特殊处理，且相较于STORM技术，在多组分多重、三维可视化方面适用性较差，同时实验周期长、成本高¹¹。

随机光学重建显微镜（STORM）通过高精度定位单个荧光分子，突破了衍射极限，实现了约20 nm的横向分辨率¹²。与其他超分辨率技术相比，例如受激辐射损耗（STED）显微镜¹³和结构光照明显微镜（SIM）¹⁴，STORM具有更高的定位精度（横向约20 nm，轴向约50 nm），并且兼容更广泛的有机荧光染料。特别是，STED需要特殊的染料和高激光功率，可能对生物样本造成损伤，而SIM的分辨率仅为约100 nm，不足以分辨纤维结构尺度（50–100 nm）的特征。STORM在分辨率、多重成像能力与样本兼容性之间提供了实用的平衡。已有发表的指南描述了标准化测试样本，以促进STORM成像参数的优化和分辨率评估¹⁵。当结合三维成像能力时，3D-STORM能够同时实现多种组分的纳米级可视化¹⁶。近年来的技术进展已将STORM扩展至多色和多重成像，能够在同一样本中实现多个靶标的可视化^17,18。

本方案采用基于自组装重组I型胶原原纤维的仿生体外模型，专为在纳米尺度上区分自组装重组I型胶原原纤维模型中的原纤维内矿化与原纤维外矿化而设计。该方法不适用于活细胞成像，因为STORM需要固定样本及除氧缓冲液。此外，在未预先脱钙或进行抗原修复的情况下，该方法也不适用于天然高度矿化的组织（如成熟骨组织）。若仅需评估总体矿化密度或大范围形态特征，则传统的共聚焦显微镜或电子显微镜更为高效。

本实验方案的总体目标是提供一种标准化的逐步操作流程，用于采用多色三维STORM技术对单个胶原原纤维内矿物质和非胶原蛋白的纳米级分布进行可视化，特别强调区分原纤维内矿化与原纤维外矿化。该方案结合了优化的免疫标记方法与定制的成像缓冲液，可在三维空间中同时追踪多种有机成分（胶原、非胶原蛋白）和无机相（ACP、HAP）¹⁹。其中一项关键创新在于对原纤维内与原纤维外矿化模式进行定量评估。定量分析通过两个独立标准实现：（1）利用图像分析软件中的共定位模块，计算矿物质（钙离子指示染料（例如荧光素））与胶原（远红光荧光染料）通道之间的Pearson共定位系数（系数>0.8表示强关联）；（2）分析单个原纤维在Z轴切片中矿化信号的持续性：若在中心切片（Z = 原纤维垂直中心 ±120 nm范围内）检测到矿化信号强度达到最大值的50%或以上，则判定为原纤维内矿化。与传统的电子显微镜或共聚焦显微镜不同，本方案结合了分子特异性和纳米级分辨率，能够实现原纤维内矿化的三维空间分布解析。

本实验方案专为需要在纳米尺度上研究矿化动力学的生物材料科学、生物矿化及骨组织工程领域的研究人员设计。通过相应调整初始样品制备步骤，该标准化操作流程也可适用于其他矿化胶原体系的研究，例如脱矿牙本质切片或基于胶原的水凝胶。

方案

所有涉及生物样本的实验均遵循浙江大学医学院核心设施的指南和规定，并已获得机构生物安全委员会的批准（批准证书编号：BSL20235710079）。本文所述实验方案使用商业来源的试剂和体外仿生系统，不涉及人类受试者、动物实验或人体组织样本，因此无需机构审查委员会的伦理审批。

警告：所有涉及危险化学品的操作必须在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜）。化学废弃物应根据机构规定进行处理。对于 NaN₃，需将废液收集至标有“叠氮化物废液”的专用容器中，切勿与酸混合（有产生爆炸性气体的风险）。对于戊二醛，废弃前需用过量 10% 的亚硫酸氢钠进行失活处理。对于 β-巯基乙醇，废弃前需用漂白剂（体积比 1:10）氧化 1 小时，方可排入下水道。

注意：免疫荧光标记必须在矿化之前进行，以避免矿物质沉积遮蔽抗原表位。对于需要在矿化后进行标记的应用，可能需要进行抗原修复。

1. 矿化培养基的制备

1. 重建胶原纤维矿化培养基的制备
   1. 在15 mL锥形管中，将100 µL浓度为5 mg/mL的聚天冬氨酸（p-Asp，分子量9–11 kDa）逐滴加入5 mL的3.44 mM CaCl₂溶液中，配制钙储备液。
   2. 在管中涡旋混合30秒，直至溶液均匀。
   3. 缓慢加入p‑Asp并充分混合，以稳定无定形磷酸钙（ACP）。
   4. 向钙储备液中加入5 mL磷酸盐溶液（19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl）。
   5. 涡旋混合1分钟。
      注：混合后的终浓度为：1.67 mM CaCl₂、9.5 mM Na₂HPO₄、150 mM NaCl和50 µg/mL p-Asp。
   6. 矿化培养基需在使用前立即配制。不得储存；为获得一致结果，应立即使用不稳定的ACP前体。
      注：储存会导致过早结晶。
2. 胶原凝胶/脱矿牙本质矿化培养基的制备
   1. 将8.77 g NaCl、0.01 g NaN₃、6.06 g Tris和1.11 g CaCl₂溶解于800 mL去离子水中，配制含钙溶液。
   2. 用去离子水定容至1 L。
   3. 向含钙溶液中加入350 µg/mL聚丙烯酸（PAA，分子量约1800）。
   4. 涡旋混合1分钟。
      注：在较高钙浓度下，使用PAA比p‑Asp具有更好的稳定效果。
   5. 将0.85 g Na₂HPO₄溶解于1 L去离子水中，配制磷酸盐溶液，得到6 mM Na₂HPO₄。
   6. 使用0.22 µm滤膜对磷酸盐溶液进行过滤除菌。
   7. 在300 rpm磁力搅拌下，将等体积的钙溶液和磷酸盐溶液（例如各500 mL）混合。
   8. 使用1 M HCl或NaOH，在pH计监测下调节pH至7.4。
      注：维持pH在7.4 ± 0.1范围内。pH偏差不得超过>0.2，否则会引起过早结晶。

2. 重组胶原纤维的制备

1. 玻璃底培养皿的氨基硅烷化处理
   注意：该处理使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）在玻璃表面引入带正电荷的氨基（‑NH₂），以促进带负电荷的胶原单体的静电吸附和稳定。
   1. 向每个玻璃底培养皿（35 mm，#1.5H 厚度，0.17 mm ± 0.005 mm）中加入 200 µL APTES 溶液（5% v/v，溶于无水乙醇）。
   2. 确保 APTES 溶液完全覆盖培养皿表面。
   3. 在避光条件下于室温（20–25 °C）孵育 2 小时。
   4. 用无水乙醇清洗培养皿三次（每次 2 mL）。
   5. 在去离子水中以 40 kHz 超声处理 10 分钟，彻底去除残留的 APTES，防止非特异性结合。
   6. 硅烷化处理后的培养皿可在干燥条件下于 4 °C 保存最多 1 周。
   7. （可选）为增强稳定性进行烘烤：将清洗并干燥后的培养皿置于 100–120 °C 烤箱中加热 30–60 分钟。
   8. 继续操作前让其冷却至室温。
      注意：若使用塑料培养皿，应将温度降至 80 °C 以下以防止变形。硅烷化步骤可参考 Bitter 和 Muir²⁰ 的方法。
2. 胶原自组装与交联
   1. 将 100 µL I 型胶原溶液（50 µg/mL，溶于 0.1 M 乙酸）移液至每个硅烷化处理的培养皿中。
   2. 在湿度箱（> 90% 相对湿度）中 37 °C 孵育 10 小时。保持稳定的湿度以防止溶液蒸发。
   3. 使用相差显微镜或共聚焦显微镜验证纤维形成；成功的制备应呈现细密的网状纤维结构。
   4. 为在超微结构水平验证纤维的正确形成，可在聚乙烯醇缩甲醛/碳支持膜透射电镜载网上，按照相同的自组装条件（I 型胶原 50 µg/mL，37 °C，10 小时，湿度 > 90%）制备独立样品。
   5. 用 1% 磷钨酸（pH 7.0）染色 10 分钟。
   6. 用去离子水清洗。
   7. 在透射电子显微镜下观察。成功的纤维形成表现为特征性的 67 nm D 周期带状结构（见 图 3）。
   8. 小心吸除玻璃底培养皿中残留的胶原溶液。
   9. 向每个培养皿中加入 2 mL 硫酸软骨素（CS）溶液（50 mg/mL，溶于 PBS，pH 5.5）。
   10. 在 4 °C 孵育 12 小时，使 CS 通过静电作用吸附到胶原纤维上。
   11. 配制 EDC/NHS 交联溶液²¹：将 0.2 M EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）和 0.05 M NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）溶于 MES 缓冲液（0.1 M MES，pH 5.5）。
       注意：MES 缓冲液可通过将 MES 游离酸溶于去离子水中，并用 NaOH 调节 pH 至 5.5 制备。
   12. 去除 CS 溶液，加入 2 mL EDC/NHS 交联溶液。
   13. 在室温下孵育 2 小时，使 CS 共价固定在胶原上。
   14. 用 PBS 清洗培养皿三次（每次 5 mL，每次 5 分钟），以去除未反应的试剂。
   15. 处理后的胶原纤维可在 PBS 中 4 °C 保存最多 24 小时，随后进行矿化。

3. 免疫荧光标记（在矿化之前进行）

1. 样品制备
   1. 用 500 mM NaCl 溶液清洗胶原原纤维三次（每次 10 mL，5 分钟）。
   2. 用去离子水清洗三次（每次 10 mL，5 分钟）。
   3. 在水平摇床上进行清洗，摇床转速为 50 rpm，以确保充分清洗，同时尽量减少可能导致组装原纤维脱落的剪切力。
2. 封闭及一抗孵育
   1. 在加湿孵育盒中，加入封闭缓冲液（含 5% 牛血清白蛋白的 PBS）于 37 °C 孵育 1 小时。
   2. 在封闭缓冲液中配制一抗混合液：兔抗胶原蛋白-I 抗体（1:100 稀释）和小鼠抗硫酸软骨素抗体（1:100 稀释）。
   3. 每份样品加入 200 µL 抗体混合液。
   4. 用实验室封口膜覆盖样品。
   5. 于 4 °C 孵育过夜（12–16 小时）。
   6. 用铝箔避光保护。一抗孵育完成后，样品可在 PBS 中于 4 °C 保存最多 24 小时。
3. 二抗染色
   1. 用洗涤缓冲液（含 0.1% Tween-20 的 PBS）清洗培养皿三次，每次 10 分钟，以去除未结合的一抗。
   2. 在封闭缓冲液中配制荧光二抗混合液（每 35 mm 培养皿 200 µL），包含：与远红荧光染料偶联的山羊抗兔 IgG（1:100 稀释）和与红色荧光染料偶联的山羊抗小鼠 IgM（1:100 稀释）。
      注意：从本步骤开始，需始终避光操作，以防止荧光染料发生光漂白。
   3. 在室温（20–25 °C）避光孵育 1 小时。
   4. 用洗涤缓冲液清洗培养皿三次，每次 10 分钟，以去除未结合的二抗。
      注意：标记后的样品可在 PBS 中于 4 °C（避光）保存最多 48 小时，之后进行成像。应设置无一抗对照组以检测自发荧光。

4. 胶原纤维的矿化（在标记后进行）

1. 矿化过程
   1. 每皿加入 2 mL 新鲜配制的矿化培养基。
   2. 在 37 °C 下孵育 30 分钟（短期），以促进早期阶段矿物（非晶态磷酸钙，ACP）的形成。
   3. 或者，在 37 °C 下孵育 6 小时（长期），以促进成熟矿物（羟基磷灰石，HAP）的结晶。
      注意：使用经过校准的培养箱，将温度精确维持在 37 °C ± 0.5 °C。
   4. 轻柔吸除矿化培养基。
   5. 用去离子水清洗三次（每次 5 mL，间隔 1 分钟）。
2. 磷酸钙标记
   1. 在 PBS 中加入 4 µM 钙离子指示染料（例如钙黄绿素），每皿 200 µL。
   2. 在室温（20–25 °C）避光孵育 30 分钟。
      注意：钙离子指示染料（例如钙黄绿素）可结合钙离子，但无法区分非晶态与结晶态相；相态的判定依据为矿化时间（30 分钟 = ACP，6 小时 = HAP）。应使用棕色管或铝箔包裹以避免光照。
   3. 清洗五次：交替使用去离子水清洗三次，70% 乙醇清洗两次，每次 1 分钟。
3. 成像样品制备
   1. 将样品浸入成像缓冲液中：含 10% (w/v) 甘油的 PBS。可选：根据制造商说明添加抗荧光淬灭试剂。
   2. 加入足够体积（20–50 µL）的成像缓冲液以完全覆盖样品。
   3. 在样品上加盖盖玻片。
   4. 将样品置于 4 °C 避光保存，最长可保存 72 小时。

5. 激光共聚焦显微镜下的观察

1. 将样品从 4 °C 储存环境转移至室温（20–25 °C）。
2. 静置 10 分钟以平衡温度，防止产生冷凝水。
3. 使用棕色容器或铝箔包裹以保持避光。
4. 确认成像缓冲液完全覆盖样品。
5. 配置共聚焦显微镜参数如下：
   1. 胶原成像（远红荧光染料）：647 nm 激光，发射滤光片 650–710 nm。
   2. 磷酸钙成像（钙指示剂染料，例如钙黄绿素）：488 nm 激光，发射滤光片 500–550 nm。
   3. 物镜：100× 油镜（NA 1.4）。
   4. 针孔直径：1 阿iry单位（AU）。
   5. 像素驻留时间：1–2 µs。
      ​注意：成像前需完成激光校准和针孔校正。
6. 进行顺序扫描：首先使用 647 nm 激发光扫描（胶原）。
7. 随后使用 488 nm 激发光进行第二次扫描（矿化成分）。
   注意：应顺序采集各通道以避免串色。
8. 进行三维重建时，将 Z 轴步进设为 0.5 µm 或更小，以确保足够的采样密度。
9. 保存文件时保留元数据。
10. 进行共定位分析时，使用能够计算皮尔逊相关系数的图像分析软件（例如具有合适插件的公开可用软件）。

6. 三重成像-三维的 随机的 光学重建显微镜技术（3D）-STORM

1. STORM 成像缓冲液的制备²²
   注意：在成像缓冲液中添加葡萄糖氧化酶（GOx）和过氧化氢酶（catalase），以清除氧气，从而减少荧光染料的光漂白并延长其闪烁时间，这对于 STORM 中的单分子定位至关重要。
   1. 在 50 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5.1）中配制浓度为 8 mg/mL 的葡萄糖氧化酶（GOx）储备液。
   2. 在 1× PBS 中配制浓度为 160 µg/mL 的过氧化氢酶储备液。
      注意：将酶储备液分装，使用液氮或干冰/乙醇浴快速冷冻，并在 -20 °C 或 -80 °C 下保存。避免反复冻融。
   3. 在冰上避光新鲜配制 STORM 成像缓冲液。
   4. 按以下顺序混合各组分，最终体积为 1 mL：无菌无核酸酶水（补至 1 mL）、1 M NaCl（10 µL，终浓度 10 mM）、1 M Tris-HCl pH 8.0（50 µL，终浓度 50 mM）、新鲜配制并调节 pH 至约 7.0 的 1 M 半胱胺（MEA）（50 µL，终浓度 50 mM）、50%（w/v）葡萄糖溶液（200 µL，终浓度 10% w/v）、GOx 储备液（200 µL，终浓度 1.6 mg/mL）、过氧化氢酶储备液（200 µL，终浓度 32 µg/mL）。
   5. 通过移液或轻柔颠倒混匀。 切勿涡旋震荡。
      注意：缓冲液必须现配现用，并在避光条件下置于冰上。配制后 30 分钟内使用。如需对 STORM 成像条件进行详细优化，请参考使用测试样品的标准操作流程¹⁵。
   6. 加入 200 µL 新鲜配制的 STORM 成像缓冲液，完全覆盖样品。
2. 3D-STORM 系统配置
   1. 确保成像光路导向电子倍增 CCD（EMCCD）相机。
   2. 启用圆柱透镜模块以进行三维成像。
   3. 将软件设置为 3D STORM 采集模式。
   4. 根据所用染料配置光路滤光片。
   5. 打开 647 nm 激光器，并将功率设为低水平（1–5 mW）。
   6. 使用 100× 油浸物镜（NA ≥1.4），在宽场或全内反射荧光（TIRF）实时预览模式下定位感兴趣区域。
   7. 采集一幅常规宽场荧光图像，用于后续比较。
   8. 切换至 TIRF 照明模式。
   9. 校准 TIRF 角度，以获得较薄的照明场（约 100–200 nm），从而最小化背景荧光。
   10. 根据初始信号强度调整相机曝光时间（10–30 ms）。
   11. 根据初始信号强度调整成像激光功率。
   12. 进行短暂的测试采集。
   13. 验证参数设置是否正确，避免引起快速光漂白。
       注意：确保圆柱透镜轴与样品平面精确对齐。大多数现代系统具备自动校准功能。若需手动校准，可使用 100 nm 荧光微球验证点扩散函数（PSFs）是否对称且呈圆形。
   14. 初始采集条件建议为：曝光时间 10–30 ms，647 nm 激光功率为 1–2 kW/cm²。
   15. 验证闪烁分子密度是否为 0.1–1 个分子/µm²。
   16. 若密度过低或过高，相应调整激光功率或曝光时间。
   17. 重复验证与调整，直至达到理想密度。
3. 3D-STORM 数据采集
   1. 将采集软件设置为 "连续激活" 模式。
   2. 将成像激光（647 nm）设为高功率（光纤输入 100–500 mW），使大多数荧光分子进入暗态。
   3. 将激活激光（405 nm）设为低功率（0.1–5 mW）。
   4. 通过实验经验优化 405 nm 激光功率，以维持每帧图像中 256×256 像素区域内有 100–200 个定位成功的单分子。
   5. 设置总帧数为 10,000–20,000 帧。
   6. 每个循环中，先使用 1 帧激活光（405 nm），随后使用 5 帧成像光（647 nm）。
   7. 开始采集。
   8. 以最大灵敏度运行 EMCCD（应用 EM 增益）。
   9. 每帧曝光时间为 10–30 ms。
   10. 采集过程中，持续监测活跃分子密度。
   11. 调节 405 nm 激光功率，以维持稳定的单分子事件流。
       ​注意：原始视频数据可在重建前存储于标准硬盘中长期归档。
4. 胶原矿化数据分析（使用带有 STORM 模块的图像分析软件）
   1. 在分析软件中选择合适的相机驱动程序（STORM 模块）。
   2. 点击 STORM 面板中的 [分析 GUI]，分析窗口将打开。
   3. 点击 [文件打开]，选择待分析的原始显微图像文件，点击“打开”。
   4. 确定有效信号的最低荧光值（最小高度）。
   5. 找到仍可识别为单分子信号的最暗斑点。
   6. 将鼠标移至其中心位置。
   7. 读取峰值高度值。
   8. 记录该数值。
   9. 点击 [识别设置]，在弹出对话框中设置以下参数：最小高度（输入步骤 6.4.8 记录的值）、最大高度（20000）、CCD 基线（100），对于 3D-STORM 数据勾选“3D”（2D 数据则取消勾选）。
   10. 点击 >> 展开更多参数，设置如下：最小宽度（nm）为 200，最大宽度（nm）为 700（2D 数据为 400），初始拟合宽度（nm）为 300，最大轴向比为 2.5（2D 数据为 1.3），最大位移（像素）为 1。
   11. 点击“确定”关闭对话框。
   12. 执行一次测试分析以验证参数设置，取消勾选“漂移校正”。
   13. 将周期数设为 1。
   14. 点击 [测试]。
   15. 分析完成后，在弹出对话框中点击“确定”。
   16. 检查信号斑点是否被正确识别，背景噪声不应被误选，真实信号不应遗漏。
   17. 若结果不理想，重复步骤 6.4.9–6.4.16 调整参数直至满意。
   18. 测试分析通过后，执行完整分析，勾选“漂移校正”。
       注意：分析软件采用冗余互相关（RCC）算法进行漂移校正，该算法通过最大化不同时间段分子定位之间的相关性实现校正，无需使用基准标记微球²³。
   19. 保持周期数 = 1。
   20. 点击 [开始]（或再次点击 [测试]，然后点击 [开始]）。
   21. 等待分析完成，在弹出对话框中点击“确定”。
   22. 分析完成后，将在与 .nd2 文件相同的文件夹中生成两个结果文件（.bin 和 .txt）。
   23. 对于共定位分析（647 nm 和 488 nm 通道），在分析窗口的通道列表中同时显示两个通道。
   24. 选择适当的感兴趣区域（ROI）。
   25. 使用共定位模块计算 Pearson 相关系数。若软件未自动提供，可手动导出点云数据至公开可用图像分析软件中的共定位插件，并记录该值。
   26. 执行 Z 切片分析以确认纤维内矿化。在主菜单中选择 视图 > Z 步进 > 切片。
   27. 以 60 nm 为间隔提取单个平面。
   28. 观察矿化信号（绿色，488 nm 通道），检查信号是否在中心切片（Z = 0 nm ±120 nm）持续存在。若存在，则确认为纤维内矿化。
   29. 可选：执行密度滤波以减少密集发射体导致的过度计数。使用适用于单分子定位分析的插件，在公开可用的图像分析软件中打开 STORM 重建图像²⁴。
   30. 为减少密集发射体引起的过度计数，可根据信号密度应用密度滤波（例如中值滤波或局部密度阈值）。
   31. 若在步骤 6.4.18 中未启用漂移校正或需要进一步校正，请执行漂移校正。基于基准标记物的点扩散函数（PSF）进行校正，或使用互相关算法（例如同一插件中实现的漂移校正功能）。
   32. 执行光谱解混以消除通道串扰。在 STORM 分析窗口中，点击串扰去除工具（通常位于右下角）。
   33. 将半径设为 25.0 nm（推荐值）。选择源通道，选择去除方法：推荐使用“统计法”。
   34. 为去除激发激光引起的交叉激活，选择“减法”并结合 NSA > 交叉激活，点击“确定”。系统将自动生成一个新通道 Nonspecific Activation‑Xt。
   35. 使用未染色对照样品验证自发荧光水平和背景信号，确保所有信号均为特异性标记。
   36. 执行三维可视化。在分析窗口中选择一个感兴趣区域（ROI）。
   37. 点击 [3D] 按钮（或 [显示 3D]），生成三维投影或体渲染图像。
   38. 右键点击以调整渲染参数，导出为常见格式的视频（如 .avi 或 .mp4）。
   39. 为将矿化信号分类为纤维内矿化，执行步骤 6.4.26–6.4.28 中的 Z 切片分析，并导出强度分布曲线。
   40. 将胶原信号最强的 Z 平面定义为纤维中心。
   41. 若矿化信号在 Z = 0（中心）和 Z = ±60 nm 处的强度均 ≥ 该纤维中最大矿化强度的 50%，则视为纤维内矿化；若在 Z = 0 处信号强度低于 30%，则归类为纤维外矿化。
   42. 每种条件下至少记录 50 根纤维的分类结果，用于计算纤维内矿化的百分比。
       注意：也可使用其他公开可用的插件进行密度滤波、漂移校正和光谱解混。

结果

成功实施本方案可利用多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM）实现矿化胶原原纤维的高分辨率三维可视化。以下结果展示了典型的实验结果、质量控制及定量评估。

图1展示了非晶磷酸钙（ACP）矿化的胶原网络的多色三维STORM重建图像。胶原蛋白（用远红荧光染料标记）呈现出结构清晰的纤维网络。硫酸软骨素（GAG，用红色染料标记）与胶原纤维紧密关联，共定位区域在合并图像中显示为青色。重要的是，在胶原纤维边界内观察到ACP颗粒（绿色，用钙离子指示染料标记），表明在早期阶段（30分钟）即发生纤维内矿化。该图突出了本方案能够在纳米尺度上同时分辨三种不同组分（胶原蛋白、GAG、矿物）的能力，这是传统共聚焦显微镜无法实现的（参见图5以对比成像分辨率）。ACP在纤维内的纳米级共定位证实，非晶前体可在结晶转化之前渗入纤维内部。

图2提供了矿化6小时后成熟羟基磷灰石（HAP...

讨论

本方案提供了利用多色三维随机光学重建显微镜（3D-STORM）对胶原矿化进行纳米尺度可视化观测的完整工作流程。其中多个关键步骤需要特别注意，以确保获得成功的结果。

首先，样品制备是获得高质量STORM成像的基础。玻璃底培养皿的氨基硅烷化处理必须充分，以确保胶原原纤维在后续的洗涤和标记步骤中稳定附着。残留的APTES可能导致非特异性结合和高背景信号，而硅烷化不完全则可能引起原纤维脱落。建议采用超声处理（40 kHz下10分钟），可有效去除未结合的硅烷试剂，同时保留表面功能化。对于胶原纤维的交联，推荐使用EDC/NHS²¹，因其具有高特异性。也可选用0.1%戊二醛（室温孵育30分钟，然后充分洗涤），但其特异性较低。关键的是，我们建议在进行矿化前，通过透射电子显微镜（TEM）验证原纤维是否正确形成。如图3所示，特征性的67 nm D周期性条带模式的存在，表明自组装过程已产生结构完整、类似天然的胶原原纤维²⁶。这一质量控制步骤可避免因胶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚天冬氨酸 (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	无定形磷酸钙稳定剂
氯化钙 (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	钙源
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	磷酸盐来源
氯化钠 (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	离子强度调节剂
聚丙烯酸 (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	高浓度钙稳定剂
Tris 碱	Sigma-Aldrich	T1503	缓冲液组分
叠氮化钠 (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	抗菌剂
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	玻璃表面功能化试剂
无水乙醇	Sigma-Aldrich	459836	溶剂
I 型胶原蛋白溶液 (0.1 M 乙酸中 50 μg/mL)	Corning	354249	自组装支架
硫酸软骨素 (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	非胶原蛋白模拟物
EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)	Sigma-Aldrich	E7750	交联剂
NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)	Sigma-Aldrich	130672	交联活化剂
MES 自由酸	Sigma-Aldrich	M5287	交联缓冲液
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	10010023	洗涤与稀释缓冲液
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	封闭剂
兔抗 I 型胶原抗体	Abcam	ab34710	胶原蛋白一抗
鼠抗硫酸软骨素抗体	Sigma-Aldrich	C8035	CS 一抗
偶联远红荧光染料 (Alexa Fluor 647) 的山羊抗兔 IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21244	胶原蛋白二抗
偶联红色荧光染料 (Alexa Fluor 568) 的山羊抗小鼠 IgM	Thermo Fisher Scientific	A-11031	CS 二抗
钙黄绿素 (钙离子指示染料)	Sigma-Aldrich	C0875	磷酸钙标记物
吐温-20	Sigma-Aldrich	P1379	洗涤缓冲液用去垢剂
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	成像缓冲液组分
葡萄糖氧化酶 (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	除氧剂
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C1345	除氧剂
半胱胺 (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	荧光团闪烁用巯基化合物
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G6152	葡萄糖氧化酶底物
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889	GOx 储液缓冲液
盐酸 (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	pH 调节
氢氧化钠 (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	pH 调节
磷钨酸	Sigma-Aldrich	P4006	透射电镜负染剂
玻璃底培养皿 (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	样品基底；厚度 0.17 mm
超声波清洗机 (40 kHz)	Branson	B200	清洗设备
湿室	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	用于胶原蛋白自组装
透射电子显微镜	Hitachi	HT7800	TEM 成像
Formvar/碳支持膜 TEM 铜网 (200 目)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	TEM 样品支撑
水平摇床平台	Labnet	S2030-RC	轻柔洗涤
共聚焦激光扫描显微镜	Nikon	A1	初步筛选
三维STORM显微镜系统 (配备 405/488/647 nm 激光器、柱面透镜、EMCCD)	Nikon	N-STORM	超分辨率成像
100× 油浸物镜 (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	高分辨率成像
pH 计	Mettler Toledo	FiveGo F2	pH 控制
STORM 采集与分析软件	Nikon	NIS-Elements (STORM 模块)	STORM 数据采集与处理
.nd2 文件格式 (原始显微图像文件)	Nikon	N/A	尼康显微镜生成的原始图像文件格式。
公开可用的图像分析软件	开源	N/A	例如，ImageJ 配合 ThunderSTORM 插件用于单分子定位分析（共定位、漂移校正）
Parafilm 封口膜	Bemis	PM996	孵育过程中样品覆盖
铝箔	任意实验室供应商	N/A	用于避光（例如包裹样品）
棕色微量离心管	Fisher Scientific	05-669-21	保护荧光染料免受光照
盖玻片 (No. 1.5)	Corning	2855-18	样品封片