多重荧光 mRNA 原位 杂交检测石蜡包埋小鼠样品中颅面组织的发育

摘要

常规的 原位 由于复杂的组织结构、高背景信号、探针特异性有限以及灵敏度不足，杂交技术在颅面组织中对mRNA的可视化存在困难。本方案描述了一种多重荧光RNA 原位 一种用于在福尔马林固定石蜡包埋的小鼠胚胎颅面组织中灵敏、特异性检测多种 mRNA 靶标的杂交方法，克服了以往的局限性。

摘要

颅面发育依赖于多种特化细胞群体的协调活动，这些细胞在复杂的组织结构中相互作用，以形成并维持正常的组织结构与功能。了解这些细胞如何相互之间以及与其局部微环境进行通讯，对于阐明调控其形成与稳态的分子机制至关重要。这些过程的紊乱可导致先天性颅面异常，包括牙齿缺失、腭裂和唇裂，可单独发生，也可作为综合征的一部分出现。尽管定量技术如RT-PCR具有高灵敏度和宽动态范围，但其需要从均质化组织中提取RNA，导致空间信息和细胞来源的丢失，这对于细胞异质性显著的颅面组织尤为关键，因为无法确定转录本的具体细胞来源。多重荧光RNA 原位 杂交技术通过在保持组织结构的同时实现对多种mRNA转录本的灵敏且特异的检测，克服了这一局限性。该先进方法能够在细胞水平上精确定位基因表达，为了解颅面生物学中发育过程和疾病机制的空间调控提供重要见解。

引言

实时聚合酶链式反应（RT-PCR）因其高灵敏度和宽广的动态范围，已成为基因表达分析的金标准；然而，该方法需要从均质化的组织中提取RNA，导致空间信息和细胞背景的丢失¹。这一局限性在胚胎发育过程中的颅面组织等异质性组织中尤为突出，因为无法确定所检测转录本的具体细胞来源。RNA 原位 杂交（ISH）技术由Joseph Gall和Mary Lou Pardue于1968年首创，能够实现mRNA在完整组织结构中的定位，从而克服了这一限制²。然而，传统的RNA ISH技术操作复杂，且高度依赖于最佳的组织固定和样本制备条件，以保持RNA的完整性³。在高度钙化的组织中，这些挑战更为显著，因为此类组织需要进行脱钙处理，而脱钙过程常涉及强化学试剂或长时间操作，容易导致RNA降解。因此，在包含多种细胞类型的颅面组织中开展RNA ISH实验，必须进行精细的优化并具备较高的技术水平，耗时较长，且存在染色效果不理想的较高风险。在牙体组织中，mRNA表达的可视化挑战更加突出，因为牙体组织具有高度复杂的结构和组成。牙齿由矿化成分（如釉质、牙本质、牙骨质及周围骨组织）以及较软的组织（如牙髓和牙周膜）共同构成。这些组织中含有多种不同类型的细胞，在牙齿发育过程中发挥着关键作用⁴。上述特性要求实验过程必须进行严格标准化，以确保信号检测的可靠性。因此，本方案特别适用于研究牙齿发育及出生后形成阶段的基因表达。

目前存在多种基于荧光原位杂交（FISH）的技术用于RNA的空间检测，包括基于探针扩增的RNA FISH^5,6,7,8,9、杂交链式反应FISH⁶、单分子RNA FISH¹⁰、通过交换反应进行信号扩增的FISH⁵，以及高度多重化的FISH平台如MERFISH¹¹和seqFISH^12,13。其中，多重荧光RNA原位杂交（ISH）^7,8,9因采用双Z探针设计而具有高灵敏度，可检测单个RNA分子——该设计要求两个相邻探针必须同时与靶序列结合才能启动信号扩增。这种双重识别机制显著提高了特异性，并减少了非靶信号。该方法支持2–4个靶标的多重检测（使用类似技术可扩展至12个或更多靶标），能够保持组织形态，并适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）^7,8,9、新鲜冷冻组织以及部分钙化组织，因此适用于颅面和牙齿发育研究中常见的复杂样本。该方法标准化程度高、可重复性强，拥有成熟的探针文库支持，并已在多个实验室中得到广泛验证，确保了在不同实验条件下均可获得可靠且可及的结果。

多重荧光RNA原位杂交技术采用针对同一转录本不同区域的多个探针，并结合信号增强放大系统，能够实现对丰度极低或部分降解的mRNA的高度敏感且特异的检测^14,15。尽管多重荧光RNA原位杂交已成功应用于脱钙骨组织样本¹⁶，并且在复杂的颅面组织中的应用也已有报道^7,8,9；然而，目前尚未见详细描述该技术在此类组织中应用的分步操作方案的报道。

颅面结构包含复杂的组织架构，具有多种细胞类型，包括成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、成釉细胞、成牙本质细胞、成纤维细胞、干细胞、免疫细胞、血管系统以及感觉神经元，这些细胞之间在空间上协调的相互作用对于组织的形成、功能、再生以及免疫保护至关重要⁴。因此，研究这些组织中基因的局部表达具有重要意义，而多重荧光RNA原位杂交（ISH）是此类分析的领先技术。

在本研究中，我们描述了基于RNAscope探针和技术的多重荧光RNA原位杂交（ISH）如何应用于复杂颅面组织的研究（图1）。此外，我们建立了一种优化的FFPE切片工作流程，可保持RNA完整性，实现高质量、具有空间分辨能力的基因表达分析。

方案

所有动物实验程序均经美国国立卫生研究院（NIH）下属的儿童健康与人类发展研究所动物护理与使用委员会（IACUC）批准，批准编号为动物研究方案 #24-031。

1. 定时交配与胚胎组织采集

1. 设置定时交配。
   1. 在傍晚时分将一只健康且具有生育能力的雄性与雌性小鼠（Mus musculus）合笼。次日早晨检查阴道栓的存在。将观察到阴道栓的当天记为胚胎发育第（E）0.5天。
2. 处死妊娠雌鼠。
   1. 在目标发育阶段，根据机构动物护理指南，通过吸入CO₂随后进行颈椎脱位的方法处死妊娠小鼠。
   2. 将小鼠仰卧位放置于无菌吸水表面上。沿预定切口部位用70%乙醇对腹部区域进行消毒。
3. 暴露并分离子宫角。
   1. 使用无菌手术剪在腹部正中线做切口，然后用显微手术剪剪开腹膜壁，以暴露子宫角。
   2. 用钝头镊子轻柔地将子宫链拉出体外。沿子宫肌层松解组织，并剪断输卵管及子宫角中线附着处，以分离胚胎。
4. 转移完整胚胎。
   1. 立即将含有胚胎的子宫链转移至一个盛有冰上预冷的无菌1×PBS（pH 7.4）的10 cm培养皿中。
5. 解剖单个胚胎。
   1. 小心地将每个胚胎从周围的子宫组织、羊膜和绒毛膜中分离出来。
   2. 将清理后的胚胎转移至另一个盛有冰上预冷的无菌PBS的10 cm培养皿中。
6. 解剖小鼠胚胎头部。
   1. 使用无菌手术刀片解剖头部，并在进一步处理前用冰上预冷的PBS冲洗一次。
      注：根据动物实验方案，在目标发育阶段收集并解剖新生小鼠。

2. 组织固定与处理

1. 固定组织。
   1. 将解剖得到的组织立即浸入10%中性缓冲福尔马林溶液中，在摇床上室温条件下固定过夜。
      ​注意：原位杂交分析的成功关键在于RNA的适当保存。大量研究表明，采用标准方法——根据组织的具体大小和年龄，将组织样本在10%中性缓冲福尔马林中固定6至48小时——可实现可靠的RNA保存效果^16,17,18,19。对于较早的胚胎阶段（E12.5及以下），固定剂渗透迅速，应相应缩短固定时间以防止过度固定。从胚胎第17.5天（E17.5）开始以及出生后样本中，由于头部皮肤的存在形成物理屏障，固定剂的渗透效率可能降低。因此，应去除整个头部的皮肤，以确保固定液有效渗透。脱钙可在含0.5%无甲醇甲醛的0.5 M EDTA（pH 8.0）溶液中于4 °C进行⁷。脱钙过程可通过快速微型CT扫描进行监测，并根据矿化程度和具体组织类型调整时间；对于E18.5胚胎，通常24–48小时即可充分脱钙。
2. 清洗并处理组织。
   1. 去除固定液，用PBS清洗样本。将组织转移至70%乙醇中，并在4 °C保存至后续处理（1–4周）²⁰。按照制造商说明，使用自动组织处理仪完成组织脱水、透明和石蜡浸润。
      ​注意：典型的组织处理程序如下：70%乙醇中30分钟，随后95%乙醇中30分钟（两次），再100%乙醇中30分钟（三次），完成脱水；二甲苯中透明1小时（三次），然后在60 °C下用石蜡浸润1小时（三次），最后包埋成石蜡组织块。
3. 包埋组织。
   1. 将头部组织包埋于石蜡中，并根据实验需求将样本定向为冠状面或矢状面。
   2. 将包埋好的组织块转移至石蜡块冷盘上，使石蜡硬化约30分钟，具体时间可根据组织块大小适当调整。
4. 储存FFPE组织块。
   1. 待石蜡完全凝固后，将组织块从模具中取出，放入标记好的密封容器或自封袋中，在4 °C保存直至切片。
      注意：RNA保存良好的FFPE组织块可在不损害组织完整性的前提下储存数年，再进行切片。

3. 多重荧光RNA原位杂交用福尔马林固定石蜡包埋组织的处理

1. 准备无RNase的工作环境。
   1. 使用70%乙醇对所有工作台面和仪器进行消毒。对台面、工具和手套使用RNase去污染溶液处理，以最大限度减少RNA降解。
   2. 设置切片机并安装新刀片。将 Clearance 角度设为10°。使用前，对镊子和刷子用RNase去污染溶液处理。
      ​注意：切片时务必使用新刀片，以获得精确的组织切片。刀片角度显著影响切片质量、组织完整性、厚度均匀性以及形态学特征的保存。
2. 准备漂浮水浴。
   1. 在漂浮水浴槽中加入超纯实验室级水。
   2. 根据胚胎发育阶段和组织特性，将水温调节至40–43 °C。
3. 修整并固定FFPE组织块。
   1. 去除包埋组织周围多余的石蜡。将FFPE组织块置于冰上冷却，然后固定到切片机的冷台上。
4. 修切至目标区域。
   1. 将石蜡块切面与切片机刀片对齐，以12 µm的步长进行修切，直至在冠状切面上出现目标区域（例如磨牙或切牙附近区域）。
   2. 根据需要重新调整组织块和刀片位置，以获得对称且方向正确的全头冠状或矢状切片。
5. 切取组织切片。
   1. 到达目标区域后，切取5–7 µm的切片。将切片漂浮于水浴中，使其缓慢舒展并展平，再转移至载玻片上。
6. 贴片并干燥切片。
   1. 将切片贴附于带正电荷的玻璃载玻片上。在光学显微镜下检查载玻片，确认切片方向正确且组织完整。
   2. 在进行多重荧光RNA原位杂交（ISH）检测前，将载玻片置于40 °C的切片烘片台上过夜干燥。

4. 第1天：脱蜡和复水

1. 烘烤载玻片。
   1. 将带有FFPE切片的载玻片在60 °C下烘烤1小时。
      ​注意：如果载玻片不立即使用，可在室温（RT）下未烘烤保存，置于含干燥剂的容器中，保存时间为1–4周。长期储存可能导致RNA降解。
2. 平衡载玻片。
   1. 将FFPE组织切片在室温（RT）下平衡10分钟。
3. 脱蜡并水化切片。
   1. 将载玻片浸入二甲苯或二甲苯替代品中，在室温下轻轻振荡5–10分钟。重复此步骤一次，以确保完全去除石蜡。
      注意：使用二甲苯的操作应在化学通风橱中进行。若使用低毒性二甲苯替代品，则可在化学通风橱外操作。
   2. 将载玻片转移至100%乙醇中，在室温下孵育2分钟。重复一次以去除残留的二甲苯。再将切片在70%乙醇中水化2分钟。
   3. 用PBS冲洗切片3次。然后加入一滴PBS，足以完全覆盖切片，并立即进行下一步操作。

5. 在福尔马林固定石蜡包埋组织切片上进行多重荧光RNA原位杂交

注意：本研究遵循制造商的说明，使用 RNAscope 技术在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上进行多重荧光 RNA 原位杂交（ISH）²¹。

1. 第1天：预处理与探针杂交
   1. 绘制疏水屏障。
      1. 使用疏水屏障笔在每张组织切片周围绘制疏水圈。将载玻片在室温（RT）下静置晾干约10分钟。
      2. 确保组织切片始终被PBS覆盖，以防止干燥。
         ​注意：使用无尘擦拭纸（镜头纸）擦干组织周围的载玻片区域，同时保持组织湿润。确保屏障笔的墨水不接触组织切片。
   2. 进行预处理。
      1. 加入定制的预处理试剂，完全覆盖每个切片。将载玻片置于杂交炉内的湿化 chamber 中，在40 °C下孵育30分钟。
         注意：对于所有以滴瓶形式提供的试剂，添加足够滴数以完全覆盖屏障内的组织区域。确保所有试剂在使用前恢复至室温（RT）。
   3. 清洗切片。
      1. 用PBS多次冲洗切片，然后在新鲜PBS中于室温（RT）孵育2分钟。
         注意：使用5 mL移液管对每张载玻片单独进行PBS洗涤。在2分钟洗涤过程中，确保切片始终完全浸没于PBS中。
   4. 淬灭内源性过氧化物酶活性。
      1. 向每个切片加入3%过氧化氢，于室温（RT）孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
   5. 重复洗涤步骤。
      1. 在PBS中于室温（RT）洗涤载玻片2分钟，重复两次。
   6. 准备探针。
      1. 将探针在40 °C预热10分钟，使用前冷却至室温（RT）。
   7. 配制探针混合液。
      1. C1探针以1×工作液形式提供，可直接使用。
      2. 相比之下，C2、C3和C4探针以50×浓缩液形式提供；需用C1探针溶液稀释这些探针。若未使用C1探针，则使用制造商提供的探针稀释液稀释C2、C3和/或C4探针。
   8. 进行探针杂交。
      1. 向每个组织切片加入30–40 µL探针混合液，确保完全覆盖。将载玻片置于杂交炉内的湿化 chamber 中，在40 °C下孵育2小时。
         注意：在学习RNAscope技术时，建议在测试运行中同时包含阴性对照和阳性对照探针。此方法有助于验证实验并确认操作质量。需注意的一个潜在限制是，某些制造商提供的阳性对照探针可能在目标组织中不表达。为解决此问题，可使用细胞类型特异性探针。例如，Col1a1 是结缔组织可靠的阳性对照。可首先对 Col1a1（或其他已知高表达基因）进行染色，以评估样本中RNA的保存状况和组织形态。掌握该技术后，通常通过处理无探针但使用其余所有试剂的切片来进行阴性对照。该方法可提供各检测通道背景信号的关键信息。标准Multiplex V2试剂盒支持同时对最多四种不同探针进行染色和成像。当基因表达水平已通过前期转录组学研究确定时，建议将低表达基因分配至Cy5和Cy7通道，高表达基因则置于GFP和RFP通道以实现最佳检测。若所有探针均不靶向高表达基因，则应保留GFP通道不使用。这使得GFP通道可作为RFP通道背景扣除的参考，从而提高低表达靶标的信号检测准确性。
   9. 用洗涤缓冲液冲洗。
      注意：商用20×洗涤缓冲液在使用前已用无RNase水稀释至1×。
      1. 用试剂盒提供的1×洗涤缓冲液在室温（RT）下洗涤载玻片2分钟，重复两次。
   10. 在5×柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液中孵育。
       ​注意：商用20× SSC缓冲液 （3 M NaCl，0.3 M柠檬酸钠，pH 7.0）在使用前已用无RNase水稀释至5×。
       1. 洗涤后，在室温（RT）下用5× SSC缓冲液过夜孵育切片。
2. 第2天：信号扩增、荧光标记与封片
   1. 洗涤载玻片。
      1. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液洗涤载玻片2分钟，重复两次。
   2. 执行扩增步骤。
      1. 向每个切片加入扩增1试剂，在湿化 chamber 中40 °C孵育30分钟。
      2. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      3. 加入扩增2试剂，在40 °C孵育30分钟。
      4. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      5. 加入扩增3试剂，在40 °C孵育15分钟。
         注意：无论开发哪个通道（探针），所有三个扩增步骤均为必需。
      6. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
   3. 开发辣根过氧化物酶（HRP）与荧光染料。
      1. 计算所需荧光染料体积（通常每张载玻片100–200 µL），并稀释Opal荧光染料原液。
         ​注意：荧光染料推荐稀释倍数为1:300–1:1500。在本实验中，Opal Polaris 780（荧光染料试剂）以1:500比例在抗体稀释液中稀释，其余染料均以1:1000比例在TSA缓冲液中稀释。应尽可能避免载玻片暴露于光照下。
      2. 加入HRP-C1试剂，在40 °C孵育15分钟。
      3. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      4. 向每个切片加入30–40 µL Opal染料（如Opal 570或Opal 690），在40 °C孵育30分钟。
      5. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      6. 加入HRP阻断剂，在40 °C孵育15分钟。
      7. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      8. 加入HRP-C2或HRP-C3试剂，在40 °C孵育15分钟。
      9. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      10. 加入第二种Opal染料30–40 µL，在40 °C孵育30分钟。
      11. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      12. 加入HRP阻断剂，在40 °C孵育15分钟。
      13. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      14. 加入HRP-C3或HRP-C4试剂，在40 °C孵育15分钟。
      15. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
   4. 进行酪胺信号放大-地高辛（TSA-DIG）及荧光染料标记（如适用）。
      1. 每张切片加入30–40 µL稀释后的TSA-DIG试剂，在室温（RT）下孵育30分钟。
      2. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      3. 加入封闭试剂，在40 °C孵育15分钟。
      4. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
      5. 加入30–40 μL稀释后的荧光染料试剂，在40 °C孵育30分钟。
      6. 在室温（RT）下用1×洗涤缓冲液冲洗两次，每次2分钟。
   5. 进行复染与封片。
      1. 加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），在避光条件下室温（RT）孵育5分钟。
      2. 洗去DAPI后立即使用抗荧光淬灭封片剂封片，轻柔加盖盖玻片，避免产生气泡。选择与组织覆盖面积相匹配的盖玻片尺寸。
      3. 在避光条件下室温（RT）干燥2小时，随后将载玻片于4 °C长期保存。
         ​注意：若在黑暗中以适当的抗荧光淬灭封片剂封片并在4 °C保存，荧光信号可稳定保存长达一年。
   6. 进行成像。
      1. 使用配备LED光源及光谱分离滤光片的多通道荧光显微镜进行成像（图2A）。激发和发射波长设置如下：DAPI（353/465 nm）、FITC（495/519 nm）、Cy3（548/561 nm）、Cy5（650/673 nm）和Cy7（747/773 nm）。特定滤光片可最大限度减少光谱重叠，区分蓝色、绿色、橙色、红色和近红外信号。
      2. 所有样本均采用相同的曝光和照明设置采集图像，以确保一致性并支持可靠的比较分析。

结果

利用所述方案（图1），我们在蔡司显微镜平台上对小鼠完整头部进行了多重荧光mRNA原位杂交转录本检测成像（图2B）。可通过侧边标签（黄色框）选择特定的图像视图，同时利用通道标签（红色框）可同时显示多个通道。通过显示标签下的控制选项（绿色框），可直接调节实时图像的亮度、伽马值和对比度，以优化关键特征的可见性。

我们还展示了使用多重基因检测面板对野生型新生小鼠头部矢状切片进行检测所获得的转录本可视化结果，该面板可检测Sfrp2、Dspp和Dkk1（图2C）。高倍镜图像揭示了下颌门齿及其周围骨组织中基因表达的独特模式，突出了每种转录本精确的空间定位。综上所述，这些结果表明，采用所述实验方案进行多重荧光RNA原位杂交（ISH），能够实现对颅面发育组织中基因表达的准确、高分辨率定位分析。

多重荧光RNA原位杂...

讨论

原位 杂交技术作为研究基因表达的基础工具已有四十多年历史，并经历了持续的优化。然而，传统的原位杂交（ISH）方法通常受限于灵敏度低、背景信号高以及耗时且劳动密集的实验流程。这些局限性限制了其更广泛的应用，尤其是在需要精确空间分辨率和检测低丰度转录本的复杂颅面组织中。多重荧光RNA原位杂交通过其独特的探针设计和信号放大策略克服了诸多上述挑战，该策略可选择性地放大靶标特异性信号，同时最大限度地减少非特异性背景信号³。因此，该方法实现了显著改善的信噪比，能够在单细胞甚至亚细胞水平上对转录本进行高分辨率定位。

多重荧光RNA原位杂交（ISH）是一种高度敏感且特异的技术，显著推动了在完整组织环境中对细胞水平基因表达进行空间定性与定量分析的发展。与传统的ISH方法不同，多重荧光RNA ISH能够检测几乎所有转录本，包括丰度极低的mRNA，并且适用于技术上具有挑战性的样本，如钙化组织⁴。尽管具有这些优势，该技术在牙组织中的应用仍面临挑战，原因在于牙齿独特的结构和组成特征，包括高度矿化...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1×PBS	赛默飞世尔科技	10010023	使用  在实验流程中进行洗涤步骤
20×SSC	赛默飞世尔科技	J60839.K2	用于制备 1´ 洗涤缓冲液
50 mL 圆底离心管（Ambion），无RNA酶	赛默飞世尔科技	AM12502	用于在不同溶液中储存样品
高级轨道摇床	VWR	6683-470	用于在孵育期间振荡固定液中的组织
酒精，70%，Fisherbrand，HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	用于清洁和消毒所有工作区域
抗体稀释液	Akoya Biosciences	ARD1001EA	TSA-DIG 稀释液
全自动真空组织处理仪	Leica Biosystems	ASP300S	用于样品的透明、脱水、复水和石蜡浸入
盖玻片厚度1.5，25 mm × 25 mm	康宁	2850-25	用于 Visium HD 工作流程中载玻片的封片
定制预处理试剂	ACD，Bio-Techne	300040	为了优化组织通透性和靶标可及性
EDTA	默克生命科学	03690	用于脱钙矿化组织
乙醇 100%	AeroBase集团	6505001050000	用于在处理过程中去除二甲苯并使样本复水
HistoCore 水浴锅	Leica Biosystems	HIS2326	用于在40–43℃下漂浮切片 °C 以去除 FFPE 切片中的皱褶
HybEZ 加湿纸	ACD，Bio-Techne	310015	在HybEZ烤箱内使用，以保持湿度并防止组织切片在杂交过程中干燥
HybEZ 烤箱、托盘和支架	ACD，Bio-Techne	310011, 310012, 310014	用于在杂交和孵育步骤中提供受控的温度、湿度以及正确的载玻片定位
ImmEdge 疏水屏障笔	Vector Laboratories	H-4000	用于在载玻片上绘制疏水性边界，以在染色过程中将试剂限定在组织切片区域。
低剖面一次性刀片 DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	用于切片FFPE组织块
10% 中性缓冲福尔马林	Azer Scientific	NBF-4-G	用于固定组织
OPAL 520 试剂盒	Akoya Biosciences, Inc.	FP1487001KT	通过荧光标记扩增并检测目标RNA信号。
OPAL 570 试剂盒	Akoya Biosciences, Inc.	FP1488001KT	通过荧光标记扩增并检测目标RNA信号。
OPAL 620 试剂盒	Akoya Biosciences, Inc.	FP1495001KT	通过荧光标记扩增并检测目标RNA信号。
OPAL 690 试剂盒	Akoya Biosciences, Inc.	FP1497001KT	通过荧光标记扩增并检测目标RNA信号。
Opal Polaris 780 试剂盒	Akoya Biosciences, Inc.	FP1501001KT	通过荧光标记扩增并检测目标RNA信号。
普洛朗钻石	赛默飞世尔科技	P36970	一种抗荧光淬灭封片介质，用于在成像过程中保护荧光信号并维持RNAscope信号
RNAscope 4-Plex 辅助试剂盒 特定用户界面	ACD，Bio-Techne	323120	RNAscope 多重荧光 v2 检测试剂盒的附加材料
RNAscope DAPI	ACD，Bio-Techne	320858	一种用于RNAscope检测的荧光核染料，用于显示细胞核
RNAscope 多重荧光试剂盒 v2	ACD，Bio-Techne	323100	进行多重荧光原位杂交
RNAscope 多重 TSA 缓冲液	ACD，Bio-Techne	322810	用于RNAscope中稀释opal染料的缓冲液
RNAscope 洗涤缓冲液试剂	ACD，Bio-Techne	310091	用于在检测过程中洗涤载玻片上的组织切片
RNaseZap RNase 去污染溶液	Thermo Fischer	AM9782	用于清洁和去除RNase
半自动旋转式切片机	Leica Biosystems	RM2245	按照指南中所述方法对FFPE组织块进行切片。
Slide Brite	电子显微镜科学	23401-01	用于RNAscope处理前的脱蜡步骤。
带盖玻片加热板	首映	XH2004	用于在不同温度下孵育载玻片
Superfrost Plus 载玻片	Fisher Scientific	12-550-15	用于连接 Vsium HD 的部件
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	用于组织浸润和包埋
组织培养培养皿 100 × 20 毫米 500 个/箱	Fisher Scientific	877222	用于在1中收集和解剖样本´ PBS
二甲苯	Fisher Scientific	6.81001E+12	用作透明剂以去除酒精并使组织透明