本研究通过遗传学分析确定了八个潜在的心力衰竭药物靶点，并探索了与这些靶点相关的候选治疗化合物。
研究文章
本研究通过遗传学分析确定了八个潜在的心力衰竭药物靶点，并探索了与这些靶点相关的候选治疗化合物。
心力衰竭（HF）是一种常见的心血管疾病，在疾病晚期会显著损害患者的生活质量。尽管目前已有多种治疗策略，HF 的疾病负担仍然沉重。因此，迫切需要探索新的治疗靶点。本研究采用孟德尔随机化（MR）方法，评估了可药物靶向基因与 HF 之间的因果关系。通过共定位分析和基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR）进一步验证了这些关联。最终，共识别出 8 个 HF 的潜在治疗靶点，其中包括 4 个风险因子（CYP11A1、GALT、KCNH2 和 METRN）和 4 个保护性因子（APOM、CHD4、IL11RA 和 LPAR5）。基因本体（GO）富集分析、KEGG 通路富集分析以及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析表明，这些基因主要参与代谢调控和心脏电生理过程。此外，通过药物预测和分子对接技术，识别出针对这些靶点的潜在药物，包括米托坦（mitotane）、Adehl、苯并呋喃类（Benzofurans）、1,3-二-邻-甲苯基胍（1,3-Di-o-tolylguanidine）、96-69-5 和溴代烯醇内酯（bromoenol lactone）。进一步的 PCR 结果也表明，米托坦可能与 CYP11A1 和 KCNH2 相关。基于这些潜在治疗靶点设计的药物可能具有更高的成功率，并改善临床预后。
心力衰竭（HF）是一种常见的心血管综合征，其特征是心室充盈或心肌收缩功能受损，导致心输出量不足以满足机体代谢需求1,2,3。临床上，HF表现为肺循环和体循环淤血、组织灌注不足，以及呼吸困难、乏力和外周水肿等症状1,4,5。尽管治疗手段不断进步，HF仍是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一，根据全球疾病负担（GBD）研究数据显示，全球受影响人数超过6400万6,7,8。巨大的疾病负担凸显了开发新型治疗策略的迫切需求。
目前针对心力衰竭（HF）的药物和器械干预措施受限于疗效欠佳和不良反应，导致再住院率居高不下且生活质量受损9,10,11,12。因此，识别与HF发病机制具有因果关系的新型分子靶点，对于改善临床结局至关重要。将基因组学整合到药物研发中是一种高效策略，可显著提高研发效率，因为经过遗传学验证的疗法在临床试验中具有明显更高的成功率13,14,15。此外，这些可干预基因编码的蛋白质是小分子药物和单克隆抗体的理想治疗靶点16,17。
人类遗传学的最新进展通过整合分析全基因组关联研究（GWAS）和表达数量性状位点（eQTL）数据，促进了药物靶点的优先筛选。孟德尔随机化（MR）利用遗传变异作为工具变量来估计因果效应，从而最大限度地减少观察性研究中固有的混杂因素和反向因果关系13,14。当该方法与共定位分析及基于汇总统计的MR（SMR）相结合时，能够稳健地筛选出其表达调控可能影响疾病风险的基因，为靶点发现提供了一种基于遗传证据的策略18,19,20。与传统的关联研究相比，整合MR、SMR和共定位分析可克服混杂因素和反向因果关系，从而建立更为可靠的因果推断。此外，该框架通过确保基因表达与心力衰竭风险共享相同的潜在因果变异，过滤由连锁不平衡导致的假阳性信号，优化靶点优先排序。值得注意的是，尽管心血管组织具有高度特异性，本研究主要采用大规模血液顺式eQTL数据以最大化统计效能。虽然这种方法可能无法完全捕捉心力衰竭（HF）固有的组织特异性机制，但来源于血液的遗传变异仍可作为易于获取的生物标志物，为系统性遗传驱动因素提供有力见解。
本研究利用大规模全基因组关联研究（GWAS）和表达数量性状位点（eQTL）数据集，评估了可药靶基因对心力衰竭（HF）风险的因果效应。通过共定位分析和SMR分析进一步验证了显著关联。为阐明优先靶点的生物学功能，开展了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。随后通过药物预测和分子对接评估其治疗潜力。最后，对选定的可药靶基因与候选药物之间的关联进行了验证 体外 实验。
总之，本研究为发现心力衰竭（HF）新的治疗靶点提供了重要见解。通过采用孟德尔随机化（MR）、SMR、共定位分析、基因富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建、药物预测和分子对接等方法， 体外 实验结果可能有助于开发更有效的射血分数降低型心力衰竭（HF）治疗策略。
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本研究中使用的所有数据集均来自先前已发表且获得伦理批准的研究。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 研究设计
本研究的工作流程如图1所示。首先，从可药物靶点基因的顺式表达数量性状位点（cis-eQTLs）获取暴露数据。其次，采用孟德尔随机化（MR）分析探究可药物靶点基因与心力衰竭（HF）之间的因果关系。随后通过共定位分析和SMR分析鉴定HF的候选治疗靶点。接着进行基因富集分析并构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。最后，通过药物预测和分子对接分析，探索药物与基因之间的结合亲和力。
2. 数据来源
从两个来源共鉴定出6,888个可成药基因。其中一个数据集包含来自先前已发表研究的4,463个基因，该研究整合了多个数据来源17。另一个数据集包含来自药物-基因相互作用数据库（Drug-Gene Interaction Database, DGIdb）的5,012个基因21。详细信息可在其网站（https://www.dgidb.org/）上查看。在合并并去除重复项后，共保留了6,888个唯一的可成药基因用于分析。
顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）数据来自eQTLGen联盟（https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html），该联盟包含来自31,684份血液样本的表达谱数据，覆盖16,987个基因22。
HF 汇总统计信息来自 FinnGen 数据库的 R12 版本23，该版本包含 37,653 例病例和 462,695 例对照。HF 的诊断依据为国际疾病分类（International Classification of Diseases, ICD），包括 ICD-10—I11.0、I13.0、I13.2、I50，ICD-9—4029B|428，以及 ICD-8—42700|42710|428|7824。所有参与者均为欧洲血统。详细信息可参见 FinnGen 官方网站及原始文章（https://www.finngen.fi/en/access_results）。
3. 孟德尔随机化分析
根据三个核心孟德尔随机化（MR）假设选择工具变量（IVs）24。首先，工具变量与暴露因素直接相关；其次，工具变量不与混杂因素相关；最后，工具变量仅通过暴露因素影响结局。鉴于近端表达数量性状位点（eQTLs）对靶基因具有更直接且更强的调控作用，本研究在孟德尔随机化分析中仅使用位于基因100 kb区域内的单核苷酸多态性（SNPs），以最大化生物学上的邻近性。SNP的选择采用了严格的标准：所有入选的SNPs均位于每个可成药基因转录起始位点上游100 kb和转录终止位点下游100 kb范围内。仅纳入全基因组显著性水平（p < 5×10-8）的SNPs25。为减少连锁不平衡（LD）的影响，采用r2阈值为0.001、聚类距离为10,000 kb的条件进行LD聚类分析26。保留F统计量>10的SNPs，其计算公式为：F = [R2(N−k−1)]/[k(1−R2)]27。SNP的具体信息见补充表1。
主要的分析方法为逆方差加权法（IVW）和沃尔德比值法。 pP 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性28,29采用假发现率（FDR）对 p 值进行校正，以尽量减少假阳性结果30当仅有一个SNP可用时，采用Wald比率法；否则应用IVW法。当SNP数量足够时，分析还包括MR-Egger、加权中位数、加权众数和简单众数方法。
采用 Cochran's Q 检验和 MR-Egger 截距分析来检验异质性和多效性。Q-p 值大于 0.05 表示不存在异质性31。MR-Egger 截距的 p 值小于 0.05 表示存在定向多效性18。最后，进行留一法检验，以判断单个 SNP 是否会影响结果。MR 分析使用 R（版本 4.4.2）中的 TwoSampleMR 软件包（版本 0.6.11）进行。
4. 共定位分析
使用 coloc R 软件包（版本 6.0.1）进行共定位分析，以确定是否存在共同的遗传变异同时影响基因表达和心力衰竭（HF）风险32。设定单核苷酸多态性（SNP）与任一性状相关以及与两个性状均相关的先验概率分别为 1 × 10-4 和 1 × 10-5。可计算出五个假设的后验概率：（1）PPH0：SNP 与两个性状均无关联；（2）PPH1/PPH2：SNP 与基因表达或 HF 相关；（3）PPH3：SNP 与 HF 和基因表达相关，但由不同的 SNP 驱动；（4）PPH4：SNP 与 HF 和基因表达相关，并由相同的 SNP 驱动。当 PPH4 > 0.8 时，被视为存在共定位的证据。
5. SMR 分析
采用SMR软件（版本1.3.1）进行SMR分析，以探究基因与心力衰竭（HF）之间的关系33。通过依赖工具异质性（HEIDI）检验判断所观察到的关联是否由连锁引起。若SMR的p值显著（< 0.05），同时HEIDI的p值不显著（> 0.05），则解释为支持存在真实的因果关系，而非由连锁引起的关联。详细的实验操作流程和计算参数设置可访问官方网站获取。
6. 富集分析
采用 GO 和 KEGG 富集分析来表征筛选出的潜在治疗靶点基因的生物学功能和通路34。GO 富集分析包括生物学过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）。使用 R 软件包 clusterProfiler（版本 4.14.6）和 Pathview（版本 1.46.0）进行富集分析35,36。
7. 候选药物预测
为了鉴定潜在的治疗性化合物，使用药物特征数据库（Drug Signatures Database，DSigDB）（http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/）37 进行了药物预测分析。DSigDB 包含 22,527 个基因集，涵盖 17,389 种独特化合物，涉及 19,531 个基因。分析了候选基因与化合物之间的关联，随后进行富集分析，以鉴定可能靶向心力衰竭相关基因的潜在相关药物。
8. 蛋白质相互作用网络构建
使用 GeneMANIA（https://genemania.org/）38 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。GeneMANIA 可用于生成基因功能假设、分析基因列表以及对基因进行功能验证的优先级排序。
9. 分子对接
采用分子对接验证基因的可成药性及其与候选药物的关系。对接模拟有助于评估化合物与靶标蛋白之间的结合亲和力及相互作用模式，从而为候选药物的优先筛选和优化提供依据。蛋白质结构从蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）（http://www.rcsb.org/）获取，化合物结构则来自PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）39。分子对接使用CB-Dock2（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php）进行，该工具通过结合腔检测来引导盲对接40,41。详细的实验操作流程和计算参数设置信息可参考其官方网站。
10. 细胞培养
人永生化心肌细胞（AC16）在无菌条件下，使用AC16细胞专用培养基进行培养。细胞置于含5% CO2的湿润培养箱中，于37 °C恒温培养。每2–3天更换一次培养基，当细胞融合度达到约70%–80%时进行传代，以维持最佳生长状态。每次实验前均通过光学显微镜常规观察细胞形态和融合度。所有细胞培养操作均在生物安全柜中进行，以最大限度降低污染风险。在处理实验中，将AC16细胞接种于6孔板中，待其过夜贴壁后开始给予处理。
11. 定量反转录 PCR（RT-PCR）
AC16细胞在达到约60%–70%融合度后，用200 µM棕榈酸（PA）或20 µM米托坦处理24小时。PA溶于牛血清白蛋白（BSA）中，而米托坦溶于二甲基亚砜（DMSO）中。所有可能具有危害性的试剂均按照标准实验室安全规程操作，并使用适当个人防护装备，包括手套和实验服。
处理后，在无RNase条件下，按照试剂盒制造商的说明使用RNA提取试剂盒提取总RNA。尽可能在冰上进行RNA提取操作，以最大限度减少RNA降解。在进行下游实验前检测RNA浓度和纯度，仅使用A260/A280比值在1.8至2.0之间的样品进行后续分析。
使用逆转录试剂盒，按照制造商的说明书合成互补DNA（cDNA）。随后在实时荧光定量PCR检测系统上，使用SYBR Green Master Mix进行定量RT-PCR。每个反应体系总体积为10 µL，包含5 µL SYBR Green Master Mix、0.4 µL上游引物、0.4 µL下游引物、1 µL cDNA模板以及3.2 µL无核酸酶水。扩增程序如下：95 °C预变性30 s，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性5 s，60 °C退火/延伸30 s。每个实验设置三个生物学重复，所有反应均设三个技术重复。
GAPDH 作为内参基因，采用 2−ΔΔCt 法计算 CYP11A1 和 KCNH2 的相对 mRNA 表达水平。熔解曲线中出现单一峰提示特异性扩增。RT-PCR 所用引物序列见补充表 2。
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孟德尔随机化
评估药物靶点基因表达与心力衰竭（HF）之间因果效应的MR结果见补充表3。以FDR校正后的P值小于0.05为具有统计学显著性。共鉴定出11个与HF存在显著因果关联的基因（图2）。其中，6个基因与HF风险增加相关，包括CDKN1A (P_FDR: 0.03, OR: 1.293)、CYP11A1 (P_FDR: 0.034, OR: 1.494)、GALT (P_FDR: 0.042, OR: 1.074)、KCNH2 (P_FDR: 0.018, OR: 1.163)、LST1 (P_FDR: 0.03, OR: 1.112)和METRN (P_FDR: 0.018, OR: 1.115)。其余5个基因则与HF风险降低相关，包括APOM (P_FDR: 0.03, OR: 0.773)、CAMK2G (P_FDR: 0.018, OR: 0.699)...
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本研究通过孟德尔随机化（MR）系统评估了可药物靶向基因对心力衰竭（HF）风险的因果效应，鉴定了八个潜在的治疗靶点。其中包括四个保护性因素（APOM、CHD4、IL11RA 和 LPAR5）以及四个风险因素（CYP11A1、GALT、KCNH2 和 METRN）。这些关联关系进一步得到了共定位分析和SMR结果的支持。通过GO、KEGG富集分析及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的功能注释表明，这些基因可能主要通过与代谢和电生理学相关的通路影响心力衰竭。此外，药物预测和分子对接研究凸显了这些靶点的转化潜力。
APOM 被确定为心力衰竭（HF）的保护性因子。APOM 可结合鞘氨醇-1-磷酸（S1P），通过降低 TNF-α 表达、减少单核细胞-内皮细胞黏附以及维持内皮屏障完整性，发挥抗炎作用，从而减轻炎症引起的心肌损伤42,43,44。此外，APOM 能支持心肌细胞的存活与增殖，同时减少细胞凋亡，从而保...
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作者声明不存在任何竞争利益。
感谢FinnGen研究的参与者和研究人员。同时感谢eQTLGen联盟、DGIdb以及其他为本研究分析提供公开数据的研究人员。本研究得到了重庆医科大学第一临床学院硕士研究生科研创新项目（CYYY-SSCX202516）和心力衰竭标准化诊疗项目（2025cyjstg006）的资助。
作者贡献
Huiling Zhu 参与了研究构想、经费获取、调查研究、方法学设计、资源提供、软件开发、研究监督、结果验证、初稿撰写以及稿件的审阅与修改。Suxin Luo 参与了经费获取、方法学设计、研究监督以及稿件的审阅与修改。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2× 通用 SYBR Green 快速 qPCR 混合液 | Abclonal | RK21203 | |
| AC16 | HyCyte | TCH-C119 | |
| AC16 细胞专用培养基 | HyCyte | TCH-G119 | |
| cDNA 反转录试剂盒 | Abclonal | RK20400 | |
| CFX96™ 实时定量 PCR 系统 | Bio-Rad Laboratories | ||
| 米托坦 | TargetMol | T1199 | |
| 棕榈酸 | TargetMol | T2908 | |
| RNA 提取试剂盒 | Abclonal | RK30120 |
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