一种用于建立小鼠慢性创伤性脑损伤模型的重复性落锤损伤方法

摘要

本文介绍了一种建立重复性闭合性轻度创伤性脑损伤小鼠模型的实验方案，用于研究在无明显脑结构损伤情况下慢性抑郁样行为的潜在机制。

摘要

创伤性脑损伤（TBI）可导致持续性的神经病理学改变以及长期的神经精神后遗症。在恢复过程中，即使常规的计算机断层扫描或磁共振成像未发现明显的结构性异常，仍有相当一部分患者出现情感障碍，包括抑郁症状和睡眠相关主诉。为了研究慢性创伤后神经精神症状的潜在机制，亟需能够重现这些特征的实验模型。本文介绍了一种建立重复性闭合性轻度创伤性脑损伤小鼠模型的实验方案，用于研究在肉眼检查和T2加权磁共振成像无法检测到明显结构性脑损伤的情况下，慢性类抑郁行为的潜在机制。该方法通过暴露完整颅骨，并在连续五天内使用预设的落锤参数进行反复撞击。在本方案所述条件下，该操作可造成闭合性头部损伤，但不引起明显的颅骨骨折或肉眼可见的局灶性挫伤。在损伤后一段时间，小鼠表现出类抑郁行为，但在本研究使用的条件下，肉眼检查或T2加权磁共振成像均未发现明显的局灶性结构性异常。该方案为研究重复性轻度创伤性脑损伤后的慢性类抑郁行为以及评估潜在治疗干预措施提供了一种实验途径。

引言

然而，由于当前范式主要对头部固定的实验小鼠施加线性冲击，因此应将其视为一种优化用于研究慢性情感性结局的闭合性头部重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）模型，而非运动相关性脑震荡或轻微交通事故损伤的直接生物力学模拟。创伤性脑损伤（TBI）目前是导致创伤相关发病率和死亡率的主要原因之一，给家庭和社会带来了巨大的医疗和经济负担^1,2。值得注意的是，TBI 后中枢神经系统的损伤并非短暂存在，而是通常以慢性且进行性的方式发展。一项关于 TBI 的研究显示，即使在受伤后 18 年，小胶质细胞的活化仍持续存在，长期的慢性神经炎症继续导致严重的神经退行性变³。流行病学数据显示，在漫长的恢复阶段中，高达 28%–32% 的患者会发展为严重的情感障碍⁴。本文中，rmTBI 指重复性轻度创伤性脑损伤诱导范式，而随后以持续性行为改变为特征的慢性损伤后阶段则称为慢性创伤性脑损伤（c-TBI）。此处使用 c-TBI 一词旨在描述 rmTBI 后以持续性行为改变为特征的慢性损伤后状态，而非指代一种独立的损伤范式。这一用法在概念上与我们先前的研究一致，后者表明实验性 TBI 可演变为一种与长期组织病理学和行为异常相关的进行性慢性过程。

这些慢性神经精神后遗症严重损害了患者的生活质量和功能预后⁵。然而，这些继发性情感障碍的确切发病机制仍不明确，临床治疗选择极为有限。因此，研究创伤性脑损伤（c-TBI）诱导的类抑郁行为的机制，并确定精确的治疗靶点，具有迫切的临床需求和重要的实际意义。

为了阐明创伤性脑损伤（TBI）的病理机制，研究人员已开发出多种动物模型，其中控制性皮层冲击（controlled cortical impact, CCI）模型是目前应用最广泛的模型之一^6,7。CCI 模型能够精确控制冲击参数，从而产生高度可重复的局灶性损伤。然而，CCI 模型和传统的液体冲击损伤（fluid-percussion injury, FPI）模型通常都需要进行开颅手术。这些方法在研究局灶性挫伤、组织丢失以及严重损伤相关的神经炎症反应方面具有重要价值，但它们更倾向于模拟严重的开放性 TBI，这与临床上最常见的轻度闭合性头部损伤（如运动相关性脑震荡）的表现存在显著差异^8,9。关键在于，开颅和冲击所导致的脑组织坏死、胶质瘢痕形成以及晚期空洞化带来了两个主要局限性。首先，严重的结构缺损常引发运动功能障碍，从而直接影响行为学结果的准确评估；其次，组织的物理性缺失会切断长距离的神经投射。先前在 CCI 诱导的 TBI 模型研究中已证实，小鼠会出现显著的局灶性脑挫伤⁴。这种结构破坏严重限制了病毒示踪等先进神经解剖学技术的应用，使得探究精神症状及其相关神经环路变得极为困难。因此，尽管这些模型在严重或局灶性 TBI 研究中仍具价值，但在研究重复性轻度闭合性头部损伤后的慢性情感异常时，尤其是当结构完整性对行为学和环路水平分析至关重要时，其适用性可能较低。

为了克服上述严重开放性创伤性脑损伤模型的局限性，本研究详细描述了一种利用落锤法在未开颅、颅骨完整的条件下建立重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠模型的实验方案。该方案采用精确设定的撞击参数：下落高度为25 cm，撞击重量为20 g。撞击部位定位于矢状缝左侧2 mm、冠状缝后方2 mm处，使用直径为4 mm的弧形金属撞击头，以确保撞击力的准确性和一致性。此外，连续五天重复施加撞击的特定频率，有助于维持慢性病理改变的稳定性。通过磁共振成像（MRI）、组织病理学和行为学检测的综合评估表明，该小鼠模型表现出显著的类抑郁样行为，同时保留了大脑整体结构的完整性，未出现明显的局灶性挫伤或运动功能障碍。该表型特征反映了重复性轻度头部损伤的部分行为学特点，包括在常规神经影像学检查未见明显结构异常的情况下出现类似神经精神方面的改变^10,11,12,13。然而，由于当前实验范式主要对头部固定的动物施加线性撞击，因此应将其理解为一种专为研究慢性情绪相关结局而优化的闭合性头部rmTBI 模型，而非对运动相关脑震荡或轻微交通事故损伤的直接生物力学模拟。

方案

所有动物实验程序均经合肥综合性国家科学中心人工智能研究院机构动物护理与使用委员会批准（批准号：IAI2024071004）。所有操作均遵循机构及国家关于实验动物护理与使用的指南。实验方案的示意图见图1。可使用其他供应商提供的等效设备，前提是保持关键性能参数不变，例如20 g撞击重量、25 cm下落高度、4 mm撞击头直径、可靠的异氟烷输送系统，以及与本研究中所用设置相当的MRI参数。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 动物准备

1. 准备实验动物。
   1. 使用8–10周龄、体重20–25 g的雄性C57BL/6N小鼠。
   2. 将小鼠饲养在屏障系统动物房的独立通风笼具（IVCs）中，维持无特定病原体（SPF）环境。自由饮水和进食，控制温度和湿度，保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。
   3. 实验前将小鼠适应饲养环境，并根据机构动物护理规程进行常规健康筛查。
2. 分组。
   1. 将小鼠随机分配至正常对照组（Naive组）、假手术组（Sham组）和闭合性创伤性脑损伤组（c-TBI组）。负责MRI解读、大体病理学评估以及行为学评分和数据分析的研究人员对分组信息设盲。
   2. 在首次损伤操作前记录动物编号及分组信息。

2. 手术与麻醉的准备工作

1. 准备手术器械和麻醉系统。
   1. 准备一把安装11号刀片的无菌手术刀、无菌棉签、无菌生理盐水、10%聚维酮碘溶液、5-0不可吸收聚丙烯单丝缝线、医用胶带以及氯四环素眼膏。
   2. 使用前对手术器械进行灭菌处理，将其放置于清洁的手术区域，并在整个操作过程中保持无菌技术。穿戴适当的个人防护装备，包括手套、实验服和眼部防护装置。
   3. 准备恒温加热垫，并将其温度设定为37 °C ± 0.5 °C。
   4. 将诱导室和鼻罩连接至实验动物气体麻醉系统。
   5. 将氧气流速设置为0.5–1.0 L/min，并准备好异氟烷蒸发器用于诱导和维持麻醉。在通风良好的区域进行麻醉操作，或使用经认证的废气清除系统。
2. 准备小鼠以进行手术。
   1. 根据批准的动物实验方案，在麻醉和手术前30分钟给予盐酸丁丙诺啡（0.1 mg/kg，腹腔注射）。
   2. 将小鼠放入诱导室，使用异氟烷诱导麻醉。将蒸发器浓度设定为3%–5%用于诱导，并持续监测小鼠，直至翻正反射消失且自发肢体运动停止。诱导期间异氟烷浓度不得超过5%。
   3. 将小鼠转移至立体定位仪，保持俯卧位，并通过鼻罩维持麻醉。将蒸发器浓度下调至1%–2%用于维持麻醉，同时保持氧气流速为0.5–1.0 L/min。
      1. 在操作过程中，维持稳定呼吸频率约为60–100次/分钟。若呼吸频率低于60次/分钟，或出现呼吸浅表或不规则，应立即降低异氟烷浓度，提供辅助加温，并延迟撞击操作，直至呼吸恢复稳定。维持麻醉期间异氟烷浓度不得超过2%。
   4. 通过检测足底回缩反射是否消失来确认麻醉深度，使用立体定位仪的耳杆固定头部，注意避免损伤鼓膜（图2A），并保持小鼠处于俯卧位。若在规定的诱导和维持浓度范围内无法达到充分麻醉，或出现明显呼吸抑制，则应将该动物排除在本次损伤实验之外。
   5. 在双眼涂抹氯四环素眼膏，剃除头皮毛发，并使用10%聚维酮碘溶液对手术区域进行消毒。

3. 建立重复性轻度创伤性脑损伤模型

1. 暴露颅骨。
   1. 使用装有11号刀片的无菌手术刀，在头皮上做一条长约0.5 cm至1 cm的纵行正中切口。
   2. 用无菌镊子或棉签钝性分离皮下组织和骨膜，充分暴露颅骨，避免刮伤骨面。
   3. 用生理盐水湿润的无菌棉签擦拭颅骨表面，以清晰显示颅骨解剖标志，包括前囟（bregma）和冠状缝。
2. 准备撞击装置。
   1. 在自由落体式撞击装置上安装直径为4 mm的弧形金属撞击头。
   2. 设定下落高度为25 cm，使用20 g的撞击重锤（图2B）。
3. 实施撞击。
   1. 在颅骨表面确定撞击部位：位于矢状缝左侧2 mm、冠状缝后方2 mm处（图2C）。
   2. 将撞击头垂直对准目标位置，轻轻下放直至接触颅骨表面，并确保撞击头在释放重锤前始终居中且与颅骨表面垂直。
   3. 从25 cm高度释放20 g重锤，完成一次撞击。
   4. 对于Naive组，不实施麻醉或手术；对于Sham组，实施麻醉并做头皮切口，但不进行撞击。
4. 缝合切口并提供术后护理。
   1. 撞击后立即移除撞击头，并检查手术部位。
   2. 使用间断的5-0不可吸收单丝聚丙烯缝线关闭头皮切口，并用10%聚维酮碘溶液对切口部位进行消毒。
   3. 将小鼠置于温度维持在37 °C ± 0.5 °C的恒温加热垫上，监测呼吸直至意识完全恢复并能自由活动，然后将其放回原饲养笼。
      注：恢复的定义为规律的自主呼吸恢复、翻正反射恢复以及自发行走能力恢复。每次撞击后及早期恢复期间应立即监测急性呼吸暂停和可见出血情况。若动物出现持续性呼吸暂停、可见出血、在停止异氟烷麻醉后10分钟内未能恢复翻正反射，或在15分钟内未能自发行走，则应将其排除在后续实验之外，并根据批准的动物实验方案进行处理。
   4. 将使用过的刀片和针头丢弃至经批准的锐器容器中；动物废弃物和污染材料应按照机构生物安全规定进行处理。
5. 重复损伤操作。
   1. 连续5天，每天重复步骤3.1–3.4，共实施5次撞击。
   2. 在整个术后恢复期间持续监测体重和活动情况。若动物出现颅骨骨折、可见出血、癫痫发作、持续转圈行为，或无法自主进食进水，则应从后续分析中剔除。

4. 获取磁共振图像

注意：本研究中，小鼠在最后一次损伤后的第7天进行磁共振成像（MRI）。小鼠在异氟烷麻醉下进行扫描，成像前未处死。根据实验计划，成像完成后进行组织采集。

1. 准备动物进行磁共振成像（MRI）。
   1. 使用异氟烷麻醉小鼠，并将其放置在配备鼻罩的MRI兼容动物床中。
   2. 在整个扫描过程中监测呼吸，并将体温维持在37 °C ± 0.5 °C。
2. 获取T2加权图像
   1. 在9.4 T超导磁体上获取图像，该磁体具有30 cm孔径，梯度系统最大梯度强度为1000 mT/m，最大切换速率为10000 T/m/s。
   2. 使用86 mm体积线圈进行射频发射，15 mm平面表面线圈用于信号接收。
   3. 采用以下参数获取T2加权高分辨率多层快速自旋回波图像：重复时间 = 3000 ms，回波时间 = 46.34 ms，回波链长度 = 13，接收带宽 = 220 Hz/像素，视野 = 20 × 20 mm²，采集矩阵 = 208 × 208，层厚 = 0.5 mm，层间距 = 0 mm，激发次数 = 2。
   4. 采集30层图像以覆盖整个脑部。总采集时间为1分33秒。本研究中，T2加权MRI仅用于定性评估，未进行定量MRI分析。
      注意：MRI图像由对分组信息设盲的研究人员进行定性审阅。

5. 评估大体神经病理学

1. 进行组织采集。
   1. 根据批准的动物实验方案，对小鼠进行深度麻醉。
   2. 打开胸腔，暴露心脏，将灌注针插入左心室，并剪开右心房。
   3. 先用生理盐水灌注，再用4%多聚甲醛（PFA）灌注。整个灌注过程应在经认证的化学通风橱中进行，并避免PFA直接接触皮肤或眼睛。组织和液体废弃物应按照危险废物和生物安全法规进行处理。
   4. 取出颅骨和完整脑组织，并使用高分辨率相机拍摄大体图像。
      注：大体病理学评估由对分组信息设盲的研究人员完成。

6. 监测体重

1. 记录体重。
   1. 在每次首次损伤实验前以及损伤后第1、3、7、14、21和30天分别称量每只小鼠的体重，并记录数值，以评估其随时间变化的整体健康状况。

7. 进行光束漂移测试

1. 准备仪器。
   1. 使用一根长 1 米、宽 1 厘米的水平木梁，并将其悬置于地面以上 30 cm 处。
2. 测试运动协调性。
   1. 将小鼠置于木梁的起始端，使其自行穿越至末端，并记录其通过木梁所需的时间。
   2. 在损伤前以及损伤后第 1、3、7、14、21 和 30 天进行测试。
      注意：行为学检测的安排旨在尽量减少不同测试之间的残留效应。由于悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）比开放场地实验（OFT）更具应激性，因此先进行 TST 和 FST，随后在较晚的时间点进行 OFT 和 Barnes 迷宫实验。该顺序的选择是为了减少先前习惯化或重复探索暴露对后续行为评估可能造成的干扰。

8. 进行悬尾实验

1. 准备仪器。
   1. 在损伤后第7天进行测试，将一个有机玻璃圆筒套在尾巴上，以防止尾巴攀爬。使用长度为4 cm、外径为1.6 cm、内径为1.2 cm、重量为1.6 g的圆筒。
2. 记录行为。
   1. 用胶带将小鼠尾巴固定在悬挂箱上，确保小鼠无法触及箱底，然后将小鼠悬挂3分钟。
   2. 使用高分辨率摄像机记录整个实验过程，并由不知分组情况的观察者通过回放视频手动分析活动时间和静止时间。

9. 进行强迫游泳实验

1. 准备仪器。
   1. 在损伤后第10天进行测试，使用一个高25 cm、直径15 cm的透明圆筒，装入维持在23–25 °C的水，水深应确保小鼠的尾巴和后肢无法触及底部。
2. 记录行为。
   1. 将小鼠放入水中6 min，并用高分辨率摄像机完整记录整个过程。
   2. 由一位盲法观察者手动分析录像的最后4 min，量化活动时间和静止时间。
   3. 将静止定义为仅维持头部露出水面所必需的最小程度运动。

10. 进行旷场实验

1. 准备仪器。
   1. 在损伤后第14天，在安静且光照条件一致的房间内进行实验。选择这一较晚的时间点，是为了与先前的悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）会话相分离，从而减少急性应激相关的效应延续至开放场地实验（OFT）中。
   2. 使用一个尺寸为40 cm × 40 cm × 40 cm的开放场地箱。
2. 记录并分析探索行为。
   1. 将小鼠置于场地中央，使其自由探索6分钟。
   2. 使用行为追踪与分析软件记录6分钟内的行为。在软件中校准场地尺寸，以匹配40 cm × 40 cm的装置，并将场地虚拟划分为5 × 5的网格。
   3. 将外围16个方格定义为边缘区域，中心9个方格定义为中央区域。设置动物颜色比背景颜色更深。仅追踪动物躯体，不追踪头部或尾部。手动采集背景图像。
   4. 使用软件测量整个测试期间的平均速度、在中央区域停留的时间、在边缘区域停留的时间以及总移动距离。
   5. 每次试验前后均需清洁并去除装置中的气味，以消除嗅觉线索。

11. 进行巴恩斯迷宫实验

1. 准备仪器。
   1. 在损伤后第30天开始进行Barnes迷宫评估。
   2. 使用一个直径为1 m的圆形不锈钢平台，周围均匀分布20个孔。
   3. 在指定的目标孔下方放置逃逸箱，在迷宫周围设置视觉线索，并在所有试验中保持目标孔位置不变。
2. 进行训练阶段
   1. 在训练期间开启90 dB的白噪声作为厌恶刺激。
   2. 将小鼠置于平台中心的一个透明圆筒下，持续120 s。
   3. 移除圆筒，允许小鼠自由探索最多180 s。
   4. 当小鼠四肢全部进入逃逸箱时，记录为一次成功试验。
   5. 如果小鼠在180 s内未能找到目标孔，则将其引导进入逃逸箱，并将潜伏期记录为180 s。
   6. 让小鼠在逃逸箱中停留60 s。
   7. 在每次训练日的4–5小时间隔后重复一次训练试验，并连续进行4天训练。
3. 进行休息日与测试阶段
   1. 在训练阶段结束后暂停训练1天。
   2. 在测试日将小鼠放置于平台中心，允许其自由探索最多180 s。
   3. 将迷宫直径设为100 cm以进行比例校准，并确保追踪区域位于视频画面中央；动物颜色应比背景深。仅追踪动物躯体，不追踪头部或尾部；手动采集背景图像。
   4. 使用行为追踪与分析软件记录在180 s测试期间进入逃逸箱的潜伏期、平均速度以及总移动距离。在分析前，根据指定目标孔的位置在软件中定义逃逸区域。

12. 数据分析

1. 准备数据集。
   1. 使用统计与绘图软件整合行为学、成像及体重数据。
   2. 以均值 ± 均值标准误（SEM）表示数据。
2. 进行统计分析。
   1. 本研究中，采用线性混合效应模型分析纵向体重和穿梁行走数据，将组别、时间及其交互作用设为固定效应，动物个体设为随机效应；在适用情况下，随后进行事后多重比较检验。
   2. 对于呈正态分布且方差齐性的数据，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析悬尾实验（TST）、强迫游泳实验（FST）、开放场实验（OFT）和巴恩斯迷宫结果；当整体方差分析具有显著性时，进一步采用Tukey事后检验。对于非参数数据，采用Kruskal-Wallis检验，并在必要时进行Dunn事后检验。
   3. 在可能的情况下报告精确的p值，并同时提供检验统计量、自由度及效应量指标（单因素方差分析使用R²）。所有报告的p值均应基于上述指定的统计检验方法得出，并在统计与绘图软件中完成全部分析。
   4. 统计显著性阈值设定为p. < 0.05。

结果

轻度创伤性脑损伤小鼠的影像学与神经病理学评估

为了评估动物的整体健康状况和基础运动功能，根据图1所示的时间线监测了体重和平衡木行走表现。采用以动物为随机效应的线性混合效应模型分析各组的纵向差异。建模前，各组之间的体重无统计学差异（图4A）。建模后，闭合性创伤性脑损伤（c-TBI）小鼠的整体体重略低于Naive组和假手术（Sham）组，在脑外伤后第3天达到最低值；然而，这些组间差异无统计学意义。从脑外伤后第3天开始，c-TBI小鼠的体重逐渐恢复并随时间增加。在平衡木行走实验中，c-TBI组、假手术组和Naive组在各个评估时间点通过平衡木所需的时间均无显著差异（图4B）。这表明重复的自由落体重物打击并未在小鼠中引起持久或严重的运动功能缺陷。这些测量指标对于解释该技术所产生的行为学结果至关重要，因为未出现明显的体重下降或平衡木行走能力受损，支持了后续观察到的主动行为减少并非继...

讨论

本研究详细描述了一种采用重复自由落体击打法建立重复性轻度创伤性脑损伤（rmTBI）小鼠模型的标准化实验方案。通过将暴露颅骨的小鼠固定于立体定位仪中，并使用20 g重物从25 cm高度连续5天重复撞击预设坐标位置，成功诱导出以慢性抑郁样行为为特征的行为表型，且未出现颅骨骨折或明显的局灶性脑挫伤。该模型的主要特征是在重复性轻度闭合性头部撞击后的恢复期中，抑郁样行为可稳定重现。因此，本研究建立了一种可用于研究慢性创伤后抑郁样行为及其相关神经精神后遗症机制的rmTBI小鼠模型。本研究中，各项指标的评估持续至末次撞击后30天，该时间点被用作慢性损伤后观察时相，而非急性反应阶段。在后续研究中纳入更晚的时间点，将进一步完善该模型的时间动态特征刻画。

在执行本方案的过程中，有几个关键步骤需要特别仔细。首先，精确确定撞击坐标的定位至关重要。位置偏差可能改变撞击力的分布，增加邻近皮层区域意外损伤或更严重创伤的风险。其次，必须严格控制麻醉深度和镇痛效果。麻醉不足可能导致动物在操作过程中发生身体挣扎，引起协调性移位以及可能的头部和颈部二次运动；相反，麻醉过深，加上撞击后短暂的呼吸抑制，可能增加死亡风险。在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-0非吸收性聚丙烯单丝缝合线	Jinhuan Medical	I303	伤口闭合
麻醉机	RWD Life Science	R550	动物模型构建
ANY-maze行为追踪软件	Stoelting	版本 7	行为学软件
Barnes迷宫	上海欣软信息科技	XR-XB108	行为学软件
Biorender	BioRender	https://biorender.com	科研绘图软件
布托啡诺	Sigma-Aldrich	Y0001108	术后镇痛
电动剃须刀	AUX	AUX-C5-1	术前备皮
强迫游泳实验	上海欣软信息科技	XR-XQX201	行为学软件
GraphPad Prism 9.5	La Jolla	9.5	统计学软件
异氟烷	RWD Life Science	R510-22-10	动物模型构建
小鼠	Charles River	C57/6N	实验动物
旷场实验	上海欣软信息科技	XR-XZ301	行为学软件
眼科软膏	北京双鹭药业	H11021342	预防麻醉期间角膜干燥
4%多聚甲醛（PFA）	Biosharp	BL539A	灌注与组织固定
磷酸盐缓冲液（PBS）	Biosharp	BL1425A	灌注与组织清洗
10%聚维酮碘溶液	碧云天	27883-25g	术前皮肤消毒
小动物磁共振成像系统	联影生命科学仪器	uMR9.4T	成像软件
11号手术刀片	Jinhuan Medical	K3-11	手术中皮肤切口
手术刀柄	Jinhuan Medical	K6-10	与11号手术刀片配合使用
立体定位仪	RWD Life Science	68025	动物模型构建
无菌纱布	HYNAUT	BK05	止血与手术清洁
悬尾实验	上海欣软信息科技	XR-XQX201	行为学软件
落锤式撞击器	RWD Life Science	68093	动物模型构建