使用解吸电喷雾电离耦合轨道阱质谱仪进行单细胞质谱成像

摘要

本方案描述了利用解吸电喷雾电离耦合轨道阱质谱仪进行OVCAR-8细胞单细胞质谱成像，以实现高空间分辨率的代谢组学分析。

摘要

解吸电喷雾电离-质谱成像（DESI-MSI）可在常压条件下实现无需基质、样品前处理极少的分子成像。本方案描述了利用与Orbitrap质谱仪联用的DESI技术对OVCAR-8细胞进行单细胞MSI的实验流程。该系统集成了DESI喷雾器、改进的质谱仪接口、电动XYZ载物台以及光学面包板，以实现高空间分辨率成像。细胞培养于带网格的玻璃盖玻片上，用甲酸铵溶液洗涤以减少盐类干扰，随后干燥并在常压条件下进行分析。通过纳米液相色谱系统持续输送溶剂，并调节雾化氮气以维持喷雾稳定性。本方案还介绍了光栅扫描成像、像素控制以及光学图像与质谱图像的配准，以实现单细胞定位。Orbitrap检测器提供的高质量分辨率和高质量精度，能够区分结构相近的分子种类，并支持单细胞代谢组学分析。该方案为在多种Orbitrap质谱平台基础上开展高空间分辨率单细胞MSI提供了可灵活调整的策略。

引言

代谢组学旨在全面表征反映生物系统功能状态的小分子代谢物^1,2,3,4,5。由于代谢物是酶促活性的直接产物，因此能够动态反映细胞表型和生物化学调控状态。然而，传统的代谢组学工作流程通常依赖于对数千至数百万个细胞进行信号平均的批量提取方法，从而掩盖了细胞间的异质性^6,7,8。

单细胞代谢组学通过在单个细胞水平上实现分子谱型分析，揭示了复杂细胞群体内的代谢异质性，从而加深了对疾病进展、药物反应和细胞分化机制的理解。质谱（MS）是生物样本分子分析不可或缺的工具。近年来，质谱技术在样品制备、仪器设备和数据分析等方面的进步，使得代谢组学研究能够开展单细胞水平的分析^9,10,11,12。

质谱成像（MSI）能够对生物样本进行空间分辨的分子分析，通过在样品表面每个定义的空间坐标处采集完整的质谱数据，结合精确的样品移动、最小化的采样、高效的离子化以及数据可视化，实现对分子分布的高精度表征^12,13,14。通过在x–y坐标上绘制选定质荷比（m/z）值的强度分布，可重建出质谱图像，从而保留复杂生物系统内的化学空间信息^{12,13,15,16,17,18}。实现空间分辨的单细胞代谢组学分析需要具备足够灵敏度和质量分辨率的分析平台，能够在保持分子空间定位的同时检测低丰度分子物种^9,12,19,20。

单细胞质谱成像（MSI）面临额外的挑战，因为单个细胞的直径通常在 5 到 20 µm 之间^8,21。在此空间尺度下，每次采样事件中的分析物含量极为有限。因此，多个因素——包括对样品移动的精确控制、最小化采样、高电离效率以及高效的离子传输——对于从单个细胞中获得可解释的分子信息同样至关重要^14,22。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）-MSI 是一种基于真空环境的技术，常用于高空间分辨率的 MSI 研究，但其需要基质沉积并在真空条件下运行；然而，MALDI 中的基质结晶可能在单细胞尺度上引起分析物的去定位和变异性^{23,24,25,26,27}。相比之下，常压 MSI 技术在常压条件下运行，样品可保持接近天然的化学状态，因为几乎不需要或完全不需要样品前处理。在常压 MSI 方法中，DESI²⁸、nano-DESI²¹、气动辅助 nano-DESI²⁹ 和 Single-probe^{8,30,31,32,33,34,35} 已被用于单细胞 MSI 研究。尽管基于微液提取的技术（包括 nano-DESI、气动辅助 nano-DESI 和 Single-probe）具有高采样效率和高电离效率，但它们依赖于在采样探针尖端维持一个稳定的液体桥；而液体桥的扰动（例如表面形貌变化或探针堵塞）可能影响 MSI 实验的质量^5,8,21,30,35。

解吸电喷雾电离（DESI）是一种常压电离技术，其中带电的溶剂液滴撞击样品表面，萃取分析物，并生成含有离子化物质的次级液滴³⁶。DESI 具有非接触、无堵塞采样的优势，且适用于基于光栅扫描的成像工作流程，因此当其与高分辨能力的 Orbitrap 平台联用时，特别适合对光学识别的单个细胞进行高分辨率、多离子分子分布图谱分析^{20,37,38,39,40}。DESI 已广泛应用于组织成像，但因其技术挑战，极少用于单细胞质谱成像（MSI）^20,28。最近的研究采用商业配置，即将 Waters DESI XS 与 SELECT SERIES Cyclic IMS 质谱仪联用，证明该系统可实现多种细胞系的单细胞分辨率。在 DESI–MSI 中实现高空间分辨率需要对电离效率、离子传输效率、采集速率以及喷雾器对准进行协同控制^12,20,28。特别是新一代 DESI 喷雾器设计的进步，包括 DESI XS 和解吸电流动聚焦电离（DEFFI），已显著缩小了采样区域^41,42。此外，降低溶剂流速，例如采用纳米液相色谱（nano-LC）泵提供的纳升级每分钟流速，可显著提高空间限制性，从而实现单细胞水平的分子分辨²⁸。尽管该方法已实现单细胞分辨率的质谱成像，但其依赖于特定厂商（Waters）的仪器设备。因此，为了更广泛地推广应用单细胞 DESI–MSI，需要发展可与广泛使用的高分辨率质谱仪（如 Orbitrap 系统）兼容的策略，以提供高灵敏度、高质量精度和高分辨能力。将 DESI 与 Orbitrap 质谱仪联用，为单细胞 MSI 研究提供了新的机遇，包括在复杂细胞提取物中区分空间邻近及同量异位物种^20,43,44。

本方案描述了一种模块化策略，用于将Waters DESI XS喷雾器与Orbitrap质谱仪集成，以开展单细胞质谱成像（MSI）研究。该工作流程整合了带网格的盖玻片用于细胞附着和光学关联、电机驱动的XYZ载物台实现可控光栅扫描、纳米级溶剂输送系统以形成稳定的喷雾，以及高分辨率Orbitrap检测。尽管本研究选用了赛默飞Orbitrap Tribrid Lumos质谱仪作为平台，但其他许多具备兼容源接口几何结构的Orbitrap质谱仪型号，经过适当的机械适配和优化后，也可能与类似的定制化DESI XS配置相耦合。

方案

OVCAR-8 细胞购自美国模式培养物集存库（ATCC）。所有细胞培养操作均依照机构生物安全指南进行。按照生产商说明书，使用支原体检测试剂盒对细胞进行常规支原体污染检测。

注意：所有操作均需遵循机构的生物安全指南。穿戴适当的个人防护装备。在化学通风橱中操作有机溶剂。

1. 在带网格的盖玻片上培养并制备 OVCAR-8 细胞

1. 通过在 RPMI-1640 培养基中添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素，制备完全培养基。将培养基预热至 37°C。
2. 将 OVCAR-8 细胞培养于含有 10 mL 完全培养基的 10 cm 细胞培养皿中。在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育细胞。
3. 当贴壁细胞在显微镜下观察覆盖约 80% 培养皿表面时进行传代，通常在所述培养条件下每 2 天传代一次。
   1. 吸除 10 cm 培养皿中的培养基，并用 5 mL 1× 磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。
   2. 向培养皿中加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸，于 37°C 孵育约 3 分钟，或直至在显微镜下观察到大部分细胞从培养皿表面脱落。
   3. 向培养皿中加入 8 mL 预热的完全培养基以中和胰蛋白酶。使用 10 mL 血清移液管，轻柔吹打细胞悬液上下约 15–20 次，使细胞充分分散。
   4. 取 1 mL 细胞悬液加入 9 mL 新鲜完全培养基中。
   5. 使用自动细胞计数仪进行细胞计数。取 10 µL 重悬的细胞悬液直接加入计数载片，无需额外稀释，按照仪器制造商说明书进行细胞计数。
      ​注意：本实验方案未使用台盼蓝等细胞活力染料。在胰酶消化前，通过显微镜观察细胞形态和贴壁情况来评估细胞状态。
4. 将细胞接种至盖玻片上。
   1. 用完全培养基将细胞稀释至终浓度约为 ~1 × 10⁶ 个细胞/mL。根据公式 C₁V₁ = C₂V₂ 计算所需细胞悬液体积，其中 C₁ 为实际计数的细胞浓度，V₁ 为所需细胞悬液体积，C₂ 为目标浓度，V₂ 为所需终体积。
   2. 将单个 28 mm 带网格玻璃盖玻片（网格间距 50 µm）放入 6 孔板的各孔中。
      注意：玻璃盖玻片使用前需高压灭菌。放置时使网格面朝下，以减少对细胞生长的干扰。
   3. 每孔加入 2 mL 完全培养基和 200 µL 细胞悬液（约 2 × 10⁵ 个细胞/孔）。轻轻以“X”形摇动 6 孔板，使细胞在盖玻片表面均匀分布。
   4. 孵育细胞约 15–20 小时，以允许细胞贴壁。
      注意：应定期使用显微镜观察细胞形态，确保细胞正常生长。若细胞生长不良，应使用支原体检测试剂盒检测是否存在支原体污染。

2. 使用甲酸铵（AF）溶液洗涤细胞

注意：每次使用前需新鲜配制 AF 溶液。

1. 使用前立即配制等渗AF洗涤缓冲液。称取0.45 g AF，溶于50 mL液相色谱-质谱（LC/MS）级水中，配制成终浓度为0.14 M（0.9% w/w）的AF溶液。无需调节pH^5,45。
   注意：AF溶液需当天新鲜配制并使用。使用前将溶液保持在冰上（0°C–4°C）。
2. 从6孔板的每个孔中吸除培养基，立即向每个孔中加入2 mL预冷的AF溶液。
3. 用无菌镊子轻轻夹起每个孔中带有贴壁细胞的盖玻片，保持细胞附着面朝上。将盖玻片短暂浸入另一个预先加入2 mL预冷0.9% AF溶液的孔中，持续2–3秒。
4. 每次冲洗均使用新鲜AF溶液，共重复冲洗两次。最后一次冲洗后，将盖玻片从AF溶液中取出，置于化学通风橱中室温下晾干约20–30分钟，随后进行DESI–MSI分析。
   注意：冲洗过程应轻柔操作，避免在洗涤步骤中扰动细胞。

3. 改进型基于FAIMS的质谱接口的制备

1. 拆卸 FAIMS Pro 电极离子源外壳适配器，以接触内部电极区域。确认该适配器与配备 FAIMS Pro 接口配置的 Thermo Orbitrap 质谱仪兼容。
2. 移除 FAIMS 电极组件，包括内部导线、电极组件、O 型圈以及支撑性内部结构。保留外部外壳壳体、安装法兰以及质谱仪识别适配器所需的接口检测销。
3. 使用标准机加工程序修改圆形开口。将开口扩大，直至其在突出的 Orbitrap 进样口/离子漏斗组件周围提供足够的间隙。
4. 切割后对加工边缘进行打磨和去毛刺处理。确认修改后的开口允许外壳适配器在质谱仪上无阻碍地定位。
5. 使用锯子修改外壳适配器两条支腿的长度。将支腿裁剪至最终长度约 2 ¼ 英寸，以便与光学面包板连接。
   注意：使用适当的加工工具，避免损坏剩余外壳的结构完整性。
6. 准备一块铝制光学面包板（10 英寸 × 12 英寸 × 0.5 英寸，带有 1/4"-20 螺纹孔）。将面包板水平放置在改装后的 FAIMS 适配器下方。
7. 使用两个安装支架将改装后的 FAIMS 适配器连接到光学面包板上。根据需要裁剪支架，以减轻重量并确保面包板相对于 Orbitrap 进样口的正确位置。
8. 使用与面包板 1/4"-20 螺纹孔模式相匹配的机械兼容安装硬件，将改装后的 FAIMS 接口牢固固定在光学面包板上。确保在成像实验期间保持稳定定位。
   注意：确保接口刚性固定，以在载物台移动和数据采集过程中最小化振动。
9. 在光学面包板上 FAIMS 外壳接触区域正下方加工或切割出一条浅槽。设计槽的尺寸和位置，以在改装后的 FAIMS 外壳与 Orbitrap 进样口之间提供足够的间隙，确保稳定就位和对准。
   注意：槽的尺寸应能容纳 FAIMS 外壳适配器的底部，以提高位置重复性。
10. 将已安装的接口与质谱仪进样口对齐。确认保留的安装法兰在仪器上正确就位，并且接口下方的光学面包板保持水平。
11. 在安装 DESI 喷雾器之前，验证改装后的圆形开口在 Orbitrap 进样口/离子漏斗组件周围提供无阻碍的间隙。

4. 组装解吸电喷雾电离喷雾器与Orbitrap接口

1. 将解吸电喷雾电离（DESI）喷雾器安装到集成装置上，该装置由定制的FAIMS框架、电动XYZ平台、气体调节器和光学面包板组成。使用由CONEX-MFACC控制器控制的电动平台。
2. 将x轴定义为从左到右的光栅扫描方向，将y轴定义为从上到下的行进扫描方向。在数据采集前设定z轴位置，并在成像过程中保持其固定。
3. 在x方向和y方向上使用约1 mm的载物台移动范围。采集过程中不要应用z轴移动。
4. 将DESI喷雾器置于相对于样品表面约70°的角度。将样品直接放置在喷雾器下方，并将喷雾器尖端尽可能靠近Orbitrap进样口，但不得发生物理接触。
5. 将DESI接地金属连接至质谱仪下方的接地源。使用载物台控制软件控制光栅移动（图1).
   注意：本研究中使用的 DESI 喷雾器仅适用于配备 DESI-MSI 仪器的用户。
6. 使用电动XYZ载物台控制器进行载物台的移动和定位。操作前连接电压线、氮气管路、溶剂管路和接地线。
7. 安装定制的不锈钢离子传输管（外径 1/16 英寸 × 内径 0.033 英寸），该传输管设计用于匹配 Orbitrap 离子源入口。将离子传输管定位，使其与 Orbitrap 入口直接对齐，同时向外延伸足够距离，以确保解吸电喷雾电离（DESI）喷雾流能够无阻碍地进入。
   注意：根据质谱仪的配置定制离子传输管。使用适当的机械加工方法制备离子传输管。
8. 使用具有弯曲几何结构的离子传输管，以优化解吸电喷雾电离（DESI）喷雾器相对于样品表面和Orbitrap进样口的位置。
9. 将喷雾器相对于样品表面以约70°的角度对准，使DESI喷雾羽流与Orbitrap进样区域相交，但不接触样品表面。
10. 通过采集过程中稳定的质谱图和一致的归一化水平（NL）值来确定稳定的喷雾羽流。调整喷雾器位置，直至观察到稳定的离子信号。
11. 将喷雾器与样品表面的距离初始设置为约1.0–1.5 mm。在监测中性丢失（NL）值的同时，手动微调喷雾器位置，以获得最稳定的离子信号。

图1集成解吸电喷雾电离（DESI）-质谱成像（MSI）系统，与Orbitrap质谱仪联用。 DESI 喷雾器安装在一个集成平台上，该平台由改进的高场不对称波形离子迁移谱仪（FAIMS）构成 适配器、电动XYZ载物台、气体调节器和光学面包板。溶剂通过纳米液相色谱系统输送，氮气以约12 psi的压力供给以稳定喷雾。该图还显示了电离电压连接、溶剂管路以及喷雾器相对于Orbitrap进样口的位置。 请点击此处以查看此图的放大版本。

5. 配置溶剂输送和喷雾条件

1. 在进行DESI-MSI分析之前，配制新鲜的喷雾溶剂，由甲醇/水/甲酸（98:2:0.1, v/v/v）组成。
   注意：其他与DESI兼容的溶剂体系，包括基于乙腈的溶剂和不同比例的甲醇/水混合物，经优化后也可使用。本方案中采用甲醇/水/甲酸（98:2:0.1, v/v/v）作为标准起始条件，因其在单细胞DESI-MSI实验中可提供稳定的喷雾等离子体形成、减少溶剂扩散，并产生可重复的正离子模式脂质信号。
   警告：甲醇易燃且有毒。甲酸具有腐蚀性。请在通风橱中操作这些溶剂。
2. 使用Ultimate 3000 nano-LC系统作为等度溶剂泵，以750 nL/min的流速输送溶剂（针对本研究中报告的实验）。使用PEEK管（外径1/16英寸，内径0.005英寸）将nano-LC出口连接至DESI喷雾器。
3. 在线安装C18色谱柱（例如，nanoEase M/Z Peptide BEH；130 Å，1.7 µm，300 µm × 150 mm），以在低流速下提供足够的背压，确保喷雾稳定形成。
4. 将质谱仪方法设置为正离子模式，Orbitrap检测，喷雾电压0.85 kV，Orbitrap分辨率在m/z 200时为120,000，扫描范围m/z 150–1200。
5. 将归一化自动增益控制（AGC）目标设为100%，最大注入时间设为100 ms，RF透镜设为45%，微扫描次数设为1。关闭四极杆隔离和源内碎裂功能。
6. 通过氮气发生器或液氮源提供鞘气氮气，压力约为12 psi，以稳定DESI喷雾等离子体。以12 psi作为起始工作压力，仅在必要时进行微小的手动调节，以提高归一化强度（NL）值并维持稳定的质谱信号。

6. 执行光栅成像与像素控制

1. 利用带网格的盖玻片作为参考，确定包含光学可见单个细胞的兴趣区域。选择与邻近细胞有清晰视觉分离、贴壁形态完整、且无明显与碎片或细胞团重叠的孤立细胞。
2. 使用 Fance Stage Controller 软件⁴⁶定义光栅扫描区域。将光栅步长设为 0.01 mm，载物台速度设为 0.01 mm/s，停留时间设为 20 s。
3. 对每条线进行从左到右的光栅扫描，随后在 y 方向移动至下一条线。将光栅线之间的正交步长设为 10 µm。
4. 根据 Orbitrap 采集速率调整载物台速度，以实现所需的扫描方向像素尺寸（例如，约 2.5–6.5 µm）。使用以下关系式计算扫描方向像素尺寸：扫描方向像素尺寸 = 载物台速度 × 每次扫描的采集时间。
5. 以 0.01 mm/s（10 µm/s）的载物台速度，在 102 s 内采集 376 次扫描，从而获得每次扫描 0.271 s 的采集时间，对应的扫描方向像素尺寸约为 2.7 µm。通过将 Orbitrap 采集时间设置为略短于载物台移动和停留时间参数之和，实现载物台运动与质谱采集的同步。
   注意：正交方向像素尺寸由程序设定的步长以及载物台的物理和机械限制决定，而扫描方向像素尺寸则由载物台速度和光谱采集速率决定。
6. 在选定的质量范围内采集成像数据，直至完成预定义的光栅扫描区域。对于使用 0.01 mm 线步长和 0.01 mm/s 载物台速度采集的 1 mm × 1 mm 成像区域，总采集时间约为 4–5 小时。
7. 在采集过程中生成 RAW 数据文件，并在完成指定的 x–y 光栅坐标及相应仪器方法持续时间后停止采集。在本文所述的正离子模式条件下，每条光栅线通常生成约 50 MB 的 RAW 文件，101 条光栅线共产生约 5 GB 的总数据量。

7. 光学图像与质谱图像的配准

1. 使用配备10×物镜的明场显微镜，在AF洗涤和干燥后、DESI采集前，对选定网格区域中的细胞拍摄明场图像。
2. 使用ProteoWizard中的msConvert将RAW文件转换为mzML文件⁴⁸。再使用imzML Converter将mzML文件转换为imzML格式⁴⁹。
3. 采用与所获取数据格式一致的质心/轮廓转换设置。将imzML文件直接上传至METASPACE（https://metaspace2020.eu）⁵⁰以进行图像可视化。
4. 在可视化前，不进行归一化、热点去除或额外的图像处理校正。利用网格标记作为位置参考，手动对齐光学图像与质谱图像。
5. 根据已知的图像尺寸和网格间距对光学图像进行缩放。手动叠加质谱图像，以评估光学可见的细胞位置与定位离子信号之间的一致性。
6. 通过明场图像中孤立细胞与相应质谱离子分布的视觉一致性，确认单细胞定位。

结果

成功执行本方案可获得解吸电喷雾电离质谱成像（DESI–MSI）数据集，其中光学识别的单个细胞在空间上与局部分子离子信号相对应（图2）。在进行DESI–MSI分析前获取的明场显微镜图像可用于直观识别单个OVCAR-8细胞，并利用带网格的盖玻片作为位置参考，实现光学图像与质谱图像的配准。代表性DESI–MSI离子图像显示了局部分布的离子信号，其空间分布与相应明场图像中识别的单个细胞位置相吻合（图2A–2D）。

图 2．OVCAR-8 细胞明场显微镜与质谱成像的比较。 （A）以 10× 放大倍数采集的 OVCAR-8 细胞明场显微镜图像。（B–D）使用 DESI-MSI 以 5.5 µm × 10 µm 像素尺寸采集的质谱图像。分别展示了（B）m/z 317.111、（C）m/z 808.562 和（D）m/z 788.616 的代表性离子分布。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

单个细胞可产生包含多种脂质相关离子和小分子的完整质谱。每个细胞并非依赖单一分子标记，而是呈现出一种多离子分子谱型，发挥化学指纹的作用。在 m/z 317.111、m/z 808.562 和 m/z 788.616 处的代表性离子图像显示，相邻细胞间分子分布具有异质性，表明在单细胞水平上可测量到代谢异质性（图 2B–2D）。基于 METASPACE 的注释表明，在 m/z 808.562 和 m/z 788.616 处检测到的离子主要与磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺类脂质相关，而 m/z 317.111 则对应多个候选小分子及与二肽相关的物种。这些结果表明，该平台能够在常温条件下，对光学识别的单个细胞实现空间定位的分子特征检测。其他结果，包括初步注释的物种、通过 MS/MS 鉴定的物种、代表性质谱图像及质谱数据，已在先前的研究中提供²⁰。

集成的解吸电喷雾电离-质谱成像（DESI–MSI）平台由DESI喷雾器、改进的FAIMS适配器、电动XYZ载物台以及安装在Orbitrap进样口旁的光学面包板组成（图1）。该装置可实现稳定的溶剂输送、可控的载物台移动，并将DESI喷雾羽流与质谱仪进样口对齐，适用于常压下单细胞成像实验。如图3所示的定制离子传输管可实现DESI源区域与Orbitrap进样口之间的离子传输。弯曲毛细管结构有助于在保持离子传输畅通的同时，调节DESI喷雾器相对于样品表面和进样区域的位置。

图3．用于Orbitrap质谱成像的定制离子传输管。 该照片展示了自行制备的离子传输管，用于将解吸电喷雾电离（DESI）喷雾器与Orbitrap Fusion Lumos质谱仪耦合。图中显示了在常压单细胞质谱成像实验中用于离子传输的弯曲传输毛细管结构及其安装组件。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4展示了与光学平台和电动XYZ位移台集成的改进型FAIMS适配器。顶视图（图4A）显示了样品台和改进型适配器相对于Orbitrap进样口的位置，而底视图（图4B）展示了用于支撑成像平台的安装支架和位移台组件。集成组件的机械稳定性对于在成像采集过程中保持一致的光栅移动并最小化位置漂移至关重要。

图 4。改进的高场非对称波形离子迁移谱（FAIMS）适配器与光学面包板及电动 XYZ 平台集成。（A）改进型适配器安装在 Orbitrap 进样口和样品台附近的顶部视图。（B）底视图，显示用于支撑和校准成像平台的改进支架、光学面包板和电动 XYZ 平台组件。请点击此处查看此图的放大版本。

Orbitrap检测提供的高质荷比分辨率能够区分空间上邻近且质荷比相同的脂质种类，从而相比低质荷比分辨率系统提高了分子特异性和成像对比度。通过同步移动台速度与质谱采集速率，可实现较小的像素尺寸。例如，利用快速采集的Orbitrap平台和优化的光栅参数，已实现低至2.7 µm × 10 µm的像素尺寸⁴²。高空间分辨率成像可在最小化相邻细胞区域间信号重叠的同时，实现对紧密相邻细胞的分子层面清晰界定。

成功的解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）实验表现为稳定的喷雾条件、各光栅扫描线间一致的离子强度，以及分子信号在空间上的精确定位，这些信号与光学图像中的单个细胞相对应。实验条件不理想时，可能产生弥散的离子分布、信号强度低、光栅模式不一致，或在采集过程中因喷雾不稳定、喷雾器未对准、溶剂过度扩散或样品移动而导致细胞定位信息丢失。通过仔细优化喷雾对准、溶剂流速、载物台移动速度和样品位置，可提高单细胞成像实验中的空间保真度和离子信号稳定性。

讨论

本方案通过整合精确的载物台控制、纳米级溶剂递送、光学靶向以及高空间分辨率质谱分析，实现了在常温条件下利用高质荷比分辨率Orbitrap质谱仪进行单细胞水平的解吸电喷雾电离质谱成像（DESI–MSI）。上述各要素的结合克服了长期以来限制DESI–MSI在单细胞层面应用的多项技术障碍。特别是，对喷雾稳定性、离子传输效率和采集时序的协同控制，使得从对应单个细胞的极小采样体积中可靠地检测分子信号成为可能。该工作流程中决定性能的关键因素之一是DESI喷雾羽流的稳定性和局限性。在微米级空间分辨率下，溶剂流速、气体压力或喷雾器位置的微小扰动都可能显著改变有效采样区域。采用纳米级溶剂递送并结合适当的背压，可提高喷雾稳定性并减少溶剂扩散，从而增强空间保真度。此外，保持喷雾器与样品表面之间距离和角度的一致性，对于实现可重复的电离效率至关重要。即使几何构型上的微小偏差，也可能导致信号强度的显著变化，尤其是在分析异质性细胞样品时。在实际操作中，通过在数据采集过程中监测总离子流强度、谱图稳定性以及归一化信号水平（NL值，通常在10⁵–10⁶范围内），经验性地优化DESI喷雾条件。通过迭代调整喷雾器位置、溶剂流稳定性、气体压力以及DESI羽流相对于Orbitrap进样口的对准，最终实现了可重复的高质量信号输出。

离子传输效率在单细胞尺度下是另一个关键限制因素，因为单个细胞内的分析物丰度本质上较低。在这一空间尺度下，在某些实施方式中，高效的离子传输可能比电离效率成为更显著的实际限制，因为最终仅有极小部分脱附的离子能够到达质谱仪入口。因此，将离子从采样区域高效地传输至质谱仪入口至关重要。本方案中使用的改进型FAIMS腔体适配器可在DESI喷雾源与Thermo质谱仪之间提供接口，兼容多种仪器型号，包括Orbitrap Tribrid、Exploris和Astral系列平台。将改进型FAIMS腔体适配器集成至光学面包板还可提供机械稳定性，从而在长时间成像实验中最大限度减少错位。载物台运动与质谱采集之间的同步对于实现高空间分辨率同样至关重要。在DESI-MSI中，扫描方向上的像素尺寸由载物台移动速度与采集速率之间的关系决定，而正交方向上的尺寸则由程序设定的步长定义。对这些参数的精确控制可实现精准采样。由于大多数哺乳动物细胞的直径通常约为5–20 µm，因此需要接近几微米的像素尺寸，以最小化相邻细胞间的信号重叠，并提高分子特征在单个细胞区域内的定位精度。然而，标称像素尺寸并不一定对应真实的采样范围，因为溶剂羽流与样品表面的相互作用可能导致横向扩散以及相邻像素之间的部分信号重叠。因此，报告的像素尺寸应结合有效空间分辨率来理解，而非仅依据严格的几何定义。本研究中使用的定制离子传输管根据标准离子传输管的几何结构设计，旨在保持离子传输特性的同时，实现与DESI源配置的集成。

Orbitrap 质谱仪提供的高质量分辨能力和高质量精度对于解析单个细胞内存在的复杂代谢物和脂质混合物至关重要。许多检测到的分子特征通过精确质量测定和 METASPACE 分析进行了初步注释。由于多个候选分子可能对应同一个测得的 m/z 值，未来的研究中可能需要进一步采用 MS/MS 验证和其他正交的分子确认策略，以增强分子鉴定的可靠性。在正离子模式下，DESI 谱图通常由具有相近或同重（isobaric）m/z 值的磷脂物种主导。高分辨的 Orbitrap 检测能够区分这些物种，从而提高分子特异性并降低谱图的不确定性。这一能力对于单细胞分析尤为重要，因为在单细胞分析中，若仅依赖有限数量的离子，可能导致对细胞异质性的误判。这种可适应性表明，类似策略经过适当修改后，可能适用于其他配备相应接口的质谱平台。尽管具有上述优势，仍需考虑若干局限性。首先，本研究中使用的 DESI 源仅适用于已配备 DESI–MSI 系统的用户，因此 DESI 喷雾器/Orbitrap 系统的构建可能受限于 DESI 源的可获得性。然而，其他替代性 DESI 装置（如 DEFFI）也可用于高空间分辨率的质谱成像研究^42，47。其次，该平台的实施需要大量定制化工作，包括仪器接口的机械加工和安装组件的制造。这些要求可能限制缺乏仪器开发或机械加工经验的实验室的使用。在当前的实现方案中，FAIMS 接口外壳为 DESI 喷雾器组件相对于 Orbitrap 进样口的定位提供了便捷的机械安装平台。因此，所述配置的实施对于具备 FAIMS 兼容型 Orbitrap 系统和基本机械加工支持的实验室更为实用。然而，将 DESI 源与 Orbitrap 进样口进行机械耦合的总体概念，也可通过不修改 FAIMS 接口硬件的替代设计来实现。第三，尽管低溶剂流速可改善空间局限性，但也可能降低总的离子产率，因此需要仔细优化以平衡灵敏度与空间分辨率。

另一个重要的考虑因素是采样过程中分析物可能发生去定位。尽管解吸电喷雾电离（DESI）在常温条件下运行且无需基质涂覆，溶剂液滴与样品表面的相互作用仍可能导致分析物重新分布，特别是对于高溶解性的物质。因此，减少溶剂用量并优化喷雾条件对于在单细胞水平上保持空间完整性至关重要。类似地，使用等渗甲酸铵进行洗涤的步骤可降低盐类相关的离子抑制效应，同时维持细胞完整性并保留细胞内物质，这在此前报道的单细胞质谱工作流程中已有体现⁵。

未来的发展可能会进一步提升该平台的性能和适用性。例如，与更快的数据采集系统相结合，可实现更小的有效像素尺寸并提高质谱成像实验的通量。自动化对准系统的实施或实时反馈控制可减少变异性并提高可重复性。此外，将该方法与互补技术（如荧光成像或靶向标记策略）相结合，可增强细胞类型的鉴定能力，并实现多模态分析。

除了技术层面的考量，该平台对生物与生物医学研究具有广泛意义。在常温条件下实现对单个细胞分子谱的表征，为研究复杂系统中的细胞异质性提供了新的机遇。DESI–MSI 已成功应用于组织层面的研究，包括肿瘤微环境、神经系统疾病、宿主–病原体相互作用以及耐药细胞群体^12,15,16,35。将 DESI–MSI 延伸至单细胞水平，可能进一步提升对邻近细胞间局部化学异质性的解析能力，有助于识别稀有细胞亚群，并发现那些在整体组织检测中可能被掩盖的分子标志物。然而，本研究采用的是简化的单层细胞培养模型，尚需开展更多研究以验证该方法与其他复杂生物系统的兼容性，包括不同的细胞模型、组织、类器官以及三维培养体系。当前的工作流程在经过进一步验证与优化后，可为将高空间分辨率的 DESI 测量拓展至日益复杂的生物环境提供基础。由于该方法在提供详细分子信息的同时保留了空间背景信息，因此可在成像技术与基于组学的方法之间起到桥梁作用。总之，本实验方案建立了一个灵活且可适应的框架，可在 Orbitrap 质谱仪上实现单细胞分辨率的 DESI–MSI。通过解决电离效率、离子传输、空间控制和质量分辨率等方面的关键挑战，该方法实现了对单个细胞的精细分子表征。尽管仍需进一步优化与验证，该技术为拓展常温质谱成像在单细胞及空间代谢组学研究中的应用奠定了基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
−80 °C 冷冻柜	Eppendorf New Brunswick	U700	样品制备前生物样本的储存
6" 垂直支架（用于面包板），1/4"-20 孔（2 件）	Millipore Sigma	VB01A	定制喷雾器安装组件的机械支撑与稳定
乙腈	Fisher Chemical	240744	用于 DESI 兼容溶剂的配制与优化的有机溶剂
甲酸铵	Thermo Fisher Scientific	401152500	DESI–MSI 前细胞清洗所用等渗甲酸铵洗涤缓冲液的配制
明场显微镜	Fisher Scientific	12575252	DESI–MSI 采集前贴壁细胞的光学成像与观察
C18 色谱柱	Waters	186009259	用于稳定纳米流 DESI 喷雾形成的在线背压生成
铜线	N/A	N/A	喷雾器安装件制作过程中的电气连接与接地
DESI XS 喷雾器	Waters	700014033	用于单细胞 DESI–MSI 实验的大气压 DESI 电离源
环氧树脂	Devcon	20945	定制喷雾器安装组件的机械稳定与固定
FAIMS Pro 电极离子源外壳适配器	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	定制 Orbitrap 兼容 DESI 接口的改造与制作
甲酸	Ward’s Science	470301-120	DESI 喷雾溶剂配制用酸性添加剂
甲醇	Fisher Chemical	A456-4 Optima	DESI 喷雾溶剂配制用有机溶剂
气体调节器	Millipore Sigma	23831-U	DESI 运行过程中氮气鞘气压力的调节
带网格玻璃盖玻片	Ibidi	10817	细胞培养基底及光学图像与质谱图像配准的位置参考
接地线	N/A	N/A	DESI 喷雾器及接口组件的电气接地连接
培养箱	HeraCell	51026282	在受控温度和 CO2 条件下维持哺乳动物细胞培养
LC/MS 级水	Thermo Fisher Scientific	W6500	甲酸铵洗涤缓冲液与 DESI 喷雾溶剂的配制
METASPACE 平台	METASPACE	https://metaspace2020.eu	基于云的质谱成像可视化与空间代谢组学数据分析
改装的 FAIMS 接口	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	用于将 DESI 喷雾器与 Orbitrap 质谱仪耦合的定制接口
电动 XYZ 位移台	Newport Corporation	CONEX-MFACC	DESI–MSI 采集过程中的受控光栅扫描运动
MycoAlert PLUS 支原体检测试剂盒	Lonza	LT07-703	培养细胞中支原体污染的常规监测
纳米液相色谱系统	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	用于 DESI 喷雾生成的纳米流溶剂输送系统
光学面包板	Thorlabs	MB1012	DESI 喷雾器与改装接口组件的机械支撑平台
Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪	Thermo Fisher Scientific	UVPD	用于 DESI–MSI 数据采集的高分辨率 Orbitrap 质谱仪
PEEK 管路	IDEX	1535	纳米液相系统与 DESI 喷雾器之间的溶剂管线连接
青霉素–链霉素	Gibco	15140-122	哺乳动物细胞培养基中的抗生素添加剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	VWR	0780-50L	传代过程中培养细胞的洗涤溶液
RPMI-1640 培养基	Gibco	11875093	用于维持 OVCAR-8 细胞的哺乳动物细胞培养基
位移台控制软件	Lasken Group	版本 6	光栅扫描、位移台运动及成像采集参数的软件控制
不锈钢管路	MicroGroup	316H16H	定制加工的离子传输管路（外径 1/16"，内径 0.033"），用于与 Orbitrap 接口集成
250 µL 注射器	Hamilton	1725LTN250UL	溶剂装载与纳米流溶剂输送
合成胎牛血清（FBS）	HyClone	SH3006603	完全哺乳动物细胞培养基配制用血清添加剂
TC20 自动细胞计数仪	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	盖玻片接种前培养细胞的自动计数
组织培养皿，100 mm	Fisher Scientific	FB012924	贴壁 OVCAR-8 细胞培养的扩增与维持
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	传代过程中贴壁细胞的酶解解离
紫外固化树脂	Prime Dental	6.03	定制 DESI 喷雾器安装组件的制作与稳定
Xcalibur 软件	Thermo Fisher Scientific	4.7	仪器控制、Orbitrap 方法设置及质谱数据采集