一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于可验证地鉴定与长链非编码 RNA 直接相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

摘要

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于鉴定长链非编码 RNA 与蛋白质的直接相互作用。

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）已被证实是调控多种生物学过程的重要分子。然而，大多数lncRNA功能的分子机制仍不清楚。鉴定与其相互作用的蛋白质，特别是RNA结合蛋白（RBPs），是阐明lncRNA功能的关键策略。在现有的多种方法中，结合质谱分析的RNA结合蛋白全面鉴定技术（ChIRP）因其探针设计简单、实验流程清晰而被广泛应用。传统的ChIRP依赖于多聚甲醛（PFA）交联，这种方法既能捕获RNA与蛋白质之间的直接相互作用，也能保留由中介因子介导的间接相互作用。相比之下，紫外光（UV）交联结合严格的洗涤条件更倾向于保留RNA与蛋白质之间的直接相互作用。本研究以lncRNA Tug1 为模型，在培养细胞中比较了ChIRP体系下UV交联与PFA交联的效果，结果表明基于UV的ChIRP能更有效地富集直接的lncRNA-蛋白质相互作用。随后，该基于UV的实验流程被拓展至小鼠睾丸组织，通过在UV交联前将组织解离为单细胞悬液，实现了在天然组织环境中鉴定 Tug1 结合蛋白的目标。与细胞系来源的相互作用组比较发现，既有共有的相互作用蛋白，也存在组织特异性的结合蛋白。其中两个共有的直接相互作用通过增强型交联免疫沉淀（eCLIP）得到了独立验证。这种基于UV的ChIRP方法被命名为cPDiRT（capturing proteins directly interacting with an RNA target，即捕获与RNA靶标直接相互作用的蛋白质）。综上所述，cPDiRT能够在培养细胞和天然组织中实现lncRNA结合蛋白的鉴定。组织解离与UV交联的结合为在多种器官系统中研究直接的lncRNA-蛋白质相互作用提供了一种广泛适用的策略。

引言

近期的高通量转录组学研究已发现数千种长链非编码RNA（lncRNA），这些RNA参与了从染色质组织到细胞信号传导等多种生物学过程^1,2。尽管lncRNA广泛表达且具有重要功能，但大多数lncRNA的分子作用机制仍不清楚。其中一个主要障碍是难以鉴定其直接相互作用的蛋白质伙伴，特别是RNA结合蛋白（RBPs）^3,4,5。

目前以RNA为中心的方法主要依赖化学交联技术，该技术可捕获直接和间接的RNA-蛋白质相互作用。因此，这类方法更适合于全局相互作用组的绘制，而非真实直接接触的鉴定⁶。染色质分离及质谱分析（ChIRP-MS）是一种广泛用于绘制长链非编码RNA与RNA结合蛋白（lncRNA-RBP）相互作用的技术，因其探针设计简单且实验流程高效而被广泛应用^7,8。传统的ChIRP-MS采用多聚甲醛（PFA）交联，该方法可捕获直接的RNA-蛋白质接触，以及由中介因子介导的间接关联^9,10。

相比之下，254 nm 的紫外交联具有关键优势。它仅在 RNA 与蛋白质处于近乎零距离接触时（通常<1 Å）才能共价连接二者¹¹。该过程将氢键转化为稳定的共价键，并允许使用高盐强度的严格洗脱条件，从而去除非共价结合的间接相互作用分子。因此，基于紫外的方法在检测直接的 RNA-蛋白质相互作用方面比化学交联方法具有更高的特异性^12,13。然而，基于紫外的方法在组织来源的长链非编码 RNA 相互作用组研究中仍应用不足，主要原因是人们对交联效率以及紫外光穿透能力有限的担忧。

为了在生理相关背景下研究长链非编码RNA（lncRNA）与蛋白质的直接相互作用，本研究选择lncRNA Tug1 作为模型系统。Tug1 因其显著的基因敲除表型以及在睾丸中的高度富集，是验证适用于组织样本的直接相互作用研究流程的理想基准。Tug1 基因的遗传缺失会导致完全的雄性不育、生精功能受损以及精子形态异常¹⁴。此外，Tug1 在高脂饮食小鼠中支持支持细胞（Sertoli细胞）功能和血睾屏障的完整性¹⁵。尽管这些表型已被充分证实，但在睾丸这一表达大量RNA结合蛋白（RBP）且这些蛋白近期已被实验性图谱化¹⁶的器官中，介导Tug1 功能的直接蛋白质互作伙伴仍不清楚。这一知识空白在很大程度上反映出，目前大多数lncRNA-蛋白质相互作用的检测方法均是为培养细胞体系所开发的。

为解决这一局限性，对 ChIRP 技术框架进行了改进，用紫外线交联替代 PFA 交联，以捕获直接与 Tug1 相互作用的蛋白质。候选相互作用通过增强型交联免疫沉淀联合深度测序（eCLIP-seq）进行独立验证¹⁷。该工作流程进一步拓展至组织应用，即在紫外线交联前将新鲜的小鼠睾丸组织解离为单细胞。这一优化后的方法被命名为 cPDiRT（捕获直接与 RNA 靶标相互作用的蛋白质）。

在小鼠睾丸中应用cPDiRT技术对Tug1实现了在天然组织环境下的直接相互作用图谱绘制。在培养细胞中进行的平行实验提供了基于PFA和基于UV的相互作用谱的并行比较。结合独立的eCLIP验证，该方法获得了一组高可信度的分子互作伙伴，可能参与Tug1在精子发生过程中的功能。本文所述方案能够在培养细胞和天然组织中捕获与目标长链非编码RNA直接相互作用的蛋白质。通过界定Tug1在睾丸中的直接互作组，该方法推动了对一种对生育力至关重要的长链非编码RNA的机制研究，并为在生殖组织及其他复杂组织中研究长链非编码RNA-蛋白质相互作用提供了可推广的技术平台。

方案

所有溶液均使用无核酸酶、无蛋白酶的超纯水和试剂配制。所有试剂和设备均列于材料表中。

所有动物实验均经南京医科大学动物伦理委员会批准（批准号：IACUC-1812003-4），并依照 实验动物护理和使用的指南 （美国国家研究委员会，第8版）。将4周龄雄性C57BL/6小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，自由摄食和饮水。遵循经批准的机构实验方案，采用二氧化碳吸入法实施安乐死后行颈椎脱位，尽量减少动物痛苦，并使用达到统计学显著性所需的最少动物数量。 

1. 准备缓冲液

1. 制备细胞裂解缓冲液
   1. 制备含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)、10 mM EDTA 和 1% SDS 的细胞裂解缓冲液。
   2. 使用前立即加入 1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物和特异性 RNase 抑制剂。
      注意：SDS 对皮肤和眼睛具有刺激性，避免吸入其粉尘或气溶胶。PMSF 高度有毒，为胆碱酯酶抑制剂，在水溶液中不稳定，需在使用前新鲜配制。操作这些试剂时应佩戴手套和护目镜，并在通风橱中操作 PMSF。
2. 制备杂交缓冲液
   1. 制备含有 750 mM NaCl、1% SDS、50 mM Tris-HCl (pH 7.0)、1 mM EDTA 和 15% 甲酰胺的杂交缓冲液。
   2. 使用前立即加入 1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物和特异性 RNase 抑制剂。
      注意： 甲酰胺应于 4 °C 避光保存。
      注意：甲酰胺为致畸剂，具有生殖毒性。操作甲酰胺时应在通风橱中进行，并佩戴手套、实验服和护目镜，避免吸入和皮肤接触。
3. 制备洗涤缓冲液
   1. 制备含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)、1 M NaCl、1 mM EDTA、1% NP-40、0.1% SDS 和 0.5% 脱氧胆酸钠的洗涤缓冲液。
   2. 储存期间应避免光照。
4. 制备蛋白酶 K (PK) 缓冲液
   1. 制备含有 100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.0)、1 mM EDTA 和 0.5% SDS 的 PK 缓冲液。
   2. 使用前立即加入蛋白酶 K，使其终浓度为 5%。

2. 设计并制备探针

1. 设计反义探针
   1. 使用 singlemoleculefish.com 提供的在线探针设计工具设计反义寡核苷酸探针¹⁸。
2. 获取生物素标记的探针
   1. 订购带有 3'-BiotinTEG 修饰的反义 DNA 探针。
3. 制备探针混合液
   1. 将每种探针单独稀释至 100 µM。
   2. 取等体积的所有探针混合，制备探针混合液。保持最终寡核苷酸总浓度为 100 µM。
   3. 将探针混合液储存于 -20 °C。
      注意：推荐的探针设计参数如下：(i) 每 100 bp 目标 RNA 设计一个探针，(ii) 目标 GC 含量为 45%，(iii) 探针长度为 20 nt，(iv) 探针间间隔为 60–80 nt。
      注意：若 RNA 长度超过探针设计工具允许的上限，应在设计前将序列分割为较小片段。排除重复区域以及具有广泛序列同源性的区域。

3. 进行细胞收获、组织解离和紫外交联

1. 准备无紫外照射对照
   1. 与实验样本平行制备对照样本。
   2. 对照样本省略紫外交联步骤。
   3. 对两组样本进行相同的所有后续操作，包括超声处理、RNA-蛋白质下拉、RNA提取和蛋白质提取。
      注意：使用无紫外照射对照以区分依赖紫外照射的RNA-蛋白质相互作用与非特异性背景结合。
2. 收集细胞并进行紫外交联
   1. 洗涤培养细胞
      1. 用PBS洗涤细胞三次，以去除残留的培养基。
   2. 交联细胞
      1. 将3 mL PBS均匀铺加到15 cm培养皿上。
      2. 在254 nm紫外交联仪中以4000 mJ/cm²剂量照射细胞。
   3. 收集交联后的细胞
      1. 交联后用PBS收集细胞。
      2. 离心悬浮液并弃去上清液。
      3. 称量沉淀物，确认每个样本的沉淀质量至少为500 mg。
3. 解离睾丸组织并进行紫外交联
   1. 准备睾丸
      1. 剥离睾丸包膜。
      2. 用DMEM洗涤组织两次。
   2. 进行胶原酶消化
      1. 将组织在含有1 mg/mL IV型胶原酶的DMEM中于37 °C孵育5–15分钟。
      2. 继续消化直至曲细精管释放。
         注意：消化时间不得超过15分钟。
   3. 洗涤曲细精管
      1. 在4 °C下以1000 × g离心悬浮液1分钟。
      2. 移除上清液。
      3. 用5–10 mL DMEM洗涤沉淀。
      4. 在相同条件下再次离心。
   4. 进行胰蛋白酶消化
      1. 将沉淀重悬于含1 mg/mL DNase I的0.25%胰蛋白酶溶液中。
      2. 在37 °C孵育5–15分钟。
         注意：消化时间不得超过15分钟。
   5. 终止酶消化反应
      1. 加入等体积的含10% FBS的DMEM。
   6. 制备单细胞悬液
      1. 将悬液通过70 µm细胞筛过滤。
   7. 洗涤细胞
      1. 在4 °C下以2000 × g离心细胞5分钟。
      2. 弃去上清液。
      3. 用5–10 mL PBS洗涤沉淀。
      4. 在相同条件下再次离心。
   8. 对睾丸细胞进行紫外交联
      1. 将单细胞悬液重悬于PBS中。
      2. 将悬液均匀铺加到15 cm培养皿上。
      3. 在254 nm紫外交联仪中以4000 mJ/cm²剂量照射细胞。
   9. 收集交联后的细胞
      1. 对于无紫外照射对照，省略照射步骤。
      2. 用PBS收集细胞。
      3. 离心悬浮液并弃去上清液。
      4. 称量沉淀物，确认每个样本的沉淀质量至少为500 mg。
         注意：获得约500 mg细胞沉淀所需的实验小鼠数量取决于小鼠年龄和组织产量。本研究中使用了约10–12只四周龄小鼠。

4. 进行超声处理

1. 制备裂解液
   1. 按照每100 mg细胞沉淀加入1 mL裂解缓冲液的比例，将细胞沉淀重悬于细胞裂解缓冲液中。
   2. 充分混匀，获得均一的悬浮液。
2. 超声处理样品
   1. 使用水浴超声仪或聚焦超声仪对裂解液进行超声处理。
   2. 持续超声处理直至裂解液在视觉上变得澄清。
      注意：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化情况。继续超声处理，直至大部分DNA片段大小在1 kb至2 kb之间。

5. 进行 RNA-蛋白质下拉实验

1. 收集输入样品
   1. 取出部分裂解液作为输入对照。
   2. 保留约 10 µL 用于 RNA 分析，另取 10 µL 用于蛋白质分析。
   3. 在杂交和洗涤过程中，将输入样品维持在 37 °C。
2. 预清除裂解液
   1. 向每个样品中加入 30 µL 预先洗涤的磁珠。
   2. 在杂交炉中于 37 °C 轻柔混匀孵育 30 分钟。
      注意：使用前需洗涤磁珠。将磁珠分装后置于磁力架上 1 分钟或直至溶液澄清，彻底移除保存液。用 500 µL 细胞裂解缓冲液洗涤磁珠两次。
3. 去除预清除磁珠
   1. 将样品置于磁力架上。
   2. 将上清液转移至新管中。
   3. 重复转移一次，以确保完全去除残留磁珠。
4. 杂交探针
   1. 向每个样品中加入两倍体积的杂交缓冲液。
   2. 按每 1 mL 裂解液加入 1 µL 100 µM 探针原液的比例加入 探针（补充表 1）。
5. 孵育杂交反应
   1. 在杂交炉中于 37 °C 以翻转混匀方式孵育 12–16 小时。
6. 准备捕获磁珠
   1. 在杂交结束前立即用细胞裂解缓冲液洗涤 100 µL 磁珠三次。
   2. 最后一次洗涤后彻底去除残余缓冲液。
7. 捕获探针结合的复合物
   1. 短暂离心杂交反应液。
   2. 将洗涤后的磁珠重悬于 1 mL 杂交后的样品中。
8. 使复合物结合到磁珠
   1. 将磁珠悬液转移回原管。
   2. 在 37 °C 混匀孵育 30–40 分钟。
9. 回收磁珠
   1. 短暂离心样品。
   2. 将管子置于磁力架上 1–2 分钟或直至溶液澄清。
   3. 弃去上清液。
   4. 用移液器吸头去除残余液体。
      注意：去除液体时避免扰动磁珠沉淀。
10. 洗涤捕获的复合物
    1. 加入 1 mL 洗涤缓冲液。
    2. 在 37 °C 持续混匀洗涤 5 分钟。
    3. 重复洗涤步骤五次。
       注意：洗涤缓冲液含有 1 M NaCl，可破坏非共价的蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA 相互作用，同时保留共价的紫外线诱导交联。这些严格条件可去除间接相互作用分子和非特异性背景，从而富集直接的蛋白质互作伙伴¹⁹。
11. 保留材料用于 RNA 分析
    1. 将洗涤后磁珠的 1%–10% 转移至新管中用于 RNA 分析。
    2. 立即使用剩余磁珠进行蛋白质提取，或将其储存于 -80 °C。
       注意：如需暂停实验，可将磁珠样品储存于 -80 °C，待后续进行蛋白质提取。
12. 洗脱蛋白质
    1. 向磁珠中加入 SDS 样品缓冲液。
    2. 在 95 °C 煮沸 30 分钟以洗脱蛋白质并逆转交联。
    3. 进行质谱分析。

6. 提取 RNA

1. 消化蛋白质
   1. 用 100 µL PK 缓冲液重悬磁珠结合的 RNA 样品。
   2. 使用 PK 缓冲液将 RNA 上样样品调整至终体积为 100 µL。
2. 与蛋白酶 K 孵育
   1. 在 50 °C 下孵育样品 45 分钟，并持续混匀。
3. 灭活蛋白酶 K
   1. 在 95 °C 下加热样品 10 分钟。
4. 加入 TRIzol 试剂
   1. 向每个样品中加入 500 µL TRIzol 试剂。
   2. 充分涡旋振荡。
   3. 在室温下孵育 5 分钟。
      注意：TRIzol 试剂含有苯酚和硫氰酸胍。操作时应在化学通风橱中进行，并佩戴手套、实验服和护目镜。避免吸入和皮肤接触。若发生皮肤接触，应立即用肥皂和水清洗。
5. 进行相分离
   1. 向每个样品中加入 100 µL 氯仿。
   2. 充分涡旋振荡。
   3. 在室温下孵育 5 分钟。
6. 回收水相
   1. 在 4 °C 下离心样品 15 分钟。
   2. 将上层水相转移至新管中。
7. 将 RNA 结合至纯化柱
   1. 向水相中加入等体积的 100% 乙醇。
   2. 充分混匀。
   3. 将样品上样至 RNA 纯化柱。
8. 纯化 RNA
   1. 根据制造商说明书进行 RNA 清洁步骤。
   2. 用 30 µL 无核酸酶水洗脱 RNA。
9. 通过 qRT-PCR 验证 RNA 富集
   1. 每反应使用 1 µL 洗脱的 RNA 进行定量反转录 PCR（qRT-PCR）。
   2. 评估目标 RNA 相对于对照组的富集程度。

7. 进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析

1. 通过 SDS-PAGE 分离蛋白质
   1. 将 步骤 5.12 中获得的蛋白质与 4× LDS 上样缓冲液混合。
   2. 在 4%–12% Bis-Tris 凝胶上分离蛋白质。
   3. 使用银染试剂盒对凝胶进行染色。
   4. 将整个蛋白质条带作为一个单一的条带切下。
2. 切取凝胶小块
   1. 使用洁净的手术刀切下蛋白质条带。
   2. 尽量减少多余的凝胶量。
   3. 将凝胶切成约 1 mm³ 的小块。
   4. 将凝胶小块转移至 0.5 mL 离心管中。
3. 脱色凝胶小块
   1. 加入 100 µL 脱色液。
   2. 涡旋振荡 10 分钟。
   3. 在 14,000 × g 条件下离心 1 分钟。
   4. 移除上清液。
   5. 重复脱色步骤，直至凝胶小块变得透明。
4. 还原蛋白质
   1. 加入 100 µL 还原液。
   2. 在 56 °C 下孵育 30 分钟。
   3. 将样品冷却至室温。
   4. 短暂离心并移除上清液。
5. 烷基化蛋白质
   1. 加入 100 µL 烷基化液。
   2. 在避光条件下于室温孵育 20 分钟。
   3. 移除上清液。
   4. 用 100 µL 消化缓冲液洗涤凝胶小块 5 分钟。
6. 消化蛋白质
   1. 加入足量的胰蛋白酶溶液，完全覆盖凝胶小块。
   2. 在 37 °C 下孵育 16–18 小时。
7. 提取肽段
   1. 加入 30 µL 提取液。
   2. 超声处理 15 分钟或涡旋振荡 30 分钟。
   3. 在 14,000 × g 条件下离心 1 分钟。
   4. 将上清液转移至新的离心管中。
   5. 重复提取步骤两次。
   6. 合并所有提取液。
   7. 在真空浓缩仪中干燥合并的提取液，约 1 小时。
8. 使用 StageTip 纯化肽段
   1. 将干燥的肽段重悬于 20 µL 0.1% 甲酸（FA）中。
   2. 将样品加载至 C18 StageTip 上。
   3. 在 1,000 × g 条件下离心 2 分钟。
   4. 用 20 µL 0.1% 甲酸洗涤 StageTip。
   5. 用 20 µL 60% 乙腈/0.1% 甲酸洗脱肽段至 LC-MS 样品瓶中。
   6. 干燥洗脱液。
   7. 将肽段重悬于 10 µL 0.1% 甲酸中。
      注意：如有需要，可在此暂停实验流程。在进行 LC-MS/MS 分析前，将纯化的肽段储存于 -80 °C。
9. 获取 LC-MS/MS 数据
   1. 将肽段重悬于 0.1% 甲酸中。
   2. 在 75 µm × 250 mm C18 分析柱上，以 300 nL/min 的流速分离肽段。
   3. 采用以下溶剂 B 梯度（乙腈中含 0.1% 甲酸）：
      0–40 分钟：2%–25% B
      40–48 分钟：25%–40% B
      50–57 分钟：40%–99% B
      保持 99% B 3 分钟
   4. 将质谱仪设置为数据依赖性采集模式。
   5. 在 m/z 350–1200 范围内采集全扫描 MS 谱图，分辨率为 70,000。
   6. 以 17,500 分辨率连续采集 15 次高能碰撞解离（HCD）MS/MS 谱图。
   7. 每次扫描记录一个微扫描。
   8. 设定动态排除时间为 30 秒。
10. 处理质谱数据
    1. 使用 MaxQuant（v2.1.0.0）处理原始数据。
    2. 在从 UniProt 下载的小鼠蛋白质序列数据库中进行谱图搜索。
    3. 指定胰蛋白酶为消化酶。
    4. 允许最多两个漏切位点。
    5. 设定甲硫氨酸氧化为可变修饰。
    6. 设定半胱氨酸的羧甲基化为固定修饰。
    7. 设定前体离子和碎片离子的质量容差分别为 15 ppm 和 20 ppm。
    8. 在肽段和蛋白质水平上均将错误发现率控制在 1%。
    9. 采用基于 iBAQ 的非标记定量方法估计蛋白质丰度。

8. 进行基因本体富集分析

1. 分析功能富集
   1. 使用 clusterProfiler R 软件包（v4.6.0）进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析。
   2. 以 GO 数据库（v2024-09-20）作为参考注释来源。
   3. 采用 Benjamini-Hochberg 方法对多重检验进行校正。
   4. 将统计学显著性定义为经校正的 P 值（FDR）< 0.05。

9. 进行 eCLIP-seq 验证

1. 制备eCLIP样品
   1. 按照先前所述方法进行增强型交联免疫沉淀（eCLIP）¹⁷。
   2. 制备经紫外交联的细胞样品，用于PABPC1和CCT3的免疫沉淀。
   3. 使用eCLIP裂解缓冲液裂解样品。
2. 免疫沉淀RNA-蛋白质复合物
   1. 向每个样品中加入10 µg抗体。
   2. 在磁珠上捕获RNA-蛋白质复合物。
   3. 在免疫沉淀前收集输入样品。
3. 制备RNA文库
   1. 去磷酸化与蛋白质结合的RNA。
   2. 将3' RNA接头连接至回收的RNA。
   3. 在严格条件下洗涤免疫沉淀样品和输入样品。
   4. 通过煮沸磁珠洗脱复合物。
   5. 在4%–12% Bis-Tris梯度凝胶上分离样品。
   6. 将分离的复合物转移至硝酸纤维素膜。
4. 回收RNA
   1. 切下大小匹配的膜区域。
   2. 使用尿素和蛋白酶K消化蛋白质。
   3. 从膜上回收RNA。
5. 构建测序文库
   1. 将回收的RNA逆转录为cDNA。
   2. 使用外切酶I和虾碱性磷酸酶混合物纯化cDNA。
   3. 使用T4 RNA连接酶将DNA接头连接至cDNA的3'端。
   4. 使用高保真DNA聚合酶扩增文库。
   5. 在3%低熔点琼脂糖凝胶上分离扩增后的文库。
   6. 使用凝胶回收试剂盒纯化经大小筛选的文库。
   7. 在Illumina平台上对文库进行测序。
6. 分析eCLIP-seq数据
   1. 使用ENCODE eCLIP分析流程分析测序数据²⁰。
   2. 使用cutadapt（v1.14）去除接头序列和3'接头二聚体。
   3. 使用STAR（v2.7.6a）将reads比对至UCSC重复元件。
   4. 去除比对到重复元件的reads。
   5. 将剩余reads比对至mm10参考基因组（GENCODE vM23）。
   6. 去除PCR重复序列。
   7. 使用CLIPPER鉴定富集的结合位点。
   8. 将富集倍数≥8且调整后P值≤0.001的峰定义为显著峰。
   9. 使用不可重复发现率（IDR）阈值为0.01的标准鉴定可重复峰。

结果

为了鉴定与 Tug1 结合的蛋白质，将紫外交联步骤引入 ChIRP 实验流程，建立了一种名为 cPDiRT 的新方法（图 1）。首先在 GC2 细胞中进行常规 ChIRP 实验，以富集与 Tug1 相互作用的蛋白质（图 2A、B）。质谱分析结果显示，相较于阴性对照，有超过 190 种蛋白质显著富集（图 2C；补充表 2）。相比之下，在优化的紫外剂量（4000 mJ/cm²）下进行的 cPDiRT-MS 鉴定出一组更具选择性的蛋白质（图 2C；补充表 2），其中超过三分之二的蛋白质与常规 ChIRP-MS 检测到的结果重叠（图 2C）。在初步优化实验中，紫外交联不足会导致 RNA 富集减...

讨论

cPDiRT 是一种基于 ChIRP 的改进型实验方案，通过使用紫外（UV）交联替代甲醛（PFA）交联，以特异性捕获长链非编码 RNA（lncRNA）与蛋白质之间的直接相互作用。通过将新鲜睾丸组织经酶解离为单细胞后进行紫外交联，该方法将直接相互作用的图谱分析从培养的细胞系拓展至天然组织。在培养细胞中进行的平行实验实现了基于 PFA 与基于 UV 方法的并行比较，且由 UV 获得的相互作用通过 eCLIP-seq 技术得到了独立验证。结果表明，在组织来源样本的 ChIRP 工作流程中，紫外交联可成功整合并保持高特异性。

由于存在组织渗透困难、分子间交联假象以及间接相互作用导致的背景信号升高等问题，很少有研究将基于PFA的RNA中心方法（如ChIRP）应用于组织样本。这些局限性限制了基于组织的lncRNA相互作用组作图的广泛应用，也促使了cPDiRT的开发，作为适用于组织水平研究的更特异的替代方法。

cPDiRT 的一个关键特征是能够在接近生理条件下区分直接相互作用与间接相互作用。传统的基于 PFA 的方法会稳定大型大分子复合物，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	Gibco	25200056	用于组织解离和单细胞悬液制备
100% 乙醇	Sigma-Aldrich	459844	用于RNA纯化
亲和素反转录酶（AffinityScript Reverse Transcriptase）	Agilent	600107	用于eCLIP cDNA合成
抗CCT3抗体	Abcam	Ab225878	eCLIP实验用抗体
抗PABPC1抗体	Abcam	Ab312314	eCLIP实验用抗体
氯仿	Sigma-Aldrich	C2432	用于RNA提取
IV型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138	用于睾丸组织的酶解解离
去磷酸化试剂（T4 PNK）	New England Biolabs	M0201S	用于eCLIP RNA去磷酸化
DMEM高糖培养基	Gibco	11965092	用于细胞培养和组织解离缓冲液
Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1磁珠	Thermo Fisher Scientific	65001	用于捕获生物素化探针-RNA-蛋白质复合物
DynaMag-15磁力架	Thermo Fisher Scientific	12301D	用于磁珠分离
DynaMag-2磁力架	Thermo Fisher Scientific	12321D	用于磁珠分离
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	用于裂解缓冲液和洗涤缓冲液中螯合二价阳离子
外切核酸酶I	New England Biolabs	M0293S	用于eCLIP cDNA纯化
胎牛血清（FBS）	Gibco	10099141C	用于终止胰蛋白酶消化
甲酰胺	Thermo Fisher Scientific	AM9342	用于杂交缓冲液配制
杂交炉	TUOHE	LF-I	用于探针杂交和磁珠洗涤
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414	用于eCLIP文库片段大小选择
MinElute凝胶回收试剂盒	Qiagen	28604	用于eCLIP文库片段大小选择
miRNeasy Mini试剂盒	Qiagen	217004	用于RNA纯化
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	用于配制高盐洗涤缓冲液
硝酸纤维素膜	GE Healthcare / Amersham	10600002	用于eCLIP Western印迹转膜
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	用作洗涤缓冲液中的去垢剂
无核酸酶和无蛋白酶水	Thermo Fisher Scientific	10977035	用于配制无核酸酶溶液
NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	用于eCLIP片段大小选择
NuPAGE Bis-Tris预制胶	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	用于SDS-PAGE蛋白质分离
PBS（pH 7.4）	Thermo Fisher Scientific	10010023	用于细胞洗涤和重悬
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Sigma-Aldrich	P7626	细胞裂解缓冲液中的丝氨酸蛋白酶抑制剂；使用前新鲜添加
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	4693132001	广谱蛋白酶抑制剂，用于细胞裂解缓冲液；使用前新鲜添加
蛋白酶K	Sigma-Aldrich	P4850	用于RNA提取过程中的蛋白质消化
qRT-PCR预混液	Thermo Fisher Scientific	11704044	用于定量RT-PCR以确认RNA富集
无RNase/无蛋白酶的DNase I溶液	Thermo Fisher Scientific	EN0521	用于组织解离
RNeasy Mini试剂盒	Qiagen	74104	用于RNA纯化
SDS-PAGE上样缓冲液	Beyotime	P0286	用于蛋白质样品制备
虾碱性磷酸酶	New England Biolabs	M0371S	用于eCLIP cDNA纯化
银染试剂盒	Beyotime	P00175	用于SDS-PAGE凝胶中蛋白质的可视化
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750	用作洗涤缓冲液中的去垢剂
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	L3771	用于细胞裂解和蛋白质变性
Superase-in RNase抑制剂	Thermo Fisher Scientific	AM2694	特异性RNase抑制剂；使用前新鲜添加
T4 RNA连接酶	New England Biolabs	M0204	用于eCLIP接头连接
Tris–HCl（pH 7.0）	Sigma-Aldrich	T5941	用于配制裂解、杂交和洗涤缓冲液
TRIzol试剂	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	用于RNA提取
超声波细胞破碎仪	ATPIO	ATPIO-650D	用于细胞裂解和DNA片段化
紫外交联仪	Analytik Jena	UVP CL-1000	用于RNA-蛋白质相互作用的紫外交联
尿素	Sigma-Aldrich	U5128	用于膜上eCLIP蛋白质的降解